- Leimaus pilkkoutuneella Kaspaasi-3-vasta-aineella jatkuu DCP-1 drICE-kaksoismutanteissa
- jakautuneen Kaspaasi-3-vasta-aineen immunoreaktiivisuus riippuu apoptosomikomponenteista DRONC ja ARK
- tripeptidi ETD on pilkkoutuneen Kaspaasi-3-vasta-aineen osoittama apoptoottinen epitooppi
- DCP-1: n aktivaatio riippumatta ARK: sta palauttaa pilkkoutuneen Kaspaasi-3: n immunoreaktiivisuuden
Leimaus pilkkoutuneella Kaspaasi-3-vasta-aineella jatkuu DCP-1 drICE-kaksoismutanteissa
pilkkoutuneen Kaspaasi-3: n spesifisyyden arvioimiseksi vasta-aine, analysoimme silmän Kuvantamislevyjä kolmannen asteen toukista. Villin tyypin silmäkuviolevyissä vasta-aine havaitsee muutaman kuolevan solun hajallaan ympäri kiekkoa (Kuva 1a). Yllättäen silmän levyissä kaksinkertaisesti mutantti nollan alleeleille dcp-1Prev ja drICEΔ1 (ref.14, 15), pilkkoutunut Kaspaasi-3-vasta-aine leimaa edelleen soluja (Kuva 1b). DCP-1Prev drICEΔ1-kaksoismutanttien merkinnät tapahtuvat klustereissa (Kuva 1b), samalla tavalla kuin aiemmin on havaittu, kun kaspaasi-3: n estäjän P35: n ilmentyminen esti solukuoleman.3 nämä havainnot viittaavat siihen, että katkennut Kaspaasi-3-vasta-aine havaitsee epitoopin Caspase-3: n kaltaisten proteiinien DCP-1: n ja dricen puuttuessa. Kuitenkin, koska apoptoosi tässä vaiheessa ei esiinny määritellyssä kuviossa, olimme epävarmoja näiden merkintäsignaalien spesifisyydestä.
pilkkoutunut Kaspaasi-3-vasta-aine on dronc-aktiivisuuden merkkiaine. Kuvassa on kolmannen instar-toukkien silmäkuvalevyjä. Takapuoli on oikealla. GMR-hid on siirtogeeninen lisäys X-kromosomiin.(a) villityypin (wt) levy, jossa on cleaved-Caspase-3-vasta-aine. Nuolet osoittavat muutamiin immunopositiivisiin soluihin.(b) levy, joka on kaksin verroin mutantti nollan alleeleille dcp-1Prev ja drICEΔ1, jotka on merkitty halkaistulla Kaspaasi-3-vasta-aineella. Nuolet osoittavat muutamiin immunopositiivisiin soluihin.(C) ja (d) GMR-hid-silmäkalvot muutoin villityyppisessä taustassa, joissa on merkintä (C) cleaved-Caspase-3-vasta-aine ja (d) TUNEL. Huomaa voimakkaat signaalit silmän välilevyjen takaosassa. (e) ja (f) GMR-hid eye disks doubly mutant for DCP-1Prev and drICEΔ1 label for (e) cleaved-Caspase-3 vasta-aine ja (f) TUNEL. Vaikka VIRITYSMERKINNÄT ovat täysin tukossa, cleaved-Caspase-3-vasta-aine antaa edelleen vahvan signaalin silmäkiekon takaosassa.g) ja h) GMR-hid eye discs mutant for the null alleele droncI24. Sekä (g) cleaved-Caspase-3-vasta-aineen että (h) TUNEL-merkinnän estää dronc: n menetys. Genotyypit: a) villityyppi; b) DCP-1prev/dcp-1Prev; drICEΔ1 / drICEΔ1; c) ja d) GMR-hid/GMR-hid; +/+ , +/+; (e) ja f) GMR-hid/GMR-hid; dcp-1Prev/dcp-1Prev; drICEΔ1/drICEΔ1; g) ja h) GMR-hid/GMR-hid, droncI24 / droncI24
