Kimairat

mitä annat Osa I

• tilinumero.
• mykoplasmaton ES-solulinja, jossa on 40 kromosomia.

mitä teemme

• pistämme noin 50 blastokystiä ES-solulinjaa kohti. Tällöin syntynee 10 hiirtä. Hiiristä kolmen odotetaan olevan vahvoja uroskimeerejä. Olemme menestyneet.
• hiiriä pidetään kotonamme vieroitukseen asti (kolme viikkoa syntymän jälkeen).

mitä annatte osa II

• säilytätte vieroitetut hiiret.

kustannukset

• 3 300 dollaria 129 solulinjaa kohti ja luovuttajanaaraiden kustannukset; 4 950 dollaria solulinjaa kohti ja luovuttajanaaraiden kustannukset muiden geneettisten taustojen osalta.
• paikalliset, ei-CWRU-tilaukset veloitetaan 200 dollarin lisämaksu hiirien pakkaamisesta ja kuljettamisesta. Ei-paikalliset tilaukset veloitetaan $200 ja kuljetuskustannukset.

säännösten noudattaminen

• tutkijat tarvitsevat laitokseltaan iacuc-protokollan hiirien vastaanottamiseksi ytimestä. CWRU IACUC-protokollien tulee määrittää Transgeenisen ytimen käyttö. Tutkijat eivät yleensä tarvitse omaa IBC-protokollaa: eläinten yhdistelmä-DNA-tarkastelu tehdään siirtogeenistä ydintä koskevan verkkotilauksen kautta toimitettujen tietojen perusteella, ja se lisätään ytimen IBC-protokollaan muutoksena, jos se hyväksytään. IBC voi ottaa sinuun yhteyttä saadaksesi lisätietoja osana rDNA-katsausta tilauksen toimittamisen jälkeen. IBC: n hyväksyntä vaaditaan ennen injektioiden aloittamista.

kiitokset

• pyydämme, että hyväksyt tapauksen Transgeenisen ja kohdentavan välineen seminaareissa ja julkaisuissa.

Aikajana

• solujen injektiopäivämäärästä on vähintään 6 viikkoa, ennen kuin voimme toimittaa hiiret teille (lähes 3 viikkoa tiineyteen ja vähintään 3 viikkoa syntymänjälkeiseen kasvuun ennen vieroitusta). Se kestää vielä 6 viikkoa ennen uros chimeras wil ovat tarpeeksi vanhoja lisääntymään, ja vähintään 6 viikkoa ennen kuin olet vieroitettu jälkeläisiä genotyypin testata sukusolujen siirto-yhteensä 4.5 kuukautta injektiosta itulinjan siirtotestiin.
• nykyinen (3/25/21) arvioitu aika tilausvälityksen ja ES-solun injektion välillä on 8 viikkoa. IBC: n rDNA-komitea tarkastelee Chimera-pyyntöä 8 viikon ajan ennen injektiota, ES-solut sulatetaan ja kasvatetaan ja hiiret tilataan ja vastaanotetaan.

onnistumisprosentti Kimeeristen hiirten tuottamisessa

ydin tuottaa keskimäärin noin 5 kimairaa solulinjaa kohti.

aloitus
kohdistetun mutaation itulinjan siirtymisen todennäköisyys kasvaa, kun käytettävissä on riippumattomia ES-solulinjoja. Keskimäärin noin kahdesta kolmeen neljäsosaa 129 geneettisen taustan ES-solulinjoista menee itulinjaan. C57-taustaisten es-solulinjojen osalta keskimäärin vain puolesta kahteen kolmasosaan linjoista menee itulinja. Siksi, jos olet ostamassa kohdennettuja ES-solulinjoja julkisesta arkistosta, suosittelemme, että ostat 3 tai oikeammin kohdennettua linjaa 129-taustalla ja 4 tai enemmän riviä C57-taustalla. Samoin, tilata 2 tai enemmän injektioita 129 riviä, ja 3 tai enemmän C57 riviä. Kudoskohtaisten kolhujen tuottamisesta ehdollisilla alleeleilla EUCOMMIN es-soluissa, katso primer.

