kasvit ja taudinaiheuttaja
jääkasvi (Mesembryanthemum crystallinum L.) kasvatettiin kasvihuoneessa kuvannut kuźniak et al. . 3. lehtiparin ilmestymisen jälkeen yhtä kasviparia kasteltiin 0,4 M NaCl: llä Crassulacean hapon metabolian indusoimiseksi (CAM-kasvit), kun taas toista kasteltiin edelleen vesijohtovedellä (C3-kasvit). 12 päivän kuluttua CAM: n induktio NaCl – käsitellyissä kasveissa varmistettiin mittaamalla diurnal ∆ – malaatti lehtisolun mahlasta. Tämän jälkeen C3-ja CAM-kasvien 2.lehtiparin lehdet inokuloitiin Botrytis cinerea-valmisteella kuźniak et al. .
klorofylli a-fluoresenssikuvaus
lehtitelineellä varustetun Imaging-PAM-Klorofyllifluorometrin M-sarjan Miniversiota (Walz, Effeltrich, Saksa) käytettiin fluoresenssikuvauksen (Imaging-Pam M-series Klorofyllifluorometri) tallentamiseen . Fluorometri on lehtikiinnitysmalli kenttäsovelluksiin. Lehtiteline varmistaa, että lehti pysyy valonlähteeseen nähden vaakasuorassa, jottei lehtinäytteen eri alueilla ilmenisi heterogeenista valaistusta. Näytteenottopaikat valittiin siten, että ne sijaitsivat tasaisesti keskiruumiin suuntaisesti, mutta ne erosivat jonkin verran minkä tahansa lehden koosta ja morfologiasta sekä tekniikasta, jolla lehdet asetettiin pidikkeeseen. Jotta tunnistettaisiin vain bioottisen stressin vaikutukset ja vältettäisiin artefaktien käyttö klorofyllin fluoresenssimittausmenetelmässä, lehtiin ei laitettu Lehtikuvan vertailumerkkejä. Lehtivihreän fluoresenssi tavallisista jääkasvin lehdistä saatiin määrittämällä area of interests (AOI tool) käyttäen Imaging Win 2.41 a-ohjelmistoa.
Imaging-PAM-menetelmällä nykyisen fluoresenssin saantoa (ft) seurattiin jatkuvasti. Kasvit tummuivat 20 min. Saturaatiopulssin avulla määritettiin pimeätason fluoresenssituotto (Ft = F0) ja suurin fluoresenssituotto (Fm). Maksimaalinen PSII – kvanttisaanto, FV / Fm, sekä säännellyn ja sääntelemättömän energiahäviön kvanttisaanto psii -, Y(NPQ) – ja Y(NO) – yksiköissä kuvattiin. Fv/Fm laskettiin yhtälöllä: Fv / Fm = (Fm − F0) Fm. Y (NPQ) laskettiin Kramer et al. kaavalla: 1-Y (II) − 1/(NPQ + 1 + qL (Fm / F0-1)). Y (NO) laskettiin Kramerin ja muiden tietojen perusteella. yhtälöllä: Y(NO) = 1/. Kuvantamisprosessissa saadaan biologisesta materiaalista pseudovärikuvia (indeksoitu värimoodi), joiden resoluutio on 640 × 480 pikseliä ja jotka vastaavat fysikaalisten mittojen kuvakenttää 32 × 24 mm.