siksi käytimme GMR-hid-transgeenejä,hyvin tyypillistä apoptoottista mallia, 5, tutkiaksemme tarkemmin halkaistun Kaspaasi-3-vasta-aineen spesifisyyttä. Kehittyvän silmän takaosassa piilevän proapoptoottisen geenin GMR-vetoisen ilmentymisen kautta GMR-hid-transgeenit indusoivat apoptoosin kahdessa eri aallossa, kuten halkaistut Kaspaasi-3-vasta-aine ja TUNEL labeling28 (Kuva 1c, d) osoittavat. Arvioidaksemme pilkkoutuneen Kaspaasi-3-vasta-aineen spesifisyyttä tutkimme GMR-hid-silmäkiekkoja, jotka olivat kaksinkertaisesti mutantteja dcp-1Prev: lle ja drICEΔ1: lle. Odotuksen mukaisesti DCP-1Prev: n ja drICEΔ1: n menetys kumoaa täysin TUNEL-positiivisen apoptoosin GMR-hid-levyissä (Kuva 1F). Yllättäen kuitenkin DCP-1Prev drICEΔ1-kaksoismutantti GMR-hid-silmälevyt osoittivat edelleen voimakasta immunoreaktiivisuutta halkaistun Kaspaasi-3-vasta-aineen kanssa (kuva 1e). Näin ollen pilkkoutunut Kaspaasi-3-vasta-aine ei havaitse ainoastaan DRICEA ja / tai DCP-1: tä. Huomaamme kuitenkin, että pilkkoutuneen Kaspaasi-3-vasta-aineen merkintätapa muuttuu DCP-1: n ja dricen puuttuessa (vertaa Kuva 1c ja e). Merkintäsignaali ei enää rajoitu kahteen erilliseen aaltoon (Kuva 1c), vaan se täyttää koko silmäkiekon takalokeron ja rajoittuu interommatidaalisoluihin (Kuva 1e). Samanlainen merkintätavan muutos on raportoitu CM1-vasta-aineiden merkinnöissä kaspaasi-inhibiittorin P35 ilmentymisen yhteydessä.3 Tämä merkintämallin muutos johtuu todennäköisesti siitä, että DCP-1Prev drICEΔ1-kaksoismutantti GMR-hid-silmälevyjen solut eivät kuole (Kuva 1F) ja siten säilyttävät halkaistun Kaspaasi-3-vasta-aineen havaitseman epitoopin. On kuitenkin tärkeää huomata, että tämä analyysi osoittaa epitoopin osoittamisen kaspaasi-3: n kaltaisten proteiinien DCP-1: n ja dricen puuttuessa kaspaasi-3: n vasta-aineella.
jakautuneen Kaspaasi-3-vasta-aineen immunoreaktiivisuus riippuu apoptosomikomponenteista DRONC ja ARK
on kaksi mahdollisuutta, miksi jakautuneet Kaspaasi-3-vasta-aineet merkitsevät DCP-1 drICE-kaksoismutanttisoluja, vaikka ne eivät ole apoptoottisia. Ensinnäkin vasta-aine ei välttämättä havaitse apoptoottista epitooppia; tai toiseksi vasta-aine voi havaita apoptoottisen epitoopin, joka syntyy DCP-1: n ja dricen vastavirtaan tai rinnakkain. Näiden mahdollisuuksien erottamiseksi tutkimme GMR-hid-silmäkiekkomutantteja apoptosomikomponenteille DRONC ja ARK, jotka toimivat dricen ja DCP-1: n yläjuoksulla. Dronc – ja ark mutant GMR-hid-silmäkiekkojen sekä TUNEL-että cleaved-Caspase-3-vasta-ainemerkinnät ovat estyneet (Kuva 1 g,h; kuva 3a,b). Nämä tiedot vahvistavat, että pilkkoutunut Kaspaasi-3-vasta-aine todella havaitsee apoptoottisen epitoopin Drosophilassa. Lisäksi, koska se ei havaitse apoptoottista epitooppia dronc-ja ark-mutanteissa, mutta ei DCP-1 drICE-kaksoismutanteissa, on tarkempaa pitää katkennutta Kaspaasi-3-vasta-ainetta dronc-aktiivisuuden merkkiaineena eikä efektori kaspaasiaktiivisuutta kuolevissa Drosophila-soluissa.
