Klemitsoli ja serotoniinin signaloinnin modulaattorit tukahduttavat kohtauksia Dravetin oireyhtymässä

Abstrakti

Dravetin oireyhtymä on katastrofaalinen lapsuusiän epilepsia, johon liittyy varhaisia kohtauksia, kielen ja motorisen kehityksen viivästymistä, unihäiriöitä, ahdistuneisuuden kaltaista käyttäytymistä, vaikeaa kognitiivista vajetta ja suurentunut kuolleisuusriski. Se johtuu pääasiassa hermojänniteaktivoitua natriumkanavaa koodaavan SCN1A-geenin de novo-mutaatioista. Seeprakala, jolla on SCN1A-homologue-mutaatio, kertoo spontaanin kohtausaktiivisuuden ja jäljittelee Dravetin oireyhtymässä havaittuja kouristavia käytösliikkeitä. Tässä osoitamme, että seeprakalan scn1-mutanttien lääkeainekirjastojen fenotyyppinen seulonta tunnistaa nopeasti ja onnistuneesti uusia hoitomuotoja. Osoitamme, että klemitsoli sitoutuu serotoniinireseptoreihin ja sen epilepsialääkitystä voidaan jäljitellä serotoniinin signalointireitteihin vaikuttavilla lääkkeillä, kuten tratsodonilla ja lorcaseriinilla. Samanaikaisesti näiden seeprakalahavaintojen kanssa hoidimme viittä lääketieteellisesti hankalaa Dravetin oireyhtymää sairastavaa potilasta kliinisesti hyväksytyllä serotoniinireseptoriagonistilla (lorcaserin, Belviq®) ja havaitsimme lupaavia tuloksia kohtaustiheyden ja/tai vakavuuden vähenemisessä. Löydöksemme osoittavat nopean polun prekliinisestä löydöstä seeprakalasta, kohteen tunnistamisen kautta mahdollisiin kliinisiin hoitoihin Dravetin oireyhtymässä.

Johdanto

katastrofaalisiksi luokitellut lapsuuden epileptikot liittyvät usein geenimutaatioon. Näistä Dravetin oireyhtymä on yhdistetty yli 600 de novo-mutaatioon yhdessä geenissä, SCN1A: ssa (Catterall et al., 2010; Escayg et al., 2010). Dravetin oireyhtymästä kärsivillä lapsilla esiintyy kohtauksia, jotka alkavat jo 6 kuukauden iässä, kielen ja motorisen kehityksen viivästyminen, unihäiriöt, ahdistuneisuuden kaltainen käyttäytyminen ja vaikea kognitiivinen vaje (Dravet, 2011). Myös autismikirjon häiriön oireita on raportoitu (Li et al., 2011) ja tässä populaatiossa selittämättömän äkkikuoleman riski epilepsiaan (SUDEP) on arviolta 15 kertaa suurempi kuin muissa lapsuuden epileptikoissa (Kearney, 2013). Saatavilla olevat epilepsialääkkeet eivät tarjoa riittävää kohtausten hallintaa, eivätkä resektiiviset neurokirurgiset toimenpiteet ole yleisesti vaihtoehto. Dravetin oireyhtymän uudet hoidot ovat edelleen tärkeä täyttämätön tarve huolimatta jonkin verran tehosta kannabidiolin (Epidiolex®) ja stiripentolin (Diacomit®) rajallisissa kliinisissä tutkimuksissa, jotka voivat liittyä kognitiivisiin tai ruokahalun turvallisuuteen liittyviin huolenaiheisiin (Perez et al., 1999; Chiron ym., 2000; Detyniecki et al., 2016; Devinsky ym., 2016).

lähes 85%: lla Dravetin oireyhtymää sairastavista potilaista on havaittu mutaatioita SCN1A-geenissä, joka koodaa jännitetyhjennetyn natriumkanavan huokosia muodostavaa α-alayksikköä (Nav1.1) (Dravet, 2011). Nav1.1-kanavat edistävät neuronaalisten kalvojen nopeaa depolarisaatiota aktiopotentiaalin syntymisen aikana (Hodgkin et al., 1952). Heterotsygoottiset hiiret, joilla on Nav1.1: n toimintakyvyttömyysmutaatio, kehittävät spontaaneja ja lämpötilaherkkiä kohtauksia jo varhain, ja kuolevat ennenaikaisesti syntymän jälkeisen päivän 25 tienoilla (Yu et al., 2006; Oakley ym., 2009; Cheah et al., 2012). Akuutit Elektrofysiologiset tutkimukset näillä ja niihin liittyvillä Scn1a-puutteellisilla hiirillä viittaavat natriumvirran tiheyden vähenemiseen ja siihen liittyvään ampumisaktiivisuuden vähenemiseen GABA: ta ilmentävien inhibitoristen neuronien (mutta ei eksitatoristen pääsolujen) alipopulaatiossa, joka huipentuu synaptisen inhibition vähenemiseen ja verkon yliexcitabiliteettiin (Yu et al., 2006; Kalume et al., 2007; Han et al., 2012). Tämä’ interneuronopatia ’ hypoteesi on yhdenmukainen muiden katastrofaalisten lapsuuden epileptikkojen kanssa ja vahvistettiin hiirillä, joissa Scn1a poistettiin selektiivisesti parvalbumin – tai somatostatiinia ilmentävistä interneuronin alapopulaatioista (Dutton et al., 2013; Tai et al., 2014). Autistista käyttäytymistä raportoitiin myös näillä hiirillä (Han et al., 2012). Mielenkiintoista, alustavat tutkimukset ihmisen eksitatorinen ja inhibitorinen neuronien johdettu indusoitu pluripotent kantasoluteknologian kaksi potilasta Dravetin oireyhtymä raportoitu alijäämiä jännite-aktivoitu natriumvirta molemmille solutyypeille, mikä viittaa joko homeostaattinen kompensointi varhaisen menetys-of-toiminta kriittisen aivojen spesifinen natrium kanava, tai muita mekanismeja edistää epileptinen fenotyyppi havaittu näillä potilailla (Jiao et al., 2013; Liu et al., 2013).

