SnapShot: kromosomin konformaatio Capture | Anne Marie

genomin organisaatio ydinavaruudessa on nonrandom ja vaikuttaa genomin toimintoihin, kuten transkriptioon, replikaatioon ja korjautumiseen. Tietyt samasta tai eri kromosomista peräisin olevat genomialueet liittyvät usein fyysisesti toisiinsa ja ydinrakenteisiin, mikä synnyttää monimutkaisesti lokeroituneen tuman. Esimerkkejä genomin interaktioista ovat tehostajan ja promoottorin yhtyminen tai geenien kuten rDNA-geenien ryhmittyminen nukleolukseen. Genomien vuorovaikutuksia on perinteisesti tutkittu fluoresenssi in situ hybridisaatiolla (FISH), joka mahdollistaa eri geenien tai genomialueiden välisen spatiaalisen suhteen visualisoinnin. Menetelmän rajoituksena on, että vain tunnettuja vuorovaikutuksia voidaan kuulustella, kokeessa voidaan tutkia vain hyvin harvoja lokuksia ja resoluutio rajoittuu mikroskoopin optiikkaan.

kromosomin konformaation talteenottotekniikoiden perhe on joukko biokemiallisia lähestymistapoja genomialueiden fysikaalisen vuorovaikutuksen määrittämiseksi. C-tekniikan lähestymistapoihin sisältyy poikkeuksetta viisi vaihetta: 1) formaldehydin kiinnittyminen ristiinlinkiin kromatiiniin fysikaalisen vuorovaikutuksen kohdissa, 2) kromatiinin pilkkominen restriktioentsyymin tai sonikaation avulla, 3) ligaatio laimeissa olosuhteissa, joissa suositaan samalla kompleksilla olevien DNA-päiden välistä ligaatiota satunnaisten törmäysten ligaatioiden sijaan, 4) ligaatioliitosten osoittaminen käyttäen muuttuvia molekyylibiologian vaiheita riippuen menetelmien muunnoksesta, ja 5) laskennallinen analyysi ristiinlinkityn kromatiinin ligaatiossa kuvattujen interaktiotaajuuksien määrittämiseksi.

C-teknologiat (3C, 4C, 5C, Hi-C) eroavat toisistaan havaitsemistapansa ja laajuutensa suhteen, mitä vuorovaikutuksia niillä voidaan tutkia. 3C-menetelmä testaa vuorovaikutusta kahden tunnetun kohteen genomissa, 4C mahdollistaa tuntemattomien interaktorien tutkimisen tunnetussa syöttisarjassa, 5c tunnistaa kaikki vuorovaikutusalueet tietyn genomityypin sisällä ja Hi-C tutkii kaikki esiintyvät vuorovaikutukset puolueettomalla tavalla genomin laajuisesti. Lisävariantit (ChIA-PET, ChIP-Loop) sisältävät proteiinin saostumisvaiheen, jonka avulla voidaan tunnistaa genomin vuorovaikutukset, joihin liittyy tietty kiinnostava proteiini. Menetelmän valinta riippuu vahvasti biologisen kysymyksen erityisluonteesta ja laajuudesta, mutta myös resurssien saatavuudesta, mukaan lukien lähtöaineen määrä ja sekvensointikapasiteetti. Standardin C-tekniikoista on kehitetty monia johdannaisia, jotka usein perustuvat käsiteltyyn tiettyyn biologiseen kysymykseen tai joiden tavoitteena on parantaa spesifisyyttä tai pelkistää taustaa.

C-teknologiat ovat väestöpohjaisia menetelmiä. Ne tuottavat suhteellisia kontaktitodennäköisyyksiä absoluuttisten kontaktitaajuuksien sijaan. Populaatioperusteisuus johtuu siitä, että jokainen genominen lokus antaa yhden parikohtaisen ligaatioliitoksen yhteen soluun. Jotta kontaktiprofiilien kattavuus ja kvantitatiivinen arviointi olisi mahdollista, jokaiseen kokeeseen on sisällytettävä ja yhdistettävä tuhansia tai miljoonia genomiekvivalentteja (soluja), jotka sisältävät useita ligaatioliittymiä. C-kontaktien ja DNA-kalojen väliset korrelaatiot ovat osoittaneet, että 3-5%: ssa populaation soluista esiintyvä interkromosomaalinen yhteys havaitaan yleensä positiivisena useimmissa C-menetelmissä. Tiheämmät assosiaatiot johtavat yleensä voimakkaampiin signaaleihin; signaalin voimakkuus voi kuitenkin myös heijastaa fysikaalisten vuorovaikutusten affiniteettia eikä sen taajuutta.

kriittinen vaihe data-analyysissä on selvittää, onko ligaatioliitoksena havaittu interaktio spesifinen. Kosketustaajuus pienenee eksponentiaalisesti ja on kääntäen verrannollinen lineaariseen genomietäisyyteen muutaman Mb: n päähän vertailupisteestä. Siksi tietyn kontaktin taajuuden lokuksen läheisyydessä oletetaan olevan suurempi kuin satunnaisten törmäysten Tausta. Hyvä spesifisyyden indikaattori Mb-alueen ulkopuolella on tietyn vuorovaikutuksen havaitseminen vierekkäisten rajoituskappaleiden signaaliklustereina.

C-menetelmien erottelukyky määräytyy käytettyjen restriktioentsyymien luonteen ja, jos käytetään sekvensointia havaitsemiseen, myös sekvensointilukujen lukumäärän perusteella. Neljän emäsparin (bp) endonukleaasin tunnistussekvenssien taajuus on periaatteessa kuusitoista kertaa suurempi kuin kuuden bp: n leikkurin tunnistussekvenssin taajuus. Neljän bp: n leikkurin käytön odotetaan lisäävän kontaktien resoluutiota Mb-alueella, jossa tietyille kontakteille ja taustatörmäyksille kuvataan useita ligaatiotapahtumia. Tämän vaihteluvälin ulkopuolella, kuitenkin, kun rajoituspartikkelien klusterit määrittelevät kosketusalueita kymmenistä satoihin kb: iin, neljän bp: n leikkurin käytön edun odotetaan vähenevän. Vaikka monissa genomin laajuisissa määrityksissä on käytetty omia mikroarrajoja, hi-läpimenosekvenssistä on tulossa valinta ligaatioliitosten maailmanlaajuiseen havaitsemiseen. Sekvensointisyvyys on tekninen este eräissä lähestymistavoissa, kuten Hi-C ja ChIA-PET. PCR-pohjaiset teknologiat voittavat tämän rajoituksen vahvistamalla osajoukkoa kontakteja, jolloin kattavuus vähenee. Ligaatiotuotteiden pairwise-luonne asettaa kahden suhteen tehon erotuskyvyn kasvun ja vaaditun sekvensointisyvyyden lisääntymisen välille. Perimä per sekvensointisyvyys riippuu myös tarkastetun genomin koosta. Vastaava sekvensointiteho antaa esimerkiksi hiivassa kymmeniä kb: n kosketusresoluutiota, mutta ihmisen perimässä vain Mb: n resoluutiota.

Vastaa

Sähköpostiosoitettasi ei julkaista.