C3-ja CAM-kasvien tartunnan saaneet lehdet otettiin CHL: ää varten fluoresenssianalyysissä inokulaatiohetkellä ja 3, 6, 9, 24, 32, 48, 54 ja 72 tuntia rokotuksen jälkeen. CHL a-fluoresenssi mitattiin 2. lehtiparin kiinteille lehdille kolmesta C3-ja CAM-kasvista, jotka tulivat kahdesta itsenäisestä kasvinviljelyn toistosta. Jokainen analysoitavaksi otettu lehti seulottiin erikseen kaikkina ajankohtina (Kuva. 1). Edustava yhdeksän kuvan sarja(yksi kutakin aikapistettä kohti) Y(NO), Y (NPQ) ja FV/Fm C3-ja CAM-jääkasveille on käsitelty mittaamaan näiden parametrien muutoksia valitulla alueella, jossa lehtien terä seulotaan ajan myötä. Vertailun vuoksi Y(NO), Y (NPQ) ja Fv/Fm-keskiarvot koko kuviossa kuvatulta lehtialueelta. Saatiin 2. Y(NO) – kuvilla saatiin esimerkkejä kuvan kohdistuksen tuloksista ja bioottisen stressin lisääntymisen spatiotemporaalisen kuvaamisen mittaamisesta lehdissä ehdotetulla menetelmällä.
esimerkki kuvia quantum saanto sääntelemätön energian hajoamista yhteisen ice kasvi lehdet. Sovelletaan C3(A–d)–ja CAM (e-h) – fluoresenssiparametreihin PSII Y (NO). Lehtikatkelma sisältää taudinaiheuttajan inokulaatiokohdan ja stressin leviämisen oireet
esimerkkikuva C3 common ice plant Leafista valikoiduilla kiinnostavilla alueilla. Käsin tehdyt valinnat firmware-editorissa kattavat tartunnan saaneet (1), oireettomat (2) sekä keskivartalon alueet (3)
kuvan kohdistus
Pam-kuvatiedon keruun mekanismi aikajärjestyksessä johtaa lehtikappaleen liikkumiseen näkökentässä yksittäisten aikapisteiden välillä(Kuva. 1). Lehtiasennon muutoksesta johtuen esimerkiksi keskiruumiin ja inokulaatiokohtien sijainti ja suunta ovat erilaiset. Lisäksi reskaloinnin vaikutusta voidaan havaita. Jotta stressin leviäminen voitaisiin arvioida asianmukaisesti, kuvakentät olisi synkronoitava keskenään olettaen, että yksi niistä on viite (kiinteä) kuva ja loput kuvat on yhdenmukaistettava kiinteän kuvan kanssa. Tämä lähestymistapa tunnetaan lääketieteellisessä kuvantamisessa kuvantamismenetelmänä . Fluoresenssikuvien perusrekisteröintitehtävä on löytää ”samankaltaisuus” – muunnos, joka koostuu asianmukaisesta pyörimisestä, kääntämisestä ja skaalauksesta. Lehtien pinnan taivutus ja lehtien taittuminen rasituksesta tapahtuu vain yksittäiskuvien paikallisilla alueilla,ja niillä on vähäinen merkitys globaalin kuvan kohdistumiselle. Niitä voidaan kompensoida rekisteröinnin jälkeisessä vaiheessa epälineaarisilla muunnoksilla, kuten ohutlevyillä, pintajänteillä ja demonikartoituksilla .
fluoresenssikuvat otetaan kuvasarjana ennalta määrätyin aikavälein suunnilleen samalta lehtialueelta. Pidettyjen kuvapinojen tyypilliset elementit edustavat pääasiassa lehtisuonia. Ne ovat kuitenkin huonosti erotettavissa kuvasisällöstä johtuen rajallisesta kontrastista sekä Pam-kuvantamisen värimuotista. Sisältöä visuaalisesti hallitsevat stressioireiden alueet voivat muuttua kuvien välillä yhdessä sarjassa. Tällaisessa tilanteessa automaattinen rekisteröinti epäonnistuisi.
