- kromosomin ryhmittely ja maalaus
- Deleetiokartoitusanalyysi
- yhteisen poistetun alueen pienentäminen MDS/AML-potilailla
- yhteisen poistetun alueen väheneminen MPD-potilailla
- bakteeriklooni contig, joka kattaa MPD: n ja MDS/AML: n yhteiset poistetut alueet
- ilmaistujen sekvenssien tunnistaminen
- Ekspressioprofilointi
kromosomin ryhmittely ja maalaus
luuytimen kromosomivalmisteet analysoitiin 107 myeloidista häiriötä sairastaneen tapauksen kromosomin 20 pitkän varren poiston koko. Kuten aiemmin on kuvattu (Nacheva et al., 1995b) havaittiin kaksi 20Q: n poistoluokkaa – suuret poistot (59 tapausta), joiden seurauksena molemmat Giemsa: n tummat kaistat katosivat 20Q: sta (Kuva 1a, ylhäältä), ja pienet poistot (48 tapausta), joissa yksi Giemsa: n tumma kaista jäi jäljelle (Kuva 1a, alhaalta). Seuraavaksi keskityimme jälkimmäiseen potilasryhmään (yhteenveto taulukossa 1).
20Q: n deleetioiden analysointi G-sidonnan, kromosomimaalauksen ja lokuskohtaisten antureiden avulla. (a) G banded partial karyotype of normal (left) and deleted (right) kromosomi 20 homologues showing a large deleetion (top pair) and a small deleetion (bottom pair) of the long arm. B) luuytimen metafaasisolu hybridisoituu kromosomi 15: n (punainen) ja kromosomi 20: n (vihreä) kanssa, mikä osoittaa, että merkkikromosomi (nuoli), jonka g-ryhmitys osoittaa del: ksi(20) (q11), on itse asiassa peräisin kromosomista 15. C) luuytimen metafaasisolu hybridisoitui kromosomi 20: n maalin (punainen) kanssa, mikä osoittaa kromosomi 20: n (nuoli) kryptisen translokaation, joka oli G-ryhmittelyllä tunnistettu del: ksi(20Q). (d) luuytimen metafaasisolu potilaalta, jolla on del (20) (q11.2q13.2) hybridisoitunut kromosomi 20 maalin kanssa, joka osoittaa hybridisaation molempiin kromosomi 20-homologeihin. (e) osittainen luuytimen metafaasisolu MDS-potilaasta db122 hybridisoitunut kromosomi 20: n sentromeerisen koettimen (punainen) ja PAC dJ620E11: n (vihreä) kanssa, mikä osoittaa PAC dJ620E11: n hybridisoitumisen sekä normaaleihin että poistettuihin (nuoli) kromosomi 20: n homologeihin. (F) osittainen luuytimen metafaasisolu potilaasta DB122 hybridisoitunut kromosomi 20 centromeerinen anturi (punainen) ja PAC dJ661I20 (vihreä) osoittaa, että vihreä signaali del(20) (q11.2q13.1) (Nuoli) puuttuu. (g) MDS-potilaan Db214 osittainen luuytimen metafaasisolu hybridisoituu kromosomi 20: n sentromeerisen koettimen (punainen) ja PAC dJ242A14: n (vihreä) kanssa. Huomaa vihreän signaalin puuttuminen del: stä(20) (q11.2q13.1) (Nuoli). (h) osittainen luuytimen metafaasisolu MDS-potilaasta db214 hybridisoitunut kromosomi 20: n sentromeerisen koettimen (punainen) ja PAC dJ196H17: n (vihreä) kanssa, jossa on punaisia ja vihreitä signaaleja sekä normaalista että poistetusta (nuoli) kromosomi 20-homologista
kalojen analyysi kromosomi 20-maalilla tehtiin 48 näytteestä, joissa oli pieni 20Q: n poisto. Kuudessa tapauksessa ”20q: n poisto” paljastui kryptisten uudelleenjärjestelyjen syyksi. Yhdessä tapauksessa, kun maaleja levitettiin samanaikaisesti kromosomeihin 15 ja 20, tunnistettiin kromosomi 15: stä johdettu merkkiaine, mutta kaksi normaalia kromosomi 20: n homologiaa (Kuva 1b). Viidessä muussa tapauksessa kromosomin maalaus osoitti epätasapainoisen translokaation, jossa on toistuva raja-arvo 20q11.2 ja vaihtelevia kromosomipartnereita (Kuva 1c). Kaikissa viidessä tapauksessa der (20) – merkkiaine oli ainoa perimässä säilynyt translokaatiotuote. Lisäksi KALAKARTOITUS osoitti, että katkeamispiste kromosomissa 20 oli tapahtunut alueella, joka oli proksimaalinen D20S107: ään, ja että kromosomi 20: n pitkän käsivarren loppuosa oli varmasti hävinnyt (tietoja ei näy). Tulokset raportoidaan yksityiskohtaisesti muualla.
