Kimerismitestiä käytetään allogeenisen elinsiirron saaneiden potilaiden elinsiirron jälkeisen seurannan rutiinidokumentointiin. Luovuttaja-ja vastaanottajasolut voidaan erottaa toisistaan testaamalla geneettisiä markkereita, jotka määritetään ennen elinsiirtoa.2 sukupuolisidonnaisissa siirroissa, joissa vastaanottaja ja luovuttaja ovat eri sukupuolta, naaras-ja urossolujen osuus määritetään yleensä sukupuolikromosomin merkkiaineiden analyysillä, useimmiten kaloilla.8,9 vaihtelevien tandem-toistojen (VNTR) tai lyhyiden tandem-toistojen (STR) arviointi PCR: llä on tullut arvokkaimmaksi menetelmäksi kimeerisyyden määrittämisessä sukupuolisovitetuissa siirroissa.MRD: n toteamiseen on kehitetty 10 erilaista menetelmää. Luuytimen morfologisella analyysillä voidaan tunnistaa jäännöstauti, joka käsittää yli 5% luuytimen tilasta, ja näin ollen siltä puuttuu tarvittava herkkyys varhaista toteamista varten. Lisäksi on usein vaikea erottaa pientä leukemiabrastipopulaatiota normaaleista luovuttajaperäisistä hematopoieettisista blasteista, jotka kansoittavat luuytimen ilman ylimääräisiä merkkiaineita. Erityiset testit voivat havaita MRD kun on erityinen tuumorimarkkeri, kuten erityinen sytogeneettinen poikkeavuus, erityinen immunofenotyyppi, joka voidaan tunnistaa FACS, erityisiä DNA-tai RNA sekvenssejä, jotka voidaan monistaa PCR tai erityinen kasvumalli klonogeenisissa määrityksissä. Koska MRD: lle ei ole spesifistä kasvainmarkkeria, kimeerisyystestiä voidaan käyttää vastaanottajaperäisten solujen havaitsemiseen. Vastaanottajaperäisten solujen toteaminen ei välttämättä aina korreloi uusiutumisriskin kanssa. Sekakimerismiin (MC) osallistuvat vastaanottajasolut kuuluvat pahanlaatuiseen klooniin tai voivat olla normaaleja hematopoieettisia soluja tai jopa stroomasoluja. Ensimmäisten viikkojen aikana tavallisten allogeenisten elinsiirtojen jälkeen vastaanottajasoluja voidaan edelleen havaita, kun käytetään herkkiä testejä.9,11 nämä ovat enimmäkseen T-soluja, jotka selviytyvät ehdollistamisohjelmasta. Isäntäsoluja voidaan havaita pieninä pitoisuuksina (<1%) vielä myöhemmin siirtoleikkauksen jälkeen. MC havaitaan useammin ei-myeloablatiivisen ehdollistumisen jälkeen.2 Näin ollen tuumorikohtaiset markkerit koettimet ovat todennäköisesti parempia ja tarkempia kuin sukupuolierot koettimet MRD: n havaitsemiseksi.12 kuitenkin jopa mrd: n toteaminen kasvainspesifisillä testeillä ei välttämättä aina korreloi uusiutumisriskin kanssa. Positiivisia PCR-testejä BCR/ABL: lle on raportoitu terveillä henkilöillä.T (14; 18)-translokaatiota havaittiin non-Hodgkin-lymfoomaa sairastavilla potilailla muissa sukulinjoissa kuin B-lymfosyyteissä.14 MRD: n kliinisesti merkittävälle määrälle voi olla olemassa kynnysarvo. Useissa sairauksissa, kuten AML t: llä (8;21), 15 pitkäkestoista remissiota on havaittu PCR: llä havaitun MRD: n yhteydessä, kun taas toisissa, kuten akuutissa promyelosyyttisessä leukemiassa, PCR-positiivisuus ennustaa relapsoitumista.16 tämä voi myös liittyä spesifisen PCR-testin herkkyyteen ja kliinistä merkitystä koskevaan kynnysarvoon. Jäljellä pahanlaatuiset solut voivat olla lepotilassa tilassa17 puuttuu mahdollisuus edistää uusiutumista, koska puute tai voitto toisen geneettisen muutoksen. Joissakin sairauksissa voi esiintyä osittaista erilaistumista kypsempiin soluihin, ja näiltä soluilta saattaa puuttua mahdollisuus lisääntyä. MRD voi olla immuuniseurannassa tai MRD-solut ovat apoptoottisessa vaiheessa, jolloin niillä ei ole merkitystä taudin uusiutumisen kannalta. Herkät PCR-testit eivät säilytä solujen morfologiaa, ja siksi on epäselvää, mitkä solut korreloivat MRD: n kanssa näissä eri olosuhteissa.