Suosituimmat automaattiset menetelmät perustuvat kuvan intensiteetin vertailuun joidenkin korrelaatiomittareiden kanssa (intensiteettiin perustuvat menetelmät) tai perustuvat siihen, että kiinteistä ja liikkuvista kuvista etsitään valittujen kuvaominaisuuksien, kuten pisteiden, viivojen ja ääriviivojen vastaavuutta (ominaisuusperusteiset menetelmät) . Mikään näistä lähestymistavoista ei mahdollista yhteisen jääkasvin Pam-fluoresenssikuvien asianmukaista rekisteröintiä, mitä on tarkistettu ja esitetty täydentävien materiaalien esimerkeissä (Lisätiedosto 1). Siinä esitetyt tulokset vahvistavat, että epäonnistuneiden automaattisten rekisteröintien syynä on kuva-alueiden voimakas tummuminen, jossa on säilyneitä piirteitä, johtuen lehtikudoksen tartunnan aiheuttamista kuvan sisällön dynaamisista muutoksista. Suosittuja menetelmiä testattiin sekä Rekisteröinninarvioijalla Matlabissa että Fidžin ympäristössä .
Pam-kuvanrekisteröinnin algoritmi suunniteltiin Matlab-ympäristössä asiantuntijan käsin valitsemien ohjauspisteiden perusteella. Kunkin kuvan vastaavien ohjauspisteiden asettamiseksi käytettiin Funktion cpselect of Control Point Selection Tool from Image Processing Toolbox-toimintoa. Kuvia muokattiin pareittain, mukaan lukien kiinteä kuva ja yksi liikkuva kuva. Ensimmäinen heti taudinaiheuttajan inokulaation jälkeen hankittu kuva oletettiin kiinteäksi (viite) kuvaksi. Vuorovaikutteisen pistekartoituksen avulla käyttäjä voi osoittaa paitsi hermojen näkyviä ääriviivoja, myös muita tyypillisiä elementtejä, kuten pistospistettä, taudinaiheuttajan leviämiskohtia sekä ilmeisimpiä epidermaalisia virtsarakon soluja (Kuva. 3).
asiantuntijan valitsemat Kontrollipisteet. Esimerkki y (NO) kuvat NOKKAJÄÄKASVIN lehtikappaleesta: kiinteä (referenssikuva) kuva, B liikkuva kuva mukautettava kiinteän kuvan kanssa
useat kontrollipisteparit, jotka on sijoitettu mahdollisimman laajalle Lehtikuvan pinnalle, riittävät kohdistamaan saman lehden kuvat oikein karkeasti jäykäksi kappaleeksi katsottuna. Kontrollipisteiden laajempi jakaantuminen parantaa kuvan täsmäytyksen herkkyyttä, mutta sitä rajoittavat kohdistusmuutoksen jälkeen rajattu kuvakenttä ja valitun pisteen tarkka sijainti lehden terässä. Tällaisella kuvan kohdistuksella affiinimuunnos suoritettiin kuvankäsittelyn työkalupakkiin sisältyvällä fitgeotrans-toiminnolla. Tämä muunnos on rajoitettu ”samankaltaisuuteen” (joka koostuu vain kääntämisestä, pyörimisestä ja samankaltaisuudesta), koska Pam-fluorometrin kohtaus näytti siltä, ettei se ollut kallellaan. Liikkuva kuva sovitettiin kiinteään kuvaan funktion imwarp avulla. Graafinen kuvitus rekisteröinti algoritmi sisältyy Fig. 4.
affiinin ja valinnaisen B-spline-rekisteröinnin lohkokaavio sovelletaan fluoresenssi PAM-kuviin. \(\left\) – kiinteän kuvan ohjauspisteiden vektori \(\left^{\left (k \right)}\) – k-TH liikkuvan kuvan ohjauspisteiden vektori \(\left^{{\left ({k^{\prime } } \right)}}\) – k-th liikkuvan kuvan ohjauspisteiden vektori B-spline-rekisteröinnin jälkeen
tartunnan eri vaiheissa olevien lehtien pinta voi olla paikallisesti aaltoileva tai ryppyinen, kuten analysoiduissa Pam-fluorometrikuvissa merkityllä alueella (Kuva. 5a, b), mikä muoto voi mahdollisesti vaikuttaa taudinaiheuttajan leviämisilmiön asianmukaiseen analyysiin. Se tarkoittaa, että geometriseen muuntamiseen perustuva affiinirekisteröintimenetelmä ei välttämättä riitä vastaamaan fluoresenssi PAM-kuvia joissakin tapauksissa, joissa lehdet ovat ilmeisesti näkyvissä epälineaarisissa muodonmuutoksissa. Siksi kirjoittajat ehdottavat kaksivaiheista rekisteröintimenetelmää, jossa affiinista jäykkää rekisteröintiä seuraa epälineaarisia muodonmuutoksia vähentävä B-spline-rekisteröinti.