lopuissa 42 tapauksessa kromosomin maalaus oli yhdenmukainen pienen 20Q: n interstitiaalisen deleetion kanssa (kuva 1D). Suurimmassa osassa (33 tapausta) oli 20Q: n poisto ainoana karyotyyppisenä poikkeamana. Yhdeksässä muussa tapauksessa 20Q: n poistoon liittyi erilaisia kromosomipoikkeavuuksia (Taulukko 1). Kaikki 42 tapausta, joissa oli pieni 20Q: n poisto, tutkittiin edelleen kalojen kartoituksessa lokuskohtaisilla koettimilla.
Deleetiokartoitusanalyysi
kalat analysoivat 42 potilasta, joilla oli pieniä 20Q: n deleetioita, käyttäen centromeeristä PAC: tä (CEP20), 20Q: n distaalialueelle (LSI 20Q13) hybridisoituvaa PAC: tä ja CDR: n sisäistä Pac: tä (LSI D20S108). Jokaisella potilaalla havaittiin poistetussa kromosomissa 20 sekä LSI 20q13: n että CEP20: n, mutta ei LSI D20S108: n signaaleja, jotka vahvistivat interstitiaalisen deleetion olemassaolon (Yhteenveto Kuvassa 3). Metafaaseja kunkin potilaan sitten hybridisoitu PACS kartoitus rajoilla tunnettujen MPD ja MDS / AML CDRs-D20S107 joka sijaitsee proksimaalisen rajan CDRs ja D20S176 joka sijaitsee telomeerinen distaalisen rajan CDRs (Bench et al., 1998a; Wang et al., 1998).
Yhteenveto karttatiedoista. Tässä luvussa esitetään FISH – ja microsatellite PCR-tulokset, jotka mahdollistavat uusien MDS/AML-ja MPD-cdr-levyjen rajaamisen. Potilaat analysoitiin kaloilla locus – spesifisillä koettimilla, lukuun ottamatta potilasta RB42, jolle tehtiin mikrosatelliitti PCR. Mikrosatelliitti PCR oli aiemmin tehty potilaille MH40 ja JH41 (Bench et al., 1998a). STS-merkit ja vastaavat PACs-merkit näkyvät vasemmalla. Merkkiaineiden välinen etäisyys ilmoitetaan megabasepaireina tai centimorganeina. Bracketed markkereita erotetaan alle 0,1 Mb. MPD CDR: n distaalinen raja on aiemmin raportoitu (Wang et al., 1998). MDS / AML CDR: n kyljessä ovat PACs dJ620E11 ja dJ196H17. MPD: n CDR: ää reunustavat DS20S108 ja d20s481. Potilas db214 osoitti myös PACS dJ149D20: n (D20S481), dJ81O8: n (d20s454), dJ207N8: n (stSG34079) ja dJ734B23: n (WI-4255) säilymisen (tietoja ei näy))
37 potilaalla (25 MDS: llä tai AML: llä, 12 MPD: llä) molemmat luotaimet eivät tuottaneet signaalia poistetusta kromosomista 20, mikä osoittaa, että niissä on laajoja poistoja, jotka eivät auttaisi tarkentamaan cdr: ää. Tällaisia näytteitä ei tutkittu tarkemmin. Kuitenkin neljällä MDS-potilaalla (DB53, MH40, DB122 ja DB214) ja yhdellä MPD-potilaalla (JH41) yksi kahdesta luotaimesta antoi signaalin poistetusta kromosomista 20 ja nämä näytteet analysoitiin tarkemmin.