Usein kysyttyä

Mitä ovat kimairat?
tyypillisesti kimairat on rakennettu tuottamaan hiiriä geenien kohdentamista tai geenien vangitsemista ES-solulinjoista. ISÄNTÄALKIOIHIN ruiskutetut ES-solut synnyttävät kimairoiksi kutsuttuja mosaiikkihiiriä.
urospuoliset ES-solut ruiskutetaan sekoittamattomiin blastokysteihin. Jos isäntäalkio on naaras ja urospuoliset ES-solut tuottavat sukusoluja, kimaira on usein hedelmällinen koiras. Käytetään isäntäalkioita kannasta, joka ei kilpaile liian voimakkaasti ES-solujen kanssa, ja kaksi komponenttia (ES ja isäntäalkio) merkitään geneettisesti Turkin värigeeneillä, jotta es-solujen osuus eläimessä voidaan määrittää helposti. Jos es-solujen jälkeläisten osuus eläimen Turkissa on suuri, on myös suuri todennäköisyys, että es-solut ovat edustettuina sukusoluissa, koska ES-solut sekoittuvat perusteellisesti embryogeneesin varhaisessa vaiheessa isäntäsoluihin. Turkin värimerkintäjärjestelmän avulla voidaan myös määrittää asianmukaisin risteytyksin, ovatko kimeerien jälkeläiset ES-solukomponentista vai isäntäalkiokomponentista.
129 ES-solut aiheuttavat ruskean turkin värin, koska ne ovat A/A (villi tyyppi Agouti), ja c57bl/6J-isäntäalkiot aiheuttavat mustan turkin värin, koska ne ovat A/a (resessiivinen nonagouti). ES-solut ovat hiirten 129-kannasta; isäntäalkiot ovat hiirten c57bl / 6J-kannasta. Jos nämä kimairat on jalostettu ei-agoutihiiriksi (esimerkiksi C57BL / 6J), kaikkien ruskeiden jälkeläisten (A/a) on täytynyt syntyä ES-solusta peräisin olevista sukusoluista, ja 50% ruskeista jälkeläisistä on todennäköisesti kantanut knockout-alleelia. Vaihtoehtoisesti mutaation välittyminen voidaan määrittää suoraan PCR-tai Southern blot-määrityksillä jälkeläisistä saaduista kudoksista.

jos ES-solut ovat c57bl / 6J-kannasta (A/a, Tyr/Tyr ja musta), isäntäalkio on albiino C57BL/6J (A/a, Tyrc-2j / Tyrc2-J ja valkoinen). Tällaisten kimeerien jalostaminen albiino C57BL/6J: ksi voi tuottaa ES-solukomponentista mustia jälkeläisiä (A/a, Tyr/Tyrc-2j), joista 50%: n pitäisi kantaa mutaatiota, ja isäntäalkiokomponentista valkoisia jälkeläisiä (A/a, Tyrc-2j / Tyrc-2j).
uroskimerat, jotka todennäköisesti levittävät kohdemutaatiota, voidaan tunnistaa kopulatorisen tulpan genotyypityksen avulla.

muihin käyttötarkoituksiin
Valmistamme myös aggregaattikimeerejä ja diploidtetraploidisia kimeerejä. Kahden eri hiirikannan kaksi preimplantaatiota edeltävää alkiota yhdistetään aggregaatiokimairaksi. Tällä tekniikalla voidaan tuottaa geneettisiä mosaiikkialkioita geenien toiminnan autonomian ja epäautonomian analysointiin ja muihin kokeellisiin tavoitteisiin. Diploidtetraploidisissa kimeereissä tetraploidinen komponentti synnyttää suurelta osin suuren osan alkiosta periytyvästä istukasta ja diploidinen komponentti alkioon. Tämän tyyppisen kimairan avulla voidaan selvittää, tarvitaanko istukassa tai alkiossa geeniä.

miksi hiireni ovat hassuja värejä?
jotkin ES-solulinjat ovat heterotsygootteja Turkin värisille alleeleille, jotka paljastuvat vasta myöhemmissä sukupolvissa. Käyttämämme R1 129 ES-solut ovat heterotsygoottisia albiinolokuksessa, joissa on yksi kopio albiinon chinchilla-alleelista (CCH, myös tyrc-ch) ja ovat heterotsygoottisia vaaleanpunasilmäisessä diluutiolokuksessa (p). R1 ES-soluista keskenään polveutuvat jälkeläiset voivat synnyttää hiiriä, jotka ovat mustia, harmaan eri sävyjä, ruskean eri sävyjä tai keltaisia riippuen Turkin värialleelien valikoimasta.