vaikka hiirten ja ihmisen indusoimat pluripotentit kantasoluista johdetut neuronit auttavat ymmärtämään Dravetin oireyhtymän taustalla olevaa patofysiologiaa, nämä järjestelmät eivät sovellu hyvin uusien hoitojen nopeaan tunnistamiseen näiden mallien vaihtelun ja kvantitatiivisten mittausten toistettavuuden vuoksi. Koska seeprakalat ovat ihanteellinen selkärankaisten mallijärjestelmä pienten molekyylien fenotyyppipohjaisten näyttöjen suorittamiseen (MacRae et al., 2015), ja ovat hyväksyttäviä geneettisiä manipulaatioita, olemme keskittyneet ponnistelumme seeprakala natrium kanava mutantti. Seeprakalan mutantit, joissa oli funktion menettänyttä missense-mutaatiota SCN1A-ortologiassa, scn1Lab, tunnistettiin mutageeniseulonnassa (Schoonheim et al., 2010). Koska esivanhempien koko genomin päällekkäisyys, seeprakala scn1Lab mutantit ovat haploinsufficient Nav1.1 ja analogisia Scn1a+/− hiirille tai Dravetin oireyhtymää sairastaville potilaille. Konvulsiivista käyttäytymistä ja jaksoja lyhyt interictal ja pitkäaikainen polyspike ictal kaltainen elektrografinen vastuuvapauden havaitaan mutantti toukat jo 3 päivää hedelmöityksen jälkeen (dpf) etenemistä voimakkaampia kohtauksia fenotyyppejä välillä 4 ja 7 dpf (Baraban et al., 2013; Hong et al., 2016). Mutantit toukat kuolevat ennenaikaisesti, niillä on metabolisia häiriöitä (Kumar et al., 2016), ja ovat vastustuskykyisiä monille epilepsialääkkeille (AEDs) (Dinday et al., 2015). Kuten Dravetin oireyhtymän kliinisessä hoidossa, kohtausaktiivisuutta voidaan jonkin verran heikentää valproaatilla, bentsodiatsepiineilla, bromideilla, stiripentolilla sekä ketogeenisellä ruokavaliolla (Baraban et al., 2013). Scn1Lab-mutanttiseeprakalan toukkien ja kaksivaiheisen fenotyyppipohjaisen seulontastrategian avulla olemme seuloneet yli 2300 yhdistettä. Klemitsoli, ensimmäisen sukupolven histamiinireseptorin (H1) antagonisti, tunnistettiin voimakkaaksi käyttäytymis-ja elektrografisen kouristuskohtauksen estäjäksi (Barabaani ym., 2013). Antihistamiinit ovat kuitenkin vasta-aiheisia lasten epilepsiapotilailla (Miyata et al., 2011)ja seeprakalan H1-reseptorin analogi osoittaa alle 50% samankaltaisuutta ihmisen kanssa (Peitsaro et al., 2007). Tässä käytämme prekliinisiä seeprakalamalleja osoittaaksemme, että klemitsolilla, mutta ei antihistamiineilla, on epilepsialääkitystä. Ligandien sitoutumisen ja scn1-mutanttiseeprakalan kohdennettujen lisäseulontojen perusteella tunnistimme useita serotoniinin (5-HT) modulaattoreita tehokkaiksi tukahduttamaan kohtauksia, mukaan lukien kaksi (trazodoni ja lorcaserin) FDA: n hyväksymää yhdistettä. Lorcaserin (Belviq®) määrättiin erityiskäyttöohjelmassa lapsille, joilla on Dravetin oireyhtymä, ja se johti vähentyneeseen kouristusaktiivisuuteen joillakin potilailla. Ehdotamme, että 5-HT-merkinantojärjestelmän mukauttaminen on uudenlainen terapeuttinen toimenpide tähän katastrofaaliseen lapsuusiän epilepsiaan.

