Kiertävä kasvaimen DNA

Pre-analyyttiset huomiotedit

kun verta kerätään EDTA-putkiin ja varastoidaan, valkosolut alkavat lyseerata ja vapauttaa näytteeseen villin tyypin perimää määrinä, jotka ovat tyypillisesti moninkertainen verrattuna ctDNA: han. Tämä vaikeuttaa mutaatioiden tai muiden ctdna: n biomarkkereiden havaitsemista. Kaupallisesti saatavilla olevien solunstabilointiputkien käyttö voi estää tai viivästyttää valkosolujen hajoamista ja siten vähentää ctDNA: n laimennusvaikutusta. Sherwood ja muut osoittivat, että KRAS-mutaatiot havaittiin paremmin sekä EDTA K3-että Streck BCT-putkista kerätyissä vastaavissa näytteissä. Solujen stabilointiputkien edut voidaan toteuttaa tilanteessa, jossa verta ei voida käsitellä plasmaksi välittömästi.

myös muilla toimenpiteillä voidaan vähentää villityypin ”kontaminoivan” DNA: n määrää ja tehdä ctdna: n havaitsemisesta helpompaa:

• verinäytettä ei saa koskaan jäädyttää ennen plasman uuttamista ctDNA-analyysiä varten
• näyte käsitellään plasmaksi 2-4 tunnin kuluessa (jos se on kerätty EDTA-putkeen)
• älä koskaan käytä hepariiniputkia, hepariini estää PCR: ää jäljittelemällä DNA: n kierteistä rakennetta
• Suorita kaksinkertainen sentrifugointivaihe (sentrifugoi veri plasman poistamiseksi ja toista sitten plasmaa poistaakseen roskista putken pohjassa) poistaakseen lisää solujätteitä ennen DNA: n erottamista.
• Plasma on seerumia parempi ctDNA: n talteenotossa

Ctdnaeditin uuttaminen

ctdna-analyysin tärkein vetovoima on se, että se uutetaan ei-invasiivisella tavalla veren keräämisen kautta. CfDNA: n tai ctDNA: n hankinta edellyttää tyypillisesti noin 3 ml: n veren keräämistä EDTA-pinnoitettuihin putkiin. EDTA: n käyttö on tärkeää veren hyytymisen vähentämiseksi. Veren plasma-ja seerumifraktiot voidaan erottaa sentrifugointivaiheessa. ctDNA tai cfDNA voidaan myöhemmin uuttaa näistä jakeista. Vaikka seerumissa on yleensä enemmän cfDNA: ta, tämä johtuu pääasiassa lymfosyyttien DNA: sta. Korkea kontaminoivan cfDNA: n määrä ei ole optimaalinen, koska se voi vähentää ctdna: n havaitsemisen herkkyyttä. Siksi suurin osa tutkimuksista käyttää plasmaa ctdna: n eristämiseen. Tämän jälkeen Plasma käsitellään uudelleen sentrifugoimalla ehjien verisolujen jäännösten poistamiseksi. Supernatanttia käytetään DNA: n uuttamiseen, joka voidaan suorittaa kaupallisesti saatavilla olevilla pakkauksilla.

ctdnaeditin analyysi

ctdna: n analysointi uuttamisen jälkeen edellyttää erilaisten vahvistus-ja sekvensointimenetelmien käyttöä. Nämä menetelmät voidaan jakaa kahteen pääryhmään sen perusteella, onko tavoitteena kuulustella kaikkia geenejä kohdistamattomassa lähestymistavassa, vai onko tavoitteena seurata tiettyjä geenejä ja mutaatioita kohdennetussa lähestymistavassa.

Kohdistamattomat lähestymistavatedit

koko genomi tai eksome-sekvensointimenetelmät voivat olla tarpeen uusien mutaatioiden löytämiseksi kasvaimen DNA: ssa samalla kun seurataan tautitaakkaa tai seurataan lääkeresistenssiä. Kohdistamattomat lähestymistavat ovat myös hyödyllisiä tutkimuksessa tarkkailla kasvaimen heterogeenisuutta tai löytää uusia huumeiden kohteita. Kuitenkin, vaikka kohdistamattomat menetelmät voivat olla tarpeen tietyissä sovelluksissa, se on kalliimpaa ja on pienempi resoluutio. Tämä vaikeuttaa harvinaisten mutaatioiden havaitsemista tai tilanteissa, joissa ctDNA-tasot ovat alhaiset (kuten vähäinen jäännössairaus). Lisäksi voi olla ongelmia erottaa DNA kasvainsoluista ja DNA normaaleista soluista käyttämällä koko genomin lähestymistapaa.

koko genomi – tai eksome-sekvensoinnissa käytetään tyypillisesti suurikapasiteettisia DNA-sekvensointitekniikoita. Sekvensoinnin rajoittaminen vain koko eksomeen sen sijaan voi vähentää kustannuksia ja lisätä nopeutta, mutta sen kustannuksella, että DNA: n ei-koodaavien säätelyalueiden mutaatioista menetetään tietoa. Vaikka yksinkertaisesti tarkasteltaessa DNA polymorfismit kautta sekvensointi ei erota DNA kasvain tai normaaleja soluja, tämä ongelma voidaan ratkaista vertaamalla kontrollinäytteen normaalin DNA (esimerkiksi, DNA saatu bukkaalin moppi.) Tärkeää on, että koko genomi ja koko eksomin sekvensointi ovat hyödyllisiä mutaatioiden löytämisessä. Näin saadaan tietoa herkempien kohdennettujen tekniikoiden käytöstä, joita voidaan sitten käyttää tautien seurantaan.

koko genomin sekvensointi mahdollistaa cfDNA: n rakenteellisten ominaisuuksien, palasten koon ja niiden sirpalekuvioiden palauttamisen. Nämä ainutlaatuiset kuviot voivat olla tärkeä tietolähde ctdna: n havaitsemisen parantamiseksi tai näiden fragmenttien alkuperän paikantamiseksi. Lyhyiden fragmenttien kokovalinta (<150bp) in vitro-tai in silico-menetelmillä voisi parantaa mutaatioiden palautumista ja kopioiden lukumääräpoikkeamia.

digitaalinen KaryotypingEdit

menetelmän kehitti alun perin Bert Vogelsteinin, Luis Diazin ja Victor Velculescun laboratorio Johns Hopkinsin yliopistossa. Toisin kuin normaalissa karyotyypityksessä, jossa väriainetta käytetään kromosominauhojen värjäämiseen kromosomien visualisoimiseksi