mitä voidaan tehdä itulinjojen tarttumisen varmistamiseksi?
Itulinjan siirtyminen maksimoidaan ES-soluilla, jotka ovat viettäneet viljelmässä vähimmäisajan, joilla on normaali kromosomikomplementti ja jotka ovat hiivattomat, bakteerit ja mykoplasma. Kohdenna solulinjaan, jonka tiedät välittävän ehdoillasi laitoksessasi. Käytä vanhempien solulinjaa, joka on pienin mahdollinen läpikulkunumero (mieluiten pienempi kuin läpikulkunumero 16). Minimoi aika, että kohdennettu linja on viljelty. Varmista, että kohdennettujen solulinjojen kromosomimäärä on normaali. Testaa solulinjasi mykoplasman varalta. Jotkut solulinjat eivät lähetä, vaikka kaikki nämä parametrit ovat eduksesi. Optimaalisissakin olosuhteissa vain kaksi kolmasosaa kohdennetuista ES-solulinjoista välittyy itulinjan kautta. Aloita siis vähintään kolmella erillisellä kohdennetulla solulinjalla lähetyksen varmistamiseksi.

minulla on heikkoja kimeerejä / naaraskimeroita. Välittävätkö he tyrmäyksen?
sekä heikot kimairat että naaraskimerat voivat siirtää mutanttialleeleja, joskin harvoin. Uroskimerat, jotka todennäköisesti levittävät kohdemutaatiota, voidaan tunnistaa kopulatorisen tulpan genotyypityksen avulla. Vain noin 10% naaras chimeras siirtää ES-solujen genomin, kun he tekevät niin se on vain muutaman ensimmäisen pentueet, ja monet niiden urospuolisten jälkeläisten on sukupuoli kromosomi aneuploidies jotka tekevät niistä hedelmättömiä (Bronson et al., 1995 PNAS 92, 3120).

miksi vahvimmat kimairani kuolivat?
kuolleisuus voi kasvaa, kun eläimen osuus tulee ES-soluista, jopa parhaille solulinjoille. Kuolleisuus johtuu suurelta osin kulttuurissa syntyneistä epigeneettisistä poikkeamista. Epigeneettisten poikkeamien arvellaan korjaantuvan eloonjääneiden hiirten myöhemmällä jalostuksella,ja erottautuisivat satunnaisesti pois kohdehiirestä, vaikka eivät olisikaan.

mihin hiirikantaan kasvatan mutanttini?
geneettisen vaihtelun minimoimiseksi kimairat kasvatetaan mahdollisimman nopeasti samaan taustaan ES-solujen kanssa. Jos ES-solut olivat 129, kasvattaa chimerat 129 hiireen ja mutaatiosi on täysin 129 sisäsiitostaustalla yhdessä vaiheessa. Geenitutkimuksissa yleisin sisäsiittoinen tausta on c57bl / 6-kanta. Jos ES-solusi ovat c57bl / 6, ristitä kimairasi c57bl/6J-hiiriin. Jos haluat muuttaa taustaa, standardi on tehdä 9 sarjaristeytyksiä sisäsiittoinen kanta valinta (noin 2,5 vuotta). 9 sukupolven perustelut selittää tässä Lee Silver. Vaihtoehtoisesti merkinantoavusteinen takakrossi eli nopeuskongeniikka vaatii noin puolet sukupolvien määrästä.Maksimaalista lisääntymistä varten hiiret risteytetään CD1: n kaltaiseen outbred-kantaan. CD1-hiiret olivat peräisin Sveitsiläishiiristä, niiden geneettinen vaihtelu on suurta ja ne valittiin vankkarakenteiseen lisääntymiseen.

