materiaalit ja menetelmät
saatuaan kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen potilailta tutkimme suun kautta annetun klonidiinin vakaan tilan farmakokinetiikkaa 17 raskaana olevan naisen plasmassa, jotka saivat klonidiinia raskauden keskivaiheilla (22-26 raskausviikolla) tai raskauden loppuvaiheessa (34-38 raskausviikolla). Kuusi näistä naisista osallistui synnytyksen yhteydessä äidin ja napanuoran (valtimo ja laskimo) plasmanäytteiden keräykseen klonidiinipitoisuuksien mittaamiseksi. Raskausiän perusteena käytettiin viimeisiä kuukautisia tai varhaista ultraäänitutkimusta.
Aihevalinta. Tutkimuksen hyväksyi University of Washington Investigational Review Board. Tutkimukseen voitiin osallistua, jos he olivat raskaana, 18-vuotiaita, hematokriitti oli ≥28% ja he saivat suun kautta klonidiinia äidin verenpainetaudin hoitoon.
Annostusohjelma. Suun kautta otettua klonidiinihoitoa ei muutettu tutkimustarkoituksiin. Annokset vaihtelivat 0, 15-0, 30 mg vuorokaudessa jaettuina annoksina. Farmakokineettisen tutkimuksen kesto riippui koehenkilön annosvälistä, joka vaihteli 6-12 tunnin välillä. kolmen päivän ajan ennen tutkimusta annettiin samasta valmistuserästä peräisin olevia suun kautta otettavia klonidiinitabletteja. Tutkittavat merkitsivät kunkin annoksen ajankohdan tutkimuskalenteriin. Koehenkilöt ottivat aamuisen klonidiiniannoksensa 30 minuutin sisällä kello 8.00. Seuraavat annokset otettiin 30 minuutin kuluessa suunnitellusta annostelusta. Farmakokineettisen tutkimuksen aamuna koehenkilöitä pyydettiin paastoamaan kirkkaita nesteitä lukuun ottamatta 5 tuntia ennen klonidiinin antamista, kunnes 1 tunti annoksen jälkeen.
Näytekokoelma. Sarjallisia plasmanäytteitä kerättiin seuraavilla kerroilla: 0, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6, 8, 10, ja 12 h postdosing, tai lyhennetään vastaamaan koehenkilön annosväli. Virtsasta otettiin yksi annosväli klonidiinin munuaispuhdistuman ja kreatiniinipuhdistuman määrittämiseksi. Äidin ja napanuoran (valtimo ja laskimo) plasmanäytteet kerättiin toimituksen yhteydessä klonidiinipitoisuuksien kvantifioimiseksi. Kaikki näytteet säilytettiin -80°C: ssa näytteiden analysointiin asti.
Klonidiinipitoisuudet. Plasman klonidiinipitoisuudet kvantifioitiin validoidulla nestekromatografia-massaspektrometrialla (LC/MS). Lyhyesti sanottuna 250 µl plasmanäytteitä sekoitettiin 500 pg:n sisäisen standardin (klonidiini-d4) kanssa 500 µl: aan natriumkarbonaattia (0, 1 M) (pH = 9, 3) ja 3 ml: aan heptaani/isoamyylialkoholia (98, 5: 1, 5). Standardit laadittiin lisäämällä nollaplasmaa 0, 12.5, 25, 50, 100, 200, 250, 375, 500, ja 750 pg klonidiinia. Näytteitä ravistettiin vaakasuorassa ravistimessa 15 minuutin ajan huoneenlämmössä. Sentrifugoinnin (1500g 10 min) jälkeen näytteet jäädytettiin kuivajäälle ja orgaaninen kerros dekantoitiin puhtaaseen viljelyputkeen. Orgaaniseen kerrokseen lisättiin kaksi millilitraa rikkihappoa (0,05 M) ja sitä ravistettiin uudelleen 15 minuutin ajan. Sentrifugoinnin (1500g 10 min) jälkeen näytteet jäädytettiin kuivajäälle ja orgaaninen kerros hävitettiin. 200 µl: n määräosa 29.Vesipitoiseen kerrokseen lisättiin 29% ammoniumhydroksidia sekä 3 ml heptaani / isoamyylialkoholia (98.5:1.5) ja sitä ravistettiin 15 minuutin ajan. Sentrifugoinnin (1500g 10 min) jälkeen näytteet jäädytettiin kuivajäälle ja orgaaninen kerros dekantoitiin puhtaaseen viljelyputkeen. Orgaaninen kerros haihdutettiin typpivirran alla 40°C:ssa.jäännös liuotettiin 75 µl muurahaishappoa (12 mM)/metanolia (60: 40), josta 10 µl ruiskutettiin LC/MS-järjestelmään.