ΔN-DCP-1-transgeenin ilmentyminen ark-mutanttiklooneissa palauttaa osittain jakautuneen Kaspaasi-3: n immunoreaktiivisuuden. (A, A’, b, B’) GMR-hid-silmäkiekot, jotka sisälsivät ark-mutanttiklooneja, merkittiin cleaved-Caspase-3-vasta-aineella (a, A’) ja TUNELILLA (b, b’). ark-mutanttiklooneille on tyypillistä GFP: n puuttuminen. Muutama klooniraja on merkitty täplitetyillä viivoilla. Sekä claved-Caspase-3-että TUNEL-signaalit häviävät ark-klooneissa. (A’) ja (b’) ovat vain halkaistut Kaspaasi-3-ja TUNEL-kanavat. Genotyyppi: GMR-hid ey-FLP; FRT42D arkG8 / FRT42D P (ubi-GFP). (c, c’, d, d’) GMR-ΔN-DCP-1-silmäkalvot, jotka sisälsivät ark-mutanttiklooneja, merkittiin halkaistuilla Kaspaasi-3-vasta-aineilla (c, c’) ja TUNELILLA (d, d’). ark-mutanttiklooneille on tyypillistä GFP: n puuttuminen. Ark+ – kudoksessa, joka on merkitty GFP: llä (vihreä), cleaved-Caspase – 3-ja TUNEL-signaalit ovat helposti havaittavissa. Ark-mutanttiklooneilla (katso kloonirajojen ääriviivat stippled-viivoilla) sekä halkaistujen Kaspaasi-3 – että TUNEL-positiivisten solujen määrä vähenee, mutta niitä on muutamia (nuolia). (c’) ja (d’) ovat vain halkaistut Kaspaasi-3-ja TUNEL-kanavat. Genotyyppi: ey-FLP; FRT42D arkG8 / FRT42D P (ubi-GFP); GMR-ΔN-dcp-1
tripeptidi ETD on pilkkoutuneen Kaspaasi-3-vasta-aineen osoittama apoptoottinen epitooppi
pilkkoutuneen Kaspaasi-3-vasta-aineen osoittama epitooppi riippuu DRONC-aktiivisuudesta. On mahdollista, että vasta-aine tunnistaa suoraan aktivoituneen DRONC: n. Vaihtoehtoisesti on myös mahdollista, että pilkkoutunut Kaspaasi-3-vasta-aine havaitsee epitoopin, joka syntyy tuntemattoman substraatin pilkkoutuessa aktiivisen DRONC: n vaikutuksesta riippumatta DRICE: stä ja DCP-1: stä.
erottaaksemme nämä kaksi mahdollisuutta, kohdistimme katalyyttisen kysteiinin (Cys163) jäämät ihmisen Kaspaasi-3: n (Kaspaasi-3-peptidin) asp175: ssä olevaan pilkkoutumiskohtaan Drosophila-kaspaasien vastaavien alueiden kanssa (kuva 2a; KS.myös viite. 3). Eniten Kaspaasi-3-peptidin, ETD: n, C-terminaalisia jäämiä säilyy DRICESSÄ ja DCP-1: ssä (kuva 2a). Caspase-3: n tapaan tämä on ainakin DRICE, 29: n ja mahdollisesti DCP-1: n aktivointipaikka. On mielenkiintoista huomata, että N-terminaali, kaksi kolmasosaa Kaspaasi-3-peptidistä, muistuttaa eniten DRONC: tä; kuusi yhdeksästä jäämästä säilyy (Kuva 2a). Tämä Kaspaasi-3-peptidin osa säilyy huonommin DRICE -, DCP-1-ja loput Drosophila-kaspaasit. Vaikka dronc: n suuren ja pienen alayksikön pilkkoutuminen ei ole tarpeen sen toiminnan kannalta,30, 31 eikä sitä välttämättä tapahdu in vivo, otimme huomioon mahdollisuuden, että Kaspaasi-3-peptidin N-terminaalista osaa vastaan suunnatut vasta-aineet voivat suoraan havaita aktiivisen DRONC: n kuolevissa soluissa.