ES-solut, joissa on ehdollisia Alleeleita eucommista
jokainen eucommin solulinja edellyttää materiaalin siirtosopimusta. Aloita tämä prosessi mahdollisimman aikaisin.
hiirten generointiaika ja kokeellisten hiirten synnyttämiseen tarvittavien risteytysten määrä yhdistyvät niin pitkäksi ajaksi, että se on yllättävää niille, jotka eivät ole tottuneet hiiren genetiikkaan, joten suunnittele etukäteen. Hiirten sukupolviaika (aika sukukypsästä aikuisesta sukukypsään jälkeläiseen) on noin 3 kuukautta.
EUCOMMIN ehdollisissa alleeleissa on tyypillisesti Frt-reunakasetti (”Frt-ed” – kasetti). Kasetissa on splice acceptor, joka ohjaa käytännössä kaiken splikoinnin kasettiin, jolloin alleeli menettää funktion tässä konfiguraatiossa. Ehdollisen alleelin tuottamiseksi Frt-kylkinen kasetti on poistettava risteyttämällä Flpe-ilmentäviin hiiriin. Flpe / Frt-järjestelmä on vertailukelpoinen, mutta erillinen Cre / LoxP-järjestelmästä.
ruiskutamme ES-solut isäntäalkioihin tehdäksemme kimeerisiä hiiriä. Sieltä hiiret jalostetaan tuottamaan mutaatiota kantavia hiiriä (germline transmission). Tämä perustajasukupolvi voidaan yhdistää hiiriin, jotka ilmaisevat Flpe: n FRT-ed-kasetin poistamiseksi, jolloin syntyy ehdollinen alleeli. Sitten, sinun täytyy tehdä useita ristejä tuottaa kokeellisia hiiriä.

1. ES-solujen injektiosta täysikasvuisiin chimeroihin on hiirten sukupolviaika (3 kuukautta).
2. kimairat jalostetaan villityyppisiksi hiiriksi, jotta mutantti saadaan itulinjaan (3 kk).
3. heterotsygoottiset frtd-ehdolliset hiiret risteytetään homotsygootteja ilmentäviksi Flpe: ksi. Tämä tuottaa Flpe / o, frtd ehdollinen / + jälkeläisiä. (3 kuukautta)
4. Flpe/o, frtd ehdollinen/+ hiiret risteytetään villiin tyyppiin poistetun alleelin määrittämiseksi itulinjassa ja flpe: n poistamiseksi, ja poistuminen varmistetaan molekulaarisesti näillä ehdollisilla/+ hiirillä (3 kuukautta).
5. ehdolliset / + hiiret jalostettiin tämän jälkeen keskenään homotsygoottisiksi ehdollisiksi alleeleiksi (3 kk).
6. ehdolliset / ehdolliset hiiret jalostetaan kudosspesifisiin-Cre/ kudosspesifisiin-Cre -, null/+-hiiriin, jotta kokeellisiin-kudosspesifisiin-Cre/o -, konditionaalisiin/null-hiiriin ja kontrollikudosspesifisiin-Cre/ o -, konditionaalisiin / + – hiiriin.

lisäksi on saatava Fple -, null -, Cre-hiiret, kudosspesifiset Cre -, null/+ – hiiret on kasvatettava.
myös ehdollinen alleeli on analysoitava sen määrittämiseksi, onko se funktioltaan villi tyyppi ennen CRE: n leikkaamista ja nolla CRE: n leikkaamisen jälkeen. Sen määrittämiseksi, onko ehdollinen alleeli villityyppinen funktiossa ennen poistoa, on tutkittava ehdollinen / ehdollinen ja ehdollinen/null-mutantit sen määrittämiseksi, onko niiden fenotyyppi sama kuin + / + – ja null/+ – hiirillä. Sen määrittämiseksi, onko Cre-excised conditional on null-alleeli, konditionaali risteytetään itulinjan Cre-hiireen ja poistetut conditionaalit interrossataan testatakseen, onko poistetun konditionaalin/poistetun konditionaalin fenotyyppi sama kuin null/null ja/tai että poistetusta konditionaalista ei ole valmistettu proteiinia.
tärkeä kontrolli on se, että Cre-aktiivisuuden toimittaja, kuten RosaReporter tai ihanteellisempi, osoittaa suoraan, että kiinnostava proteiini puuttuu kohdesoluista immunofluoresenssin avulla. RosaReporter tuottaa pysyvän beeta-galaktosidaasiekspression kaikissa Cre: lle altistuneissa soluissa.
liiallinen Cre-ilmentyminen voi johtaa kromosomien katkeamiseen, mikä voi aiheuttaa ehdollisen alleelin toimintaan liittymättömiä fenotyyppejä. Siksi sisarushiiret, jotka ilmentävät Cre: tä, mutta säilyttävät jonkin verran geenitoimintaa (esimerkiksi ehdollinen/+), ovat tärkeä kontrolli.