250 µl: n Virtsanäytteisiin sekoitettiin 250 µl muurahaishappoa (12 mM) ja 50 ng sisäistä standardia (klonidiini-d4). Standardit valmistettiin terästämällä tyhjän virtsan kanssa 0, 1.25, 2.5, 6.25, 12.5, 18.75, 25 ng klonidiinia. Näytteet pyörrettiin ja 1 µl ruiskutettiin LC/MS: ään.
LC / MS-järjestelmä oli Agilent 1100 MSD (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), joka koostui binääripumpusta, autosamplerista, kolonniosastosta ja massaspektrometristä. Korkean suorituskyvyn nestekromatografiakolonni oli Phenomenex Synergi Polar RP80A, 250 mm × 2.0 mm, 4 µm (Phenomenex, Torrance, CA). Kolonni säilytettiin 40°C: n lämpötilassa.liikkuvia faasikomponentteja olivat 12 mM muurahaishappo (A) ja metanoli (B), joiden alkuvirtausnopeus oli 0,25 ml/min. Alkuperäinen liikkuva vaihe säilyi 1 min, ja se koostui 40% b plasmanäytteistä ja 35% B virtsanäytteistä. B: n osuus nousi lineaarisesti seuraavan 4 minuutin aikana 90%: iin plasmassa ja 60%: iin virtsassa, minkä jälkeen se pysyi vakiona 1 minuutin ajan siten, että virtsan ja plasman virtaus kasvoi lineaarisesti 0, 3 ml: aan/min. Paluugradientin osalta B: n prosenttiosuus pieneni lineaarisesti 1 minuutin aikana 40%: iin (plasma) tai 35%: iin (virtsa), minkä jälkeen se pysyi vakiona. Virtausnopeus pidettiin 0, 3 ml / min 1 minuutin ajan, minkä jälkeen se laski lineaarisesti 1 minuutin aikana 0, 25 ml/min ja pysyi sitten vakiona. Juoksuaika oli yhteensä 12,5 min. Sekä plasma-että virtsakokeissa massaspektrometriä käytettiin positiivisessa elektrospray-tilassa ja se asetettiin m/z 230: n (klonidiini) ja m/z 236: n (klonidiini-d4) selektiiviseen ioniseurantaan siten, että kuhunkin ioniin sovelletaan 289 msek: n viipymisaikaa.
Farmakokineettiset Parametrit. Vakaan tilan farmakokineettiset parametrit määritettiin tavanomaisilla ei-kompartmentaalisilla menetelmillä. Plasman klonidiinipitoisuus-aikakäyrän alle jäävä pinta-ala yhden annosvälin aikana (AUCt) laskettiin lineaarisen puolisuunnikkaan säännön mukaisesti. Näennäinen oraalinen puhdistuma (CL/F) laskettiin Cl/F = annos/AUCt-arvolla. Klonidiinin munuaispuhdistuma (Klrenaali) laskettiin kaavalla CLrenal = ae,τ/auct, jossa ae,τ = klonidiinin määrä, joka erittyi muuttumattomana virtsaan yhden annosvälin aikana. Kreatiniinipuhdistuma laskettiin kaavalla CrCl = (VolumeUrine × CreatinineUrine) / (CreatinineSerum× τ). Klonidiinin munuaispuhdistuma glomerulusfiltraationopeudella (GFR) laskettuna Klrenaalipitoisuudella GFR = Klrenaali – fu × CrCl, jossa sitoutumattoman fraktion plasmassa (fu) oletettiin olevan 0, 80 (Hulter et al., 1979). Kaikilla koehenkilöillämme suhteellisen lyhyt annosväli ei mahdollistanut klonidiinin puoliintumisajan tarkkaa arvioimista, jonka on aiemmin raportoitu olevan 11, 1 ± 3, 3 ja 10, 8 ± 2, 2 h ei-raskaana olevilla terveillä aikuisilla (Cunningham ym., 1994; Fujimura ym., 1994).
tilastot. Klonidiinin farmakokineettisiä parametrejä raskauden aikana verrattiin aiemmin julkaistuihin parametreihin terveillä, ei-raskailla vapaaehtoisilla (CL / F, Porchet ym., 1992; Cunningham ym., 1994) (CLrenal, Fujimura et al., 1994). Kreatiniinipuhdistuman ja klonidiinin munuaispuhdistuman välisen korrelaation määrittämiseksi käytettiin lineaarista regressiota. Paritonta oppilaan t-testiä käytettiin raskaana olevien ja raskaana olevien ryhmien vertailuun. P-arvoa <0, 05 pidettiin merkittävänä. Kaikki tulokset ilmoitetaan keskiarvona ± S. D.