esimerkki affiini ja B-spline rekisteröinneistä C3 common ice plant leaf image. a Y (NO) Kuva Pam-hankinnan jälkeen, b kuva jäykän affiinimuunnoksen jälkeen nuolilla, jotka edustavat vuorovaikutteisesti asetettuja siirtovektoreita, joita käytetään rekisteröinnin toisessa vaiheessa, ja C lopullinen muoto kontrollipistepohjaisen B-spline-rekisteröinnin jälkeen
ei-jäykän rekisteröintityypin valinnassa hyödynnetään sitä, että tavalliset jääkasvin lehdet edustavat hieman joustavaa materiaalia ja pienet taivutusvoimat pitävät tasaisia muutoksia lehtien pintaprofiilissa. Tämän rekisteröinnin muutoksen erityispiirre on, että kuvan muodonmuutoskentän vektorit on asetettava vuorovaikutteisesti. Tätä tarkoitusta varten algoritmiin liitettiin oma vektorikenttäeditori. Vain harvoja liikkuvan kuvan siirtovektoreita on täsmennettävä, jotta voidaan havaita lehden pinnan paikalliset ja sileät muodonmuutokset kuten kuvassa. 5B.
B-spline Rueckertin algoritmi valittiin rekisteröinnin toiseen vaiheeseen. Sen toteutus on saatavilla Matlab Central File Exchangessa Dirk-Jan Kroon Spline Registration Toolbox-Työkalupakkina .
B-spline-rekisteröintimenettely koostuu kahdesta perusvaiheesta:
-
alustetaan ruudukko G kuvapisteitä, jotka ovat tasaisesti jakautuneet kuvapinnalle kaikkien muodonmuutoskenttävektorien ollessa nollassa, ja lasketaan sitten tiheä vektorikenttä T ruudukon g muodonmuutoksista kuution B-spline interpoloimalla käsin asetettuja ohjauspisteen siirtovektoreita \(\left^{\left (k \right)}\). Sekä ruudukko että siihen liittyvä muunnoskenttä T tarkennetaan iteratiivisesti 4 vaiheessa ruudukon solmuvälin vähentämiseksi. Muunnos T valmistetaan spline Registration Toolboxin toiminnolla point_regnation.
-
B-spline muuttaa kaikki pikselien sijainnit ja värikomponenttien kaksikuutioiset interpolaatiot liikkuvassa (affiinirekisteröidyssä) kuvassa \(I_{M}\) spline-tasoitetun muodonmuutoskentän mukaisesti.
Kuvan rekisteröintitarkkuus
ehdotetun kuvan kohdistuksen tarkkuus suoritettiin neliöjuuren keskiarvolla (RMS), kun poikkeamat olivat n = 15 Kontrollipistettä kuvassa. 3. Jokaisen kiinteän kuvan ohjauspisteen \(P_{i}\) siirtymä, joka on arvioitu liikkuvan kuvan tapauksessa kohdistuksen kanssa ja ilman sitä, on esitetty kuvassa. 6 vektoreina \(R_{i} P_{i} =\Delta r_{i}\) ja \(Q_{i} P_{i} = \Delta q_{i}\). Kaikkien kontrollipisteiden RMS-siirtovirheet yhdessä kuvassa kahden tapauksen osalta ilmaistaan Eq: na. (1) muodossa \(\Delta r_{\text{rms}}\) ja \(\Delta q_{\text{rms}}\).