niiden 42 potilaan lisäksi, joilla oli pieni 20Q deleetio ja jotka kalat analysoivat lokuskohtaisilla koettimilla, kuusi muuta potilasta, joilla oli 20Q deleetio (neljällä MDS: llä, kahdella MPD: llä), joiden luuydinmetafaaseja ei ollut saatavilla, analysoitiin mikrosatelliittisella PCR: llä. Puhdistettujen granulosyyttien ja T-solujen DNA analysoitiin käyttämällä suurta polymorfisten merkkiaineiden paneelia, joka ulottui MPD: n ja MDS/AML: n cdr: ien alueelle (Taulukko 2). Kaikilla neljällä MDS-potilaalla oli deleetioita, jotka ulottuivat yli julkaistun CDR: n rajojen. Kuitenkin toisella kahdesta MPD-potilaasta (RB42) poiston sentromeerinen raja pienensi huomattavasti MPD-CDR: ää (kuva 2, taulukko 2).
Mikrosatelliittiset PCR-tulokset, jotka määrittelevät uuden MPD: n yhteisen poistetun alueen proksimaalisen rajan. Mikrosatelliitti PCR suoritettiin käyttäen osoitettuja merkkiaineita DNA: ssa, joka on uutettu potilaan rb42 puhdistetuista granulosyyteistä (G) ja T-soluista (t). Nuolenkärjet ilmaisevat kunkin alleelin yläheimoa. Avoimet nuolenkärjet ilmaisevat granulosyyteistä poistetun alleelin. Kaksi alleelia säilytetään pisteessä D20S108, kun taas yksi alleeli menetetään pisteissä D20S858 ja D20S46
yhteisen poistetun alueen pienentäminen MDS/AML-potilailla
alustavassa FISH-analyysissä tunnistettiin neljä MDS / AML-potilasta, joiden deleetiot ylittivät MDS / AML-CDR: n. Kussakin tapauksessa 20Q: n deleetio oli läsnä kaikissa tutkituissa metafaaseissa. Kolmessa tapauksessa (DB53, DB214 ja MH40) 20q: n poisto oli ainoa poikkeavuus. Db122-potilaalla 20q: n deleetio oli alkuperäinen ainoa poikkeavuus kahdella alaluokalla, jotka sisälsivät 20q: n deleetion lisäksi myös trisomia 21 tai trisomia 8 ja trisomia 21. Näitä neljää tapausta tutkittiin käyttämällä ylimääräisiä lokuskohtaisia koettimia poistorajojen selvittämiseksi.
MDS/AML CDR: n proksimaalista rajaa tarkensivat potilaat DB53, MH40 ja db122. Poiston proksimaalinen raja db53: ssa sijoittuu d20s107: n ja WI-11538: n välille (kuva 3), etäisyys noin 400 kb. Potilaan MH40 osalta WI-11538: aa (dJ357E14) sisältävä PAC aiheutti johdonmukaisesti pienennetyn signaalin, joka vastaa proksimaalisen poiston katkeamispisteen läsnäoloa tässä PAC: ssä (kuva 3). Lisäksi poiston proksimaalinen raja potilaassa DB122 asettuu sts-R52161: n ja stSG25449: n välille (Kuva 1e,f), ja etäisyys on alle 200 kb (kuvat 3 ja 4). Tämä edustaa MDS/AML CDR: n proksimaalisen rajan suurta hienosäätöä.
Yhteenveto bakteeriklooni contigista. Tämä luku kuvaa edustavaa otosta PAC-ja BAC-klooneista, jotka muodostavat kontigin. Ne kloonit, jotka ovat osa sekvensoinnissa käytettävää laatoituspolkua, esitetään normaalityyppisinä. MDS / AML CDR ulottuu 2.6 Mb välillä dJ620E11 ja dJ196H17 kun taas MPD CDR ulottuu d20s108 d20s481, etäisyys 2.7 Mb. Kahden CDR: n päällekkäisyysalue on kooltaan 1,7 Mb. Kaikkia PACs -, BACs-ja markkereita ei ole merkitty. Osa koko kartasta dJ128O17: n ja dJ272H18: n välillä näkyy. Koko kartan voi katsoa osoitteesta http://webace.sanger.ac.uk/cgi-bin/ace/pic/20ace?name=Chr_20ctg125& class=kartta
potilas DB214 mahdollisti MDS/AML CDR: n distaalisen rajan huomattavan tarkentamisen. Poiston distaalinen raja on välillä WI-12515 ja stSG40369 (Kuva 1g,h), etäisyys on alle 100 kb (kuvat 3 ja 4).