materiaalit ja menetelmät

seeprakalan ylläpito

kohtausten seuranta

5 dpf: n kohdalla yksittäiset seeprakalan toukat pantiin yhteen kaivoon, jossa oli kirkas, tasapohjainen 96-kuoppainen mikrotaso, joka sisälsi alkioliuosta. Toukat valittiin satunnaisesti, koska sukupuolen määrittäminen ei ole tässä vaiheessa mahdollista. Mikromuovit laitettiin daniovisionin liikkeenseurantalaitteen sisään ja totutettiin 20 minuutiksi huoneenlämpöön. Vetokäyrät saatiin jokaiselle kaivolle 10 minuutin tallennusjakson aikana käyttäen Daniovision-järjestelmää, jossa on ethovision XT-ohjelmisto (DanioVision, Noldus Information Technology); kynnystunnistusasetukset taustoja tummempien kohteiden tunnistamiseksi optimoitiin jokaista koetta varten. Kohtausten pisteytyksessä käytettiin pentyleenitetratsolin aiheuttamille kohtauksille määritettyä kolmivaiheista asteikkoa (Baraban et al., 2005): vaihe 0, ei lainkaan tai hyvin vähän uintiaktiivisuutta; Vaihe I, lisääntynyt, lyhyet uintijaksot; vaihe II, nopea ’pyörremäinen’ kiertävä uintikäyttäytyminen; ja vaihe III, paroksismaalinen kokovartalon clonus-tyyppinen kouristukset ja lyhyt asennon menetys. Luonnonvaraiset kalat pisteytetään yleensä vaiheessa 0 tai I. Havaintoaloilla analysoitiin kuljettu matka (millimetreinä) ja keskimääräinen nopeus (millimetreinä sekunnissa). Kuten raportoitu aiemmin (Winter et al., 2008; Baraban et al., 2013), velocity changes were the most sensitive assay of script behaviour.

elektrofysiologisissa tutkimuksissa seeprakalan toukat halvattiin hetkeksi α-bungarotoksiinilla (1 mg/ml) ja immobilisoitiin 1, 2% agaroosissa., 2005; Hong et al., 2016). Kullekin kalalle saatiin 1 kHz: n taajuudella 10-30 minuutin pituiset agaroosiin upotetut paikalliset kenttäpotentiaalitallennussessiot. IZAP-järjestelmä (Hong et al., 2016) käytettiin seeprakalan pitkäaikaiseen ei-invasiiviseen seurantaan halvaannuttavan aineen puuttuessa. Järjestelmä vangitsee itsenäisesti useita seeprakalan toukkia mikrofluidikammioissa olevien integroitujen pintaelektrodien alle. scn1Lab-toukkia seurattiin jatkuvasti 5 tunnin ajan.Sähkökenttäpotentiaalia kirjattiin jatkuvasti 1 kHz: n kohdalla, lukuun ottamatta 2-3 minuutin taukoja väliaineen vaihtamiseksi yhdisteen käsittelyssä ja pesussa. Tallennetut tiedot analysoitiin MATLABin avulla kenttäpotentiaalikäyriä ja taajuusanalyysiä varten.

Yhdistelmäkirjaston seulonta

lääkeaineiden seulontaan tarkoitetut yhdisteet ostettiin Selleck Chemicalsilta ja ne toimitettiin 10 mM: n DMSO-liuoksina. Seulontaan käytettiin Selleckin Ion Channel Ligand Library (Catalogue #L2700), Gpcr Compound Library (Catalogue #L2200) ja räätälöity 5-HT moduloiva kirjasto. Kirjastoyhdisteet on lueteltu täydentävässä taulukossa 1. Kaikissa lääkeainekirjaston näytöissä yhdisteitä koodattiin ja kokeita tekivät tutkijat, jotka olivat sokeita yhdisteen luonteelle. Edellä kuvatulla tavalla saatiin mutanteista alkioliuoksissa liikkumiskäyttäytymisen lähtötason tallenteet; tämän jälkeen saatiin toinen liikkumiskäyrä, kun liuos oli vaihdettu testiyhdisteeseen ja tasapainotusaika oli 20 minuuttia. Liikkumistutkimuksissa käytettävät yhdisteet liuotettiin alkioaineisiin, ja niiden pitoisuus oli 250 µM, jolloin lopullinen DMSO-pitoisuus oli 2,5%.