kuvituskuva Pam-kuvien affiinirekisteröinnin virhearvioinnista. \(P_{i} ,\;i = 1, \ldots ,N\)—ohjauspiste kiinteässä kuvassa \(I_{F}\), \(Q_{i}\)—ohjauspisteen kartoitus \(p_{i}\) liikkuvassa kuvassa \(I_{M}\), \(R_{i}\)—ohjauspisteen kartoitus \(P_{\text{i}}\) rekisteröinnin jälkeen, \(R_{i} P_{i} =\Delta r_{i}\)—ohjauspisteen siirtymisvirhe \(P_{\text{I}}\) rekisteröinnin jälkeen
jäännössiirtymän \(\delta_{rms}\) prosenttiosuus affine-tyypin rekisteröinnin jälkeen voidaan arvioida yhtä kuvaa kohti Eq: n mukaan. (2).
arvioidut affiinirekisteröintivirheet on lueteltu taulukossa 1. Alkuperäiset siirtymät \(\Delta q_{\text{rms}}\), jotka vaihtelevat 3,01-7,09 mm, pienenevät ”samankaltaisuuden” rekisteröinnin jälkeen 0,45-1,71 mm: n \(\Delta r_{\text{RMS}}\) testatun C3-laitoksen osalta. CAM-laitoksen samat parametrit ovat \(1.90 \div 5.69\; {\text{mm}}\) \(\Delta q_{\text{RMS}}\) ja \(0.41 \div 1.53\; {\text{mm}}\) \(\Delta r_{\text{RMS}}\). Kun \(\delta_{rms}\) lasketaan sekä C3-että CAM-kuvasarjojen keskiarvoksi, se on vastaavasti noin 21% ja 23%. Jääkasvin lehtikuvista ilman rekisteröintiä saadut fluoresenssiparametrien Y(NO), FV/Fm ja NPQ arvot haetaan yhteensopimattomista lehden osista, eikä niitä voida ottaa huomioon (KS.lisätiedosto 2).
B-spline-rekisteröintikartoituksessa muunnosvirhe määritellään kahdella komponentilla. Ensimmäinen niistä on kuviossa esitetty post-rekisteröintisiirtymä \(\Delta r_{i} = R_{i} P_{i}\). 7a, jossa \(R_{i}\) arvioidaan ekv. (3) alueen \(a_{i}\) centroidina\ (\bar{P}\).
missä \(I_{R} \left (P \right) \in \left\) merkitsee rekisteröidyn ohjauspistekuvan voimakkuutta pikselin p kohdalla, \(\left| {a_{I} } \right|\)—sumeneva alue. Virheen toinen komponentti määritellään standardipoikkeaman säteellä \(\rho_{i}\), jonka voimakkuus jakautuu kunkin ohjauspisteen ympärille \(R_{i}\) Eq: ssa kuvatulla tavalla. (4).
missä \(\left\ / \cdot \right\/\) tarkoittaa vektorin Euklidista normia pisteiden p ja \(\bar{p}\) välillä kuvatasossa. Kohdistetun kontrollipisteen hämärtyminen \(r_{i}\) johtuu siitä, että epälineaarinen rekisteröinti käyttää bikubista interpolointia äärellisessä erotuskyvyssä G. Tämä vaikutus mitattiin kokeellisesti suorittamalla tietty B-spline-muunnos kuvassa, joka on rakennettu valkoisista kontrollipisteistä mustalla pohjalla. Taulukko 2 sisältää N = 9: n esimerkkisiirtymäkenttävektorien magnitudit \(\Delta q_{i}\) Kuvassa. 5 b. Spline-rekisteröinnin jälkeisten vektorikartoitusvirheiden magnitudit \(\Delta r_{i}\) mitataan alueella \(a_{i}\) arvioitujen kiinteiden kontrollipisteiden \(p_{i}\) ja rekisteröityjen pisteiden \(r_{i}\) keskipisteiden välillä. Kaikki testatut \(\Delta r_{i}\) arvot ovat pikseliresoluution alapuolella, joka on \(50\;\upmu{\text{m}}\), ja ne voidaan jättää huomiotta—pyöristettynä arvoon 0. Tämä tarkoittaa ohjauspisteiden tarkkaa sijoittelua spline-muunnoksella. Taulukossa 2 esitetty sumenevan alueen keskihajonta \(\rho_{i}\) kaksinkertaistumisen jälkeen voi olla kontrollipisteen sumennuksen mitta. Sitten se vaihtelee suunnilleen \(24\; {\text {to}}\;63\;\upmu{\text{m}}\), mikä vastaa yhden pikselin sumennusta. Näin tämä muunnos mahdollistaa y(NO) – muutosten kunnollisen muodon palauttamisen fluoresenssikuvassa.
Pam-kuvien B-spline-kuvantamisvirheen selitys. a kontrollipisteen sijaintikartoituksen epäsuhta rekisteröinnin aikana, b spline-rekisteröidyn kontrollipisteen kuvan intensiteettijakauma, \(P_{i} ,\;i = 1, \ldots ,N\)—kiinteän kuvan ohjauspiste \(I_{F}\), \(Q_{i}\)—liikkuvan kuvan ohjauspisteen \(P_{i}\) vastine, \(R_{i}\)—ohjauspisteen kartoitus \(p_{i}\) rekisteröinnin jälkeen, \(R_{i} P_{i} =\ Delta r_{i}\)—siirtovirheen mitta kontrollipisteen kartoittamiseksi \(P_{i}\), \(a_{I}\)—blurrattu alue \(R_{I}\), joka vastaa kontrollipistettä \(P_{I}\), \(\rho_{i}\)—\(R_{I}\) sumennuksen standardipoikkeaman säde
stressin etenemisen mittaus
data-analyysissä käytetään erityistä editorityökalua Pam-kuvien pinon manipulointiin niiden rekisteröinnin jälkeen. Pääeditorifunktion avulla voidaan piirtää kaksi tiedonkeruuviivaa \(L_{1} \;{\text{ja}}\;l_{2}\), joiden pituus on yhtä suuri (kuva. 8), joka voidaan havaita ja saatavilla tahansa kuvan pinosta. Tarkastellussa kokeessa ensimmäinen rivi \(l_{1}\) alkaa inokulaatiokohdasta \(s_{1}\), jossa jännityskerroin kohdistetaan lehtikudokseen hetkellä t ja asetetaan suunnilleen jännityksen laajenemisen suuntaan. Toinen rivi \(l_{2}\) on sijoitettu keskivartaloa pitkin, jossa havaittu stressin vaikutus ajan mittaan oli aina rajallinen ja fluoresenssiparametreissa esiintyy vähäisiä muutoksia. Viivojen pitäisi sopia täysin kuvan yhteyteen.
mittausalueet y (NO) kuvia yhteisen jään kasvi lehdet jälkeen tietokoneen kohdistus. Mittauspisteet osoittavat: 1) mesofylli inokulaatiokohdassa, 2) mesofylli vammoitta, 3) keskiruumis inokulaatiokohdan lähellä. Mittausviiva (L1) suuntautuu jännityksen etenemissuuntaan mesofyllin sisällä ja viiva (L2) sijaitsee keskiruumiin varrella. Pisteistä (S1) ja (S2) aloitetut radat
pisteviisaan mittauksen lisävaihtoehto on mahdollinen, jos kolme pientä erilaista pyöreää aluetta 10 pikselin säteellä sijoitetaan interaktiivisesti näkökenttään(Kuva. 8). Niiden pitäisi kuulua lehtialueille, joiden fluoresenssiparametrit muuttuvat ajan myötä. Kaikkien rekisteröityjen pikselien arvot lasketaan keskiarvona näiden alueiden sisällä.