Duet™ – järjestelmä samanaikaiseen morfologiseen ja sytogeneettiseen moniparametriseen analyysiin tarjoaa muutamia etuja, jotka voivat auttaa paljastamaan MRD: n havaitsemisen merkityksen. Tämä järjestelmä etsii automaattisesti suuren määrän soluja (noin 150000 solua liukumäkeä kohti) pienistä solukokonaisuuksista, joilla on ainutlaatuinen sytogeneettinen tai immuuni-fenotyyppi. Herkkyys pienten populaatioiden havaitsemiselle lisääntyy. Useissa laimennuskokeissa olemme osoittaneet, että urossolun havaitsemisherkkyys naarassolupopulaatiossa on suurempi kuin 1:50000, mutta tämän titterin rajallisen spesifisyyden vuoksi paras havaitseminen tapahtuu välillä 1:10000-1:50000 (KS.lisäys). Kuten havaittiin potilaan 1 (viimeinen analyysi) ja potilaan 2 luuydinnäytteiden analyysissä, Duet™ – järjestelmässä voitiin havaita hyvin pieniä XY-vastaanottajasolupopulaatioita, joita ei havaittu rutiinikaloilla. Kalojen kvantitatiivinen tarkkuus riippuu havaitusta esiintymistiheydestä ja pisteytettyjen solujen määrästä, mikä paranee pisteyttämällä enemmän soluja.18 näin suuren solumäärän pisteytys ei ole käytännöllistä manuaalisessa kalassa, mutta Duet™-automaattijärjestelmä pystyy skannaamaan 10000 solua/min kirkaskenttämikroskopiassa ja 2000-10000 solua/h fluoresoivassa mikroskopiassa, mikä tukee nopean ja tehokkaan skannauksen tarvetta ja lisääntynyttä herkkyyttä.
herkkiin testeihin liittyy usein heikentynyt spesifisyys ja suhteellisen suuri väärien positiivisten tulosten määrä. Standardikaloilla voi esiintyä vääriä positiivisia pisteytyksiä anturin epäspesifisen hybridisaation vuoksi. Kromosomien translokaatioissa voi esiintyä vääriä positiivisia pisteytyksiä satunnaisen spatiaalisen assosiaation ja optisen fuusion vuoksi.18 Duet™ – järjestelmä voi mahdollisesti parantaa spesifisyyttä tunnistamalla tutkittavan populaation solujen morfologian. Kalojen positiivisuuden osoittaminen pienellä populaatiolla, mutta yhtenäisellä Duet™ – morfologisella ulkonäöllä, tekee sen todennäköisemmin todelliseksi positiiviseksi kuin silloin, kun positiivisia soluja on hajallaan eri sukulinjoissa. Myös MRD: n havaitsemisen spesifisyyttä epäspesifisellä kimeerisyystestillä voidaan parantaa. Kuten edellä mainittiin, vastaanottajasolut voivat kuulua pahanlaatuiseen klooniin (kuten potilas 1), voivat olla normaaleja hematopoieettisia soluja (potilas 3, potilas 1 STI571-hoidon jälkeen) tai ei-hematopoieettisia/stroomasoluja (kuten osteoblastit, potilas 2). Duet™ – järjestelmä mahdollistaa näiden vaihtoehtojen erottelun morfologisen ulkonäön perusteella. Olemme osoittaneet analyysissä potilaan 1, ja kaksi muuta potilasta (tiedot eivät näy), että tunnistaminen vastaanottajan ominaisuudet (kuten vastakkaisen sukupuolen sytogenetiikka) sisällä blasteja tai epäkypsiä soluja ennustaa avoimen uusiutumisen ja edeltää sitä muutaman viikon muutaman kuukauden. Potilaan 1 erillisissä kala-analyyseissä havaittiin pieni XY-vastaanottajapopulaatio (0, 6%) ja pieni BCR/ABL-positiivinen populaatio (0, 8%), joita molempia voitiin pitää false positive-prosentteina kala-analyysissä. Duet™ – järjestelmä on kuitenkin osoittanut, että suuri osa XY: n vastaanottajasoluista oli blasteja (ja myös BCR/ABL positiivinen samoista soluista tehdyssä toisessa FISH-testissä), joten se voi ennustaa potilaan uusiutuvan. Pienen vastaanottajapopulaation tunnistaminen kypsissä hematopoieettisissa soluissa ei välttämättä ennusta taudin uusiutumista. Kolmella muulla potilaalla (tietoja ei näy) olemme dokumentoineet jatkuvan remission pienen, morfologialtaan kypsän vastaanottajajoukon läsnä ollessa. Tarvitaan laajempia tutkimuksia ja pitempää seurantaa, jotta voidaan vahvistaa yhteys isäntäsolujen jäännösmorfologian ja uusiutumisriskin välillä potilailla, joilla ei ole muita ainutlaatuisia merkkiaineita pahanlaatuiselle kloonille.