positiivisen osuman määrittämisen kriteerit olivat seuraavat: i) keskinopeuden lasku ≥40% ja ii) kohtauskäyttäytymisen väheneminen vaiheeseen 0 tai vaiheeseen I liikkumiskokeessa vähintään 50%: lla testikaloista. Kunkin locomotion-määrityksessä positiiviseksi hit-arvoksi luokitellun testiyhdisteen toksisuus arvioitiin visualisoimalla se suoraan stereomikroskoopilla 90 minuutin lääkealtistuksen jälkeen. Toksisuus (tai kuolleisuus) määriteltiin siten, että vähintään 50%: lla testikaloista ei ollut näkyvää sydämen sykettä tai liikettä ulkoisen stimulaation seurauksena. Yliyksityisyys määriteltiin yhdisteeksi, joka aiheuttaa ≥40%: n uintinopeuden ja/tai vaiheen III kouristusaktiivisuuden vähintään 50%: ssa testikaloista. Primaarisessa locomotion-näytössä havaitut positiiviset osumat vahvistettiin locomotion screening-menetelmällä toisessa määrityksessä, jossa käytettiin riippumatonta seeprakalaa. Yhdisteet ostettiin sitten erikseen Sigma-Aldrichilta ja testattiin locomotion-seulontamenetelmällä kolmannen kerran riippumattomalla seeprakalan kytkimellä. Lääkkeitä, jotka vähensivät keskimääräistä uintinopeutta kynnyksen yläpuolella ja olivat myrkyttömiä kolmessa itsenäisessä locomotion-määrityksessä, analysoitiin edelleen elektrofysiologisella määrityksellä. Elektrofysiologisissa tutkimuksissa lääkkeet vahvistettiin ensin 250 µM: n pitoisuuksina locomotion assay-menetelmällä, minkä jälkeen sama seeprakala arvioitiin paikallisen kenttäpotentiaalitallennuksen avulla. Kaikki seulonnat tehtiin koodatuilla yhdisteillä ja tutkijat analysoivat ne sokaistuneina yhdisteen identiteetille.

fylogeneettinen analyysi

fylogeneettinen analyysi ihmisen HTR2-ja seeprakalan Htr2-proteiinisekvensseistä suoritettiin PhyML-ohjelmistolla SH: n kaltaisilla todennäköisyyssuhdetestiparametreilla (http://www.phylogeny.fr/) (Dereeper et al., 2008). Proteiinisekvenssejä saatiin Ensemblin ihmisen HTR2A: sta (ENST00000542664), HTR2B: stä (ENST00000258400), HTR2C: stä (ENST00000276198) ja seeprakalan htr2aa: sta (ENSDART00000141502), htr2ab: sta (ENSDART00000150982), htr2b: stä (ensdart00000104569), HTR2CL1 (ENSDART00000024191) sekvenssit.

kvantitatiivinen reaaliaikainen mRNA-ekspressioanalyysi

seeprakalan htr2-geenien ekspressiotasot tutkittiin käyttäen yhdistettyä RNA: ta 25: stä villin tyypin tai scn1Lab-homotsygoottisen mutantin toukista saadusta päästä tai hännästä ja yksittäisten villin tyypin aikuisten seeprakalojen aivoista leikeltyä. Kokonais-RNA uutettiin TRIzol® – reagenssilla (Invitrogen) valmistajan protokollan mukaisesti ja käsiteltiin Dnase I: llä (Invitrogen). Puhdistettu mRNA siirrettiin cDNA: han käyttäen SuperScript®III-Alkujuostesynteesijärjestelmää (Invitrogen)oligo(dT) 20: n sekoituksella. Seeprakalan htr2-geenien ja taloudenhoitogeenin eukaryoottisen translaation venymäkertoimen 1 alpha 1, like 1 (eef1a1l1) ekspressiotasot määritettiin StepOne™ – reaaliaikaisella PCR-koneella (Applied Biosystems). Reaktiot suoritettiin 20 µl tilavuuksina 96-kuoppaisilla levyillä käyttäen SYBR®Green Master Mixiä (Applied Biosystems), jossa oli 250 nM aluke ja 3 µl cDNA: ta. Oligonukleotidisekvenssit on lueteltu täydentävässä taulukossa 2. Tiedot analysoitiin kolmesta riippumattomasta kokeesta. Tiedot ilmaistiin Ct-arvoina ja niitä käytettiin ΔCt-arvojen määrittämiseen.

ihmisillä tehdyt tutkimukset

seeprakalamallimme yhdisteiden onnistuneen tunnistamisen ja farmakokinetiikan huomioon ottamisen jälkeen lapsille määrättiin Belviq® (lorcaseriini) erityiskäyttöprotokollan mukaisesti Children ’ s Hospital Coloradossa (IND 125307). Lapset saivat luvan käyttää Belviq® – valmistetta, jos heillä oli SCN1A-mutaatio tai Dravetin syndrooman kliininen diagnoosi ja vähintään kaksi lääkitystä, mukaan lukien stiripentoli joissakin tapauksissa ja pois lukien natriumkanavasalpaajat, eivät tehonneet. Lapsille piti tehdä EKG ja sydämen ultraäänitutkimus lähtötilanteessa ja 6 kuukauden välein valmisteen käytön aikana. Lisäksi heiltä vaadittiin seurantakäyntejä 3 kuukauden välein riittävän kasvun varmistamiseksi sekä mahdollisten muiden sivuvaikutusten arvioimiseksi. Laboratoriokokeita tarvittiin 6 kuukauden välein hematologisia, maksan ja munuaisten toimintakokeita varten. Belviq®—annos aloitettiin 2, 5 mg: lla nukkumaan mennessä ja sitä suurennettiin asteittain viikoittain tarpeen mukaan enimmäisannokseen 10 mg kahdesti vuorokaudessa tai 0, 3 mg/kg/vrk-riippuen siitä, kumpi tapahtui ensin.