ETD: tä sisältävä peptidi estää jakautuneen Kaspaasi-3: n immunoreaktiivisuuden.a) katalyyttisen Cys163: n jäämien aminohapposekvenssin kohdistuminen ihmisen Kaspaasi-3: n (Kaspaasi-3-peptidin) pilkkoutumiskohtaan Asp175: ssä ja Drosophila-kaspaasien vastaaviin alueisiin. Punaisella korostetut jäämät ovat identtisiä Kaspaasi – 3-peptidissä. Dricen osalta DCP-1: n ja DRONC: n pilkkoutuminen on osoitettu näytetyn sekvenssin viimeisen jäännöksen (d ja e) jälkeen. DECAY, DAMM, DREDD ja DREAM pilkkominen on epävarmaa, eikä näytetyn sekvenssin loppu tarkoita pilkkomista (merkitty…). Alleviivattuja sekvenssejä käytettiin peptidien estämisessä (vertaa B: hen). b) estävien peptidien Aminohapposekvenssit. Vain peptidi A estää jakautuneen Kaspaasi-3-vasta-aineen immunoreaktiivisuuden. (C ja d) pilkkoutuneen Kaspaasi-3-vasta-aineen Esiinkubaatio peptidi A: n kanssa kumoaa täysin sen immunoreaktiivisuuden GMR-hid-silmälevyissä (c) ja GMR-hid-silmälevyissä (DCP-1 ja drICE (d) – mutanteissa. (E ja f) pilkkoutuneen Kaspaasi-3-vasta-aineen Esiinkubaatio peptidi B: n kanssa vaikuttaa vain vähän tai ei lainkaan sen immunoreaktiivisuuteen GMR-hid-silmälevyissä (e) ja GMR-hid-silmälevyissä, jotka mutantoivat DCP-1: n ja dricen (F) osalta. Samanlaisia tuloksia saatiin peptideistä c ja d (tietoja ei näy)
käytimme salpaavia peptidejä arvioidaksemme, mitä kaspaasi-3-peptidin epitooppeja pilkkoutunut Kaspaasi-3-vasta-aine havaitsee kuolevissa Drosophila-soluissa. Salpaavien peptidien sekvenssit esitetään kuvassa 2b ja alleviivataan Kuvassa 2a. Estävä peptidi a (TETD) on johdettu dricestä ja DCP-1: stä ja estävä peptidi B (CRGDEYDLG) vastaa dronc: n suurinta samankaltaisuutta (Kuva 2A,b). Peptidi C on kontrollipeptidi,joka vastaa dronc: ssä välittömästi peptidi B: n vieressä olevia jäämiä (Kuva 2A, b). Peptidi D on toinen kontrollipeptidi, joka muistuttaa hyvin paljon peptidi A: ta ja on johdettu dronc: n prodomaanista kohdassa 113. Jos DRONC: n prodomaani halkeaa tässä kohdassa, se paljastaa ESD: n sen C-terminuksesta, joka on hyvin samanlainen kuin Kaspaasi-3-peptidin (ETD, peptidi A) C-terminus, ja näin ollen se voidaan havaita katkaistulla Kaspaasi-3-vasta-aineella.
salpaavat peptidit sekoitettiin halkaistuun Kaspaasi-3-vasta-aineeseen 60 minuuttia ennen inkubaatiota silmän kuvanlevyillä. Salpauskokeiden tulokset on koottu kuvioon 2b ja peptideille A ja B Kuvassa 2C–f. Peptidi A riittää estämään pilkkoutuneen Kaspaasi-3-vasta-aineen koko immunoreaktiivisuuden GMR-hid-ja DCP-1 drICE-kaksoismutanteissa GMR-hid-silmäkalvoissa (Kuva 2C,d). Peptidi B ei sitä vastoin kumoa vasta-aineen immunoreaktiivisuutta näissä levyissä (Kuva 2e,f). Kontrollipeptidit C ja D eivät myöskään estä pilkkoutunutta Kaspaasi-3-immunoreaktiivisuutta (Kuva 2b; tietoja ei näy).
nämä tiedot osoittavat, että pilkkoutunut Kaspaasi-3-vasta-aine havaitsee epitoopin ETD: n nimenomaan apoptoottisissa soluissa. Drosophila-kaspaaseista tätä epitooppia esiintyy vain DRICE-ja DCP-1-kaspaaseissa, joten on hyvin todennäköistä, että vasta-aine todella havaitsee nämä efektorikaspaasit. Sen sijaan se, että DRONC: stä johdetut peptidit B, C ja D eivät estä immunoreaktiivisuutta, viittaa siihen, että vasta-aine ei todennäköisesti havaitse suoraan aktiivista DRONC: tä. Koska katkeava Kaspaasi-3-vasta-aine ei menetä immunoreaktiivisuutta DCP-1 drICE-kaksoismutanteissa (Kuva 1e), se havaitsee ainakin yhden muun proteiinin, joka altistaa ETD-epitoopin DRONC-riippuvaisesti.