nämä tiedot pienentävät siis huomattavasti MDS/AML CDR-arvoa alueelle, joka sijaitsee PAC dJ620E11: n, joka sisältää sts-R52161: n, ja PAC dJ196H17: n, joka sisältää WI-12515: n, välissä (kuvat 3 ja 4). Alla esitetty bakteeriklooni contig osoittaa tämän alueen fyysisen koon olevan noin 2,6 Mb.
yhteisen poistetun alueen väheneminen MPD-potilailla
potilaalla JH41 (diagnoosi PV), deleetion proksimaalinen raja oli aiemmin määritetty mikrosatelliittisella PCR: llä d20s438: n ja D20S107: n välille (Bench et al., 1998a). PAC dJ155H19, joka sisältää D20S107: n (kuva 4), aiheutti johdonmukaisesti pelkistetyn signaalin, joka vastaa proksimaalisen deleetion breakpointin läsnäoloa tässä PAC: ssä (kuva 3).
granulosyyttejä ja T-soluja tutkittiin vielä kahdelta potilaalta mikrosatelliittisella PCR: llä (Taulukko 2). Yksi PV (RB42) – potilas osoitti heterotsygoottisuuden säilyvän d20s108: ssa mutta häviävän d20s858: ssa (kuva 2, taulukko 2). Poiston proksimaalinen raja-arvo tällä potilaalla oli D20S108: n ja D20S858: n välillä, alle 200 kb: n etäisyydellä (kuvat 3 ja 4).
nämä tiedot pienentävät huomattavasti MPD CDR whicihiä, jota nyt tukevat d20s108 (tämä tutkimus) ja D20S481 (Wang et al., 1998). Alueen arvioitu fyysinen koko on 2.7 Mt käyttäen alla esitettyä bakteeriklooni contigin tietoja. Uusien MDS/AML-ja MPD-cdr-levyjen päällekkäisyysalue määritteli 1,7 Mb: n yhdistetyn ”myelooisen” CDR: n (kuva 3).
bakteeriklooni contig, joka kattaa MPD: n ja MDS/AML: n yhteiset poistetut alueet
olimme aiemmin rakentaneet 11 Mb YAC contigin tästä kromosomissa 20 olevasta alueesta (Bench et al., 1998a). Tarkemman fyysisen kartan tuottamiseksi olemme nyt rakentaneet yhtenäisen PAC-ja BAC-pohjaisen kartan. PAC-ja BAC-kloonit tunnistettiin risteyttämällä STSs genomikirjastoihin (Ioannou et al., 1994; Osoegawa ym., 1998). Klooneja päällekkäin käyttäen rajoitus sormenjälkiä (Gregory et al., 1997) ja STS content mapping mahdollistaa kloonien ryhmittelyn kontigeiksi. Kontigien siltaamiseen käytettiin uusia, kontigien päistä kehitettyjä STSs-ja DNA-luotaimia kirjaston seulontaan. Uudet PACs ja BACs sitten amalgamated osaksi contigs samalla tavalla, kunnes yhtenäinen kartta oli tuotettu.
bakteeriklooni contig sisältää yhteensä 456 bakteerikloonia, joista 376 on PACs-ja 80 BACs-klooneja. Se ulottuu d20s607: stä SEMG1: een ja sisältää 202 DNA-merkkiainetta, joista 185 on STSs: ää ja 17 DNA-luotainta. Contigin koko perustui keskimäärin 3,5 kb Hindii-sormenjälkialuetta kohti (P Deloukas (2000), julkaisemattomat tulokset). Contigin arvioitu koko laskettiin 5 Mb kertomalla kontigin sisällä olevien eri sormenjälkitaajuuksien kokonaismäärä 3,5: llä. Kuviossa 4 esitetään kartta, josta käy ilmi kalakokeissa käytetty laatoituspolku ja PACs-järjestelmä. Kartan täydellinen versio löytyy osoitteesta http://webace.sanger.ac.uk/cgi-bin/ace/pic/20ace?name=Chr_-20ctg125&class = Map.