Institutional review board sai hyväksynnän taannehtivalle tiedonkeruulle, johon sisältyi suostumuksesta luopuminen. Tiedot poimittiin retrospektiivisestä katsauksesta Children ’ s Hospital Coloradon sähköisiin potilastietoihin, mukaan lukien ikä, kohtaustyypit ja esiintymistiheys ennen ja jälkeen Belviq® – hoidon, haittavaikutukset, Belviq® – annos ja samanaikainen lääkityksen käyttö.

tilastollinen analyysi

tiedot esitetään keskiarvon (SEM) keskiarvona ± keskivirheenä, ellei toisin mainita. Vertailussa kahden ryhmän välillä käytettiin opiskelijan t-testiä. Kun varianssilla ei ollut normaalijakaumaa, käytettiin ei-parametrista Mann-Whitneyn U-testiä. Yksisuuntainen ANOVA joko dunnettin monivertailutestin jälkeen kontrollinäytteen analysoimiseksi tai Holm-Sidak pairwise-monivertailun jälkeen keskiarvojen välillä. Tilastollisesti merkitsevinä pidetyt erot on merkitty tähdellä (*P < 0, 05; * * P < 0, 01).

tulokset

Klemitsolin vaikutus seeprakalan kohtauskäyttäytymiseen

hoidimme scn1Lab-mutanttitoukkia (5 dpf) klemitsolilla pitoisuuksina 30-400 µM ja seurasimme sen jälkeen vaikutusta spontaaniin kohtauskäyttäytymiseen automaattisella liikkumiskyvyn seurantaohjelmalla. Hoitamattomilla scn1Lab-mutanteilla tehtyjen 250 toistetun locomotion control-tutkimuksen perusteella keskimääräisen uintinopeuden pieneneminen ≥40% (>1, 5 × SD) lähtötilanteesta asetettiin positiivisen kouristuskäyttäytymisen tukahduttamisen kynnykseksi. Klemitsoli (Kuva. 1A) oli antiepileptinen vaikutus 300 ja 400 µM (30 min altistus) ja 100 µM (90 min altistus) (Kuva. 1B); pitkäaikaiset altistukset olivat toksisia suuremmilla pitoisuuksilla. Selvittääksemme, voiko klemitsoli estää spontaanin kohtauskäyttäytymisen toisessa seeprakalan scn1-mutantissa, seuloimme mutantti scn1Laa-toukkia (5 dpf) locomotion tracking assayssa. Toukat tunnistettiin vaiheen III kohtauskäyttäytymiseksi (esim.kokovartalokouristukset, nopea uintiaktiivisuus ja lyhyt asennon menetys; Kuva. 1C) vahvistettiin näytteille elektrografisia päästöjä interictal-ja ictal-kaltaisia komponentteja myöhemmissä kenttätallenteita forebrains (Fig. 1D). Keskimääräinen uintinopeus toukilla, jotka tunnistettiin S3: ksi tai ”oletettaviksi scn1Laa-mutanteiksi” seeprakalaksi, oli huomattavasti suurempi kuin sisaruskontrolleilla tai kaikilla testatuilla toukilla (Kuva. 1e); mutantit vahvistettiin scn1Laa-homotsygooteiksi post hoc-PCR: llä. Sitten testasimme lääkkeitä, joiden on aiemmin osoitettu tukahduttavan spontaaneja kohtauksia Dravetin oireyhtymässä ja scn1Lab-mutanteissa (250 µM stiripentolia ja 250 µM diatsepaamia) sekä 250 µM lamotrigiinia (AED, joka voi pahentaa kohtauksia Dravetin oireyhtymässä). Kuten odotettiin, stiripentoli ja diatsepaami, mutta ei lamotrigiini, estivät merkitsevästi scn1laa-mutanttien toukkien kohtauskäyttäytymisen; 250 µM klemitsoli oli myös tehokas tässä määrityksessä (Kuva. 1). Yhdessä nämä tutkimukset osoittavat, että klemitsoli voi estää kohtauskäyttäytymistä kahdessa eri scn1-mutanttiseprakalalinjassa.