DCP-1: n aktivaatio riippumatta ARK: sta palauttaa pilkkoutuneen Kaspaasi-3: n immunoreaktiivisuuden
kuvassa 2 esitetty analyysi viittaa, mutta ei todista, että pilkkoutunut Kaspaasi-3: n vasta-aine todella osoittaa pilkkoutuneen DCP-1: n ja dricen. Testataksemme tätä mahdollisuutta ilmaisimme GMR-ΔN-dcp-1-transgeenin ark-mutanttitaustassa. ΔN-dcp-1: stä puuttuu DCP-1: n N-terminaalinen prodomaani. On ajateltu, että prodomain-köyhdytetty ΔN-DCP-1 edistää helposti autoprosessointia, ja johdonmukainen ilmentyminen GMR-ohjauksessa indusoi silmän ablaatio-fenotyypin.32 tämä silmän ablaatio-fenotyyppi johtuu apoptoosin induktiosta (Kuva 3c,d). Kuten edellä mainittiin, GMR-hid-taustaiset ark-mutanttikloonit eivät indusoi TUNEL-positiivista apoptoosia (kuva 3b), ja halkaistu Kaspaasi-3-vasta-aine ei ole immuuniaktiivinen ark-klooneissa (Kuva 3a), mikä viittaa siihen, että ark-mutanttiklooneissa ei ole DCP-1: tä, DRICEA eikä tuntemattomia DRONC-substraatteja. Siksi testasimme, voiko ΔN-Dcp-1: n ilmentyminen apoptosomiaktiivisuuden puuttuessa eli ark-klooneissa palauttaa pilkkoutuneen Kaspaasi-3-vasta-ainemerkinnän. Verrattuna villityyppiseen kudokseen (merkitty GFP: llä Kuvassa 3c,c’), pilkkoutuneiden Kaspaasi-3-positiivisten solujen määrä vähenee voimakkaasti ark-mutanttiklooneissa (Kuva 3c,c’), mikä viittaa siihen, että ΔN-DCP-1: n aktivaatio riippuu ainakin osittain apoptosomista. Kuitenkin noin 50% Ark-mutanttiklooneista (n=32) GMR-ΔN-Dcp-1-taustassa sisältää halkaistuja kaspaasi-3-immunoreaktiivisia soluja (nuolia Kuvassa 3c, c’). Tämä ei todennäköisesti ole merkintä artefakti, koska nämä solut ovat myös TUNEL-positiivisia (kuva 3d, d’). Siksi, koska DRONC on inaktiivinen ark-mutanttitaustassa, mikä viittaa siihen, että pilkkoutunut Kaspaasi-3-merkintäsignaali ei johdu tuntemattomasta DRONC-substraatista, tämä analyysi osoittaa, että pilkkoutunut Kaspaasi-3-vasta-aine todellakin havaitsee pilkkoutuneen DCP-1: n. On myös mahdollista, että pilkkoutunut Kaspaasi-3-vasta-aine havaitsee pilkkoutuneen dricen tässä kokeessa, koska DCP-1 voi proteolyyttisesti käsitellä dricen ainakin in vitro.29, 32 vastaavaa analyysiä ei voitu tehdä dricen kanssa, koska GMR-drICE ja GMR-ΔN-drICE eivät aiheuta silmien ablaatio-fenotyyppiä.32 riippumatta siitä, katkeaako DCP-1 dricen in vivo vai ei, kun otetaan huomioon DCP-1: n ja dricen sekvenssien samankaltaisuus suuren alayksikön C-terminaalissa ja kuvan 2 peptidisalpaustiedot, se viittaa siihen, että vasta-aine voi myös havaita haljenneen dricen.