ilmaistujen sekvenssien tunnistaminen
neljäkymmentäkolme yksilöllistä Estiä sijaitsi d20s607: n ja stSG34035: n välissä. Näistä 34 est: tä kartoitettiin hybridisoimalla PACs: n ja BACs: n ”polygridiksi” tai PACs: ää tai BACs: ia sisältävien bakteeripesäkkeiden pesäke PCR: llä (Kuva 4). Lisäksi yhdeksän ESTs, aiemmin kartoitettu tällä alueella kromosomi 20 (Bench et al., 1998a; Deloukas et al., 1998) asetettiin contig: n päälle BLAST-sekvenssin yhdenmukaistamisella saatavilla olevan PAC: n tai BAC: n genomisarjan kanssa.
jotta voitiin tunnistaa putatiiviset uudet ilmentyneet sekvenssit, 23 PAC-kloonia minimaaliselta laatoituspolulta sekvensoitiin osittain tai kokonaan. Näiden kloonien genomisekvenssi analysoitiin NIX-ohjelman avulla (Williams et al., 1998), joka mahdollistaa useiden geenien tunnistustyökalujen, kuten Grailin, GENSCANIN ja Blastin samanaikaisen tarkkailun. Tutkimuksessa tunnistettiin kahdeksan aiemmin käyttämätöntä Estiä ja geeniä (Taulukko 3). Näistä kuusi sijaitsi MPD: n CDR: n ja seitsemän MDS: n CDR: n sisällä. Saatiin näyttöä siitä, että kuusi näistä kahdeksasta oletetusta ilmentyvästä sekvenssistä edusti bona fide-transkriboituja geenejä eikä EST-tietokannassa käsiteltyjä pseudogeenejä tai genomisia DNA-vierasaineita. KCNS1 on geeni, joka koodaa kaliumjännitteellä varustettua kanavan alayksikköä. ESTs AA053206/AA053121 on myöhemmin todettu olevan peräisin SGK2-geenistä (Kobayashi et al., 1999). CDNA: n sekvenssin sovittaminen genomiseen osoitti eksoni-intronirakenteen kolmelle jäljellä olevasta kuudesta Estistä (AI312497, AA568401 ja AA910031), ja liitoskohdan konsensusjärjestys oli läsnä kaikilla eksonin ja intronin rajoilla. Kaikissa kolmessa tapauksessa jokaisen eksonin olemassaolo varmistettiin eksonien ennustusohjelmilla, kuten GRAILILLA. Eksonin olemassaolon ennustivat myös GRAIL, GENSCAN ja Genefinder PAC dJ1108D11: n alueella, joka oli linjassa EST AA993161: n kanssa, mikä viittaa siihen, että tämä EST edusti myös transkriboitua geeniä.
PACS: n Sekvenssianalyysi minimaaliselta laatoituspolulta antoi myös mahdollisuuden määrittää tunnettujen ja uusien geenien genomirakenne tällä alueella. Rptprho cDNA: n yhdenmukaistaminen PACs dJ1121H13: n, dJ707K17: n, dJ81G23: n, dJ230I19: n, dJ3E5: n, dJ232N11: n ja dJ269M15: n kanssa osoitti, että tämän geenin kantavuus on vähintään 1,2 Mb. PAC dJ138B7 sisälsi kaksi geeniä (h-l (3) mbt ja SGK2) sekä SHGC-36858: AA vastaavan geenin 5′ – osan. Erityisesti theh-l (3) mbt-geeni sisältää 20 eksonia, joissa on kaksi putatiivista vaihtoehtoista lopullista eksonia. DJ644L1: n analyysi osoitti, että ihmisen MafB-geeni koostuu yhdestä eksonista. Valmiin sekvenssin analyysin suoritti myös Sanger-keskus (http://www.sanger.ac.uk/HGP/Humana) ja tätä voi tarkastella osoitteessa http://webace.sanger.ac.uk/cgi-bin/webace?db=acedb20&class=GenomeSequence.
nämä tiedot osoittavat, että uudessa MDS/AML CDR: ssä on kuusi geeniä ja lisäksi 14 unqiue Estiä ja Uudessa MPD CDR: ssä yhteensä 14 geeniä, joissa on 23 ainutlaatuista Estiä (Taulukko 3). Kuusi geeniä ja 10 ainutlaatuista Estiä ovat läsnä kahden CDR: n päällekkäisyysalueella.