järjestelmä on suhteellisen yksinkertainen käyttää, se on enimmäkseen automaattinen, sen kääntymisaika ja kustannukset ovat verrattavissa muihin kimeerisyyden ja MRD: n havaitsemisjärjestelmiin, kuten standard FISH-ja PCR-järjestelmiin, ja se voi soveltua laajamittaiseen testaukseen. Järjestelmän laitteistoja ja sarjoja lukuun ottamatta tarvitaan vain suurissa laboratorioissa helposti saatavilla olevia vakiovarusteita (KS.liite).
viime vuosina kimeerisyyden tutkimus eri solulinjojen sisällä on herättänyt kiinnostusta ja suosiota.Tämä on erittäin tärkeää ei-myeloablatiivisen elinsiirron jälkeen.2 jotkut ryhmät ovat osoittaneet, että täydellinen kimerismi t-lymfosyyteissä on tarpeen GVL: n indusoimiseksi, ja siksi MC voi tässä soluryhmässä liittyä lisääntyneeseen uusiutumisriskiin, erityisesti aggressiivisiin, nopeasti kasvaviin maligniteetteihin.2,19 solujen osajoukkojen Kimeerisyystestaus vaatii vaivalloista ja aikaa vievää solujen lajittelua, jolla on teoreettinen mahdollisuus menettää joitakin soluja tämän prosessin aikana. Kuten liitteessä todetaan, diakuvien valmistaminen Duet™ – analyysia varten ei aiheuta solupopulaation häviämistä tai vähenemistä. Duet™ – järjestelmä käyttää MGG-värjättyä liukumäkeä lymfosyyttien ja muiden solujen osajoukkojen paikantamiseen ja voi myös käyttää immunosytokemiallisia tahroja (kuten anti-CD3 monoklonaalisia vasta-aineita) näiden solujen paikantamiseen. Toisessa vaiheessa kalaa voidaan hakea kimeerisyystestiin sukupuolisidonnaisissa elinsiirroissa. Potilaan 3 tapausesitys osoittaa, miten järjestelmää käytettiin potilaan khimerismin seurantaan ei-myeloablatiivisen elinsiirron jälkeen ja miten siirtyminen täydelliseen khimerismiin siklosporiinin lopettamisen jälkeen ennusti KÄÄNTEISHYLJINNÄN ja KÄÄNTEISHYLJINNÄN vasteen esiintymistä.
tässä raportissa keskitytään Duet™ – valmisteen käyttöön luuytimensiirron jälkeen, mutta sillä voi olla monia muitakin vaikutuksia. Järjestelmä voi myös auttaa tutkimaan soluja ja linjoja, joissa on ainutlaatuinen sytogeneettinen tai immunofenotyyppinen merkkiaine, kuten BCR/ABL-fuusio (kuten nähdään potilaassa 1), ja korreloida niiden morfologia uusiutumisriskiin tavanomaisen kemoterapian jälkeen. Se voi auttaa paljastamaan MRD: n luonteen eri maligniteeteissa ja sen, miksi MRD: n toteaminen ei aina ennusta taudin uusiutumista. Tietyissä olosuhteissa voidaan pyrkiä pieniin luovuttajasolupopulaatioihin tai mikrokimeerisyyteen. Esimerkiksi kiinteän elinsiirron jälkeen havaittu systeeminen lympho-hematopoieettinen mikrosimerismi voi ennustaa siirretyn elimen sietokykyä ja ohjata immunosuppressiivista hoitoa.21 samalla tavalla voidaan havaita myös pieniä äitipopulaatioita, jotka kontaminoivat napanuoraverisiirtoja, ja sillä voi olla vaikutuksia KÄÄNTEISHYLJINNÄN aiheuttamaan elinsiirron jälkeiseen riskiin.
yhteenvetona voidaan todeta, että lisäämällä morfologinen analyysi pienistä solupopulaatioista, joilla on maligniteetti tai vastaanottajaan liittyviä merkkiaineita, Duet™-järjestelmä voi parantaa kimerismi-ja MRD-testauksen tarkkuutta ja määritellä niiden kliinisen merkityksen. Tätä järjestelmää on syytä tutkia tarkemmin laajemmissa tutkimuksissa.