Klemitsolin vaikutusmekanismin tutkimus

sekundaarinen lääkeseula, jossa käytetään scn1Lab-mutantteja

tertiäärinen seulonta lupaavien lyijyyhdisteiden tunnistamiseksi clinic

5-HT-reseptorin ilmentyminen seeprakalan toukissa

koska klemitsolilla on merkittävä sitoutumisaffiniteetti HTR2A: han ja HTR2B: hen, ja sekä tratsodoni että lorcaseriini ovat 5-HT-signaalimodulaattoreita, pyrimme vahvistamaan näiden reseptorien ilmentymisen seeprakalassa. Proteiini sekvenssi yhdenmukaistaminen ihmisen ja seeprakala HTR2 reseptorit paljasti evolutionaarisen säilyttämisen kanssa seeprakala ortologues, kanssa Htr2aa ja Htr2ab molemmat näytteillä 59.3% proteiini identiteetti ihmisen HTR2A; ja yksi HTR2B ortologia, Htr2b osoittaa 62.0% proteiini identiteetti. Htr2-ekspressiotason kvantifiointi käyttämällä 5 dpf: n villityypin tai scn1Lab-mutantin toukkien yksittäisiä päitä tai häntiä paljasti rikastuneen htr2a-ja htr2cl1-ilmentymän päässä. Samanlaisia tuloksia saatiin aikuisten villin tyypin seeprakalan aivoista, sillä mutanttitoukat eivät selviä aikuisikään asti (täydentävä viikuna. 4).

kohtaustiheyden harveneminen potilailla, joilla on Dravetin oireyhtymä

Dravetin oireyhtymä on katastrofaalinen lapsuusiän epilepsia ja harvinainen häiriö (http://www.rarediseases.org/), jonka heikentäviä seurauksia ovat mm.vaikea epilepsia, vaikeasti heikentynyt kognitiivinen kehitys ja SUDEP-riski. Prekliiniset tietomme vahvistavat, että 5-HT-signaloinnin modulaatio voi tukahduttaa scn1a: n toimintakyvyttömiin mutaatioihin liittyviä kohtauksia. Koska tunnistetut 5-HT-modulaattorit ovat FDA: n hyväksymiä yhdisteitä, joilla on tunnetut turvallisuusprofiilit, hoito näillä uudelleenkäytetyillä lääkkeillä voi muuttaa kohtaustiheyttä Dravetin oireyhtymää sairastavilla lapsilla. Tämä translationaalinen lähestymistapa kohdistuu harvinaisiin ja tuhoisiin sairauksiin, joille laajamittaiset kliiniset tutkimukset eivät ole mahdollisia (Dunoyer, 2011; Parker et al., 2013).

koska klemitsolia ei tällä hetkellä valmisteta eikä sitä ole saatavilla kliinisessä muodossa ja tratsodoni voi toimia 5-HT-reseptorin agonistina tai antagonistina pitoisuudesta riippuen (Maj et al., 1979; Marcoli et al., 1998), päätimme arvioida Belviq®: n (lorcaserin) erityiskäyttöä off-label-ohjelmassa pienellä Dravet-oireyhtymää sairastavien lasten populaatiolla. Näiden lasten osoitettiin olevan vastustuskykyisiä ainakin viidelle hyväksytylle Aed: lle. Viisi lasta (keski-ikä: 11, 8 vuotta; vaihteluväli: 7-18 vuotta), joilla oli SCN1A: n deleetio, hoidettiin prospektiivisesti Belviq® – valmisteella ja seurattiin pituussuunnassa lastensairaalassa Coloradossa (Aurora, CO). Colorado Medical Institutional Review Board (COMIRB) hyväksyi hoitoprotokollan, ja Dravetin oireyhtymäpotilaiden vanhemmat suostuivat kirjallisesti lapsensa osallistumiseen. Tarkistimme jälkikäteen päiväkirjasta raportoidut atonisten, myoklonisten ja yleistyneiden toonis-kloonisten (GTC) kohtausten, sivuvaikutusten ja samanaikaisten Aed: iden määrät.

Belviq® – hoitoa saavien Dravetin oireyhtymän lasten kliiniset ominaisuudet on esitetty taulukossa 1. Viiden Belviq®-hoitoa saaneen potilaan joukossa ei ollut kuolemia, ja Belviq® oli hyvin siedetty ilman vakavia haittavaikutuksia, jotka aiheuttivat hoidon lopettamisen. Off-label Belviq® – hoidon aikana yksi potilas oli aluksi kohtaukseton 3 viikon ajan, yksi potilas oli kohtaukseton 2 viikon ajan ja kolmas potilas oli 1-2 kohtauksetonta päivää viikossa. Kaikilla viidellä potilaalla kohtausten kokonaismäärä väheni. Yleistyneet toonis-klooniset kohtaukset vähenivät merkitsevästi potilailla 1, 2 ja 3. Potilaan 2 yleistyneet toonis-klooniset kohtaukset vähenivät 90%, eikä pelastuslääkkeitä tarvittu. Kaksi potilasta jatkaa Belviq® – hoitoa ilman kohtaustiheyden lisääntymistä, ja odotetusti yleisin havaittu haittavaikutus oli ruokahalun väheneminen. Yksi potilas aloitti lääkityksen uudelleen toisen kerran ja paransi välivaihetta lyhyen aikaa, minkä jälkeen lääkitys supistui.

Keskustelu

Klemitsoli, 1950-luvulla löydetty ensimmäisen sukupolven antihistamiini (Zierz et al., 1952), todettiin mahdolliseksi terapeuttiseksi Dravetin oireyhtymän hoidossa scn1Lab-mutanttiseeprakalan avulla uudelleen käyttöön otettujen lääkeainekirjastojen seulomiseksi (Baraban et al., 2013; Dinday et al., 2015). Tässä vahvistimme klemitsolin antiepileptisen vaikutuksen käyttämällä toista scn1 seeprakala – mutanttimallia. Klemitsoli metaboloituu valitettavasti nopeasti hiirillä, ja sen puoliintumisaika plasmassa on <10 minuuttia (verrattuna 3, 4 tuntiin ihmisillä) (Nishimura ym., 2013) rajoittaen sen arviointia hiirimalleissa. Onnistuneesti käytetty antihistamiinina (Zierz et al., 1952; Jacques et al., 1960) kanssa akuutti ja krooninen tutkimukset raportoivat Alhainen järjestys myrkyllisyys (Finkelstein et al., 1960), klemitsolia ei enää valmisteta eikä sitä ole tällä hetkellä saatavilla off-label kliiniseen antoon. Koska meillä ei ollut keinoja klemitsolin tehokkaaseen arviointiin prekliinisissä jyrsijämalleissa, käytimme seeprakalaa target-sitoutumiseen (5-HT-reseptoreihin) ja vastaavien lääkkeiden (trazodoni ja lorcaseriini) tunnistamiseen asianmukaisilla turvallisuusprofiileilla, jotka helpottivat nopeaa kääntämistä kliiniseen sovellukseen. On myös kuvattu Belviq®: n (lorcaserin) pakkausmerkinnät lääketieteellisesti hankalille Dravet-oireyhtymäpotilaille.

antihistamiini H1-reseptoriantagonistit ovat yleensä vasta-aiheisia lapsipotilaille (Miyata ym., 2011) ja seulonta nämä lääkkeet vahvistivat kyvyttömyytensä tukahduttaa (ja joissakin tapauksissa pahentaa) kohtauksia scn1 seeprakala. Sitoutumistiedot osoittivat aiemmin tuntemattoman klemitsolin affiniteetin HTR2A-ja / tai HTR2B-reseptoreihin. Myöhemmässä kohdekirjastojen fenotyyppisessä seulonnassa tunnistettiin kaksi 5-HT-moduloivaa yhdistettä, tratsodoni ja lorcaseriini, jotka kykenevät tukahduttamaan käyttäytymis-ja elektrofysiologisia kohtauksia klemitsoliin verrattavalla tavalla. Belviq® (lorcaserin) on FDA: n hyväksymä HTR2C-agonisti, joka on määrätty krooniseen painonhallintaan (Thomsen et al., 2008). Desyrel® (trazodone) on myös FDA: n hyväksymä masennuslääke, jota määrätään yleisesti unihäiriöihin (Mendelson, 2005). Se luokitellaan usein HTR2A-ja HTR2C-käänteisantagonistiksi ja 5-HT-kertymän estäjäksi (Stahl, 2009). Rotilla tehdyt tutkimukset viittaavat kuitenkin siihen, että tratsodoni tai sen metaboliitti meta-kloorifenyylipiperatsiini (mCPP) voi toimia HTR2C-agonistina suuremmilla pitoisuuksilla (Maj et al., 1979; Marcoli et al., 1998). Erityisesti krooninen tratsodonihoito on aiemmin osoitettu suojaavan sähkökonvulsiivisilta aiheuttamilta kohtauksilta hiirillä(Chavan et al., 2010; Borowicz et al., 2012), joka tukee scn1Lab-mutanttiseeprakalan tietoja. Klemitsolin 5-HT-reseptorivälitteinen vaikutus on myös yhdenmukainen viimeaikaisen fenotyyppisen seulan kanssa, jossa serotonergisten signaalien modulaattorit (mukaan lukien klemitsoli) osoitettiin tehokkaaksi hoidoksi Machado-Josephin taudin prekliinisessä mallissa (Teixeira-Castro et al., 2015); ja tutkimukset tässä viittaavat siihen, että klemitsoli ja trazodoni edellyttävät jatkokehitystä off-label-testaukseen potilailla, joilla on Dravetin oireyhtymä.

tuloksemme lisäävät myös kasvavaa näyttöä, joka viittaa serotonergisen signaloinnin mukauttamiseen voimakkaana kohtausten vaimentajana, erityisesti katastrofaalisissa lapsuuden epileptikoissa, kuten Dravetin syndroomassa. Äskettäin 7 potilasta 10: stä, jotka saivat pieniannoksista hoitoa 5-HT takaisinoton estäjällä fenfluramiinilla, ilmoitti itse olevansa kohtauksettomia 1 vuoden ajan (Ceulemans ym., 2016). Kahdella näistä potilaista ilmoitettiin yhden tai kahden sydänläpän lievää paksuuntumista, mikä viittaa fenfluramiinin käytön mahdolliseen yhteyteen keuhkoverenpainetaudin kanssa (Douglas ym., 1981; Ceulemans et al., 2016). Ihmisillä HTR2A ja HTR2C ilmaistaan keskushermostossa, kun taas HTR2B-ilmentymä rikastuu sydämessä (Lambe et al., 2011; Meltzer et al., 2013). Tarkemmin sanottuna HTR2C ilmaistaan inhibitoristen interneuronien alapopulaatiolla (Liu et al., 2007)ja näiden reseptorien aktivointi 5-HT: llä lisää GABA-välitteistä synaptista inhibitiota (Boothman et al., 2006)eli monien yleisesti määrättyjen epilepsialääkkeiden taustalla oleva epilepsialääke. Useimmat Prekliiniset tutkimukset viittaavat siihen, että HTR2A-ja/tai HTR2C-reseptorien aktivaatiolla on epilepsialääkkeitä (Gharedaghi ym., 2014; Guiard et al., 2015), joka on kohtuullinen vaikutusmekanismi, joka yhdistää klemitsolin, lorcaseriinin, trazodonin ja 5-HT: n takaisinoton estäjän fenfluramiinin (Dinday et al., 2015; Ceulemans et al., 2016). Mielenkiintoista on, että htr2b-ilmentymä seeprakalan aivoissa oli suhteellisen alhainen, mikä viittaa edelleen siihen, että näillä lääkkeillä on mahdollisesti antiepileptistä aktiivisuutta HTR2A: n tai HTR2C-reseptorin aktivaation kautta. Mielenkiintoista on, että tutkimukset Drosophila knock-in-kärpäsissä, jotka kuljettavat k1270t SCN1A-ihmisen mutaatiota para-natriumkanavageenissä, ovat osoittaneet, että täydentäminen 5-HT-esiasteella (5-hydroksitryptophan) pelastaa lämmön aiheuttaman kouristuksen fenotyypin (Schutte et al., 2014). Lisäksi tuoreessa tutkimuksessa, jossa käytettiin scn1Lab-mutantteja, arvioitiin 13 5-HT-merkinantoyhdistettä ja ehdotettiin myös mahdollista epilepsialääkitystä 5-HT-merkinantomodulaattoreille (Sourbron et al., 2016). Viimeksi mainituissa seeprakala-tutkimuksissa käytettiin kuitenkin täysin erilaista protokollaa (24 h verrattuna 30-90 min lääkealtistukseen), jota ei ole aiemmin validoitu Dravetin oireyhtymässä (bentsodiatsepiinit, valproaatti, stiripentoli, bromidit ja ketogeeninen ruokavalio) käytettyjen Aedien tunnistamiseksi onnistuneesti. Lisäksi lääkeainepitoisuudet ovat noin 10 kertaa pienemmät kuin osoitamme olevan tehokkaita seeprakaloissa (Baraban et al., 2005, 2013; Dinday et al., 2015), ja hallusinogeeni TCB-2: n antiepileptisen vaikutuksen raportointi (Kuva. 5), ehdottaa, että eri menetelmiä käyttävien laboratorioiden tietojen suoraa vertailua olisi tulkittava varoen.

kaiken kaikkiaan päätämme, että mutanttiseeprakalat ovat sopiva malli uusien epilepsialääkkeiden nopeaan seulontaan ja löytämiseen, jotka asianmukaisten turvallisuusprofiilien avulla voivat suoraan informoida riskiryhmiin kuuluvien potilasryhmien, kuten Dravetin oireyhtymän, kliinistä hoitoa.

lyhenteet

lyhenteet
• 5-HT

  serotoniini

• AED

  epilepsialääke

• dpf

  päivää hedelmöityksen jälkeen

• GPCR

  g-proteiinikytketty reseptori

• iZAP

  integroitu seeprakalojen analysointialusta

kiitokset

haluamme kiittää barabanin laboratorion jäseniä Brian Gronea ja Matthew Dindayta erityisesti hyödyllisistä keskustelut näiden opintojen aikana.

Rahoitus

S. C. B myöntää rahoituksen NINDS R01-avustuksen nro. NS079214, UCSF Catalyst Award ja Raymond & Beverley Sackler Centre Sabbatical Fund.

lisäaineisto

lisäaineisto on saatavilla Brain Onlinessa.