Ekspressioprofilointi
myeloproliferatiivisten häiriöiden, myelodysplastisten oireyhtymien ja akuutin myelooisen leukemian arvellaan johtuvan multipotentin solun transformaatiosta hematopoieettisessa kantasoluosastossa (Bonnet and Dick, 1997; Kralovics and Prchal, 1998). Lisäksi on aiemmin osoitettu, että 20Q: n deleetio voi syntyä progenitorisolussa, joka kykenee synnyttämään sekä myelooisia soluja että B-soluja (White et al., 1994). Nämä seikat viittaavat siihen, että kromosomissa 20Q oleva geeni tai geenit, jotka inaktivoituvat näissä sairauksissa, on todennäköisesti ilmaistu normaaleissa hematopoieettisissa progenitorisoluissa. Siksi määritimme, mitkä transkriboidut sekvenssit ilmenivät luuytimessä ja puhdistetuissa CD34-positiivisissa soluissa.
Reverse transkription PCR (RT–PCR) amplifikaatio suoritettiin alukkeilla, jotka edustivat kutakin 51 transkriboitua sekvenssiä (kuva 5). Jokaiselle transkriboidulle jaksolle tehtiin vähintään kaksi erillistä RT-PCR-vahvistusta. Positiivisena kontrollina käytettiin CD34-geenin 3′ UTR: stä johdettua EST: tä (WI-7685) vastaavia alukkeita (kuva 5). Jos kaksi tai useampi ESTs vastasi samaa transkriboitua sekvenssiä, kullekin ESTILLE saatiin sama tulos.
Contigin geenien Ekspressioanalyysi. RT-PCR-tiedot esitetään kolmelle contig-merkkiaineelle (AI312497, stSG3032, AA716165) ja WI-7685: lle, CD34-geenin 3′ UTR: stä johdetulle EST: lle. RT-PCR suoritettiin käyttäen RNA: ta, joka oli saatu kahden normaalin henkilön luuydinsoluista (BM) tai toisen normaalin henkilön CD34-positiivisista soluista (CD34+). PCR-tuotteiden koot on ilmoitettu. M, ΦX174 / HaeIII digest; + RT, Käänteinen transkriptio suoritetaan käänteiskopioijaentsyymin läsnä ollessa; – RT, mock reverse transkriptio suoritetaan ilman käänteiskopioijaentsyymiä; – ve, PCR perustettu ilman DNA: ta; +ve, PCR perustettu käyttäen genomista DNA: ta
tiedot on esitetty kaaviossa 5, taulukoissa 3 ja 4. MPD: n CDR: n 37 ilmaistusta sekvenssistä 20 ilmaistiin luuytimen mononukleaarisoluissa. Näistä 16 ilmaistiin myös CD34-positiivisissa soluissa. MDS/AML CDR: ssä 11 20: stä transkriboidusta sekvenssistä ilmaistiin luuytimen mononukleaarisissa soluissa. Näistä kahdeksan ilmeni myös CD34-positiivisissa soluissa. Niistä 16 transkriboidusta sekvenssistä, jotka sijoittuvat MPD: n ja MDS/AML: n CDR: n päällekkäisalueelle, kahdeksan ilmaistiin luuydinsoluissa, joista viisi ilmaistiin myös CD34-positiivisissa soluissa. Nämä viisi transkriboitua sekvenssiä edustavat siis ensisijaisia kandidaattigeenejä, koska ne sijaitsevat sekä MPD: ssä että MDS/AML: n cdr: ssä ja ilmenevät hematopoieettisessa progenitorisoluosastossa. Niihin kuuluu kaksi tuntematonta geeniä, jotka vastaavat ESTs SHGC-36858: aa ja WI-12515: tä, sekä kolme geeniä, SFRS6, h-l(3)mbt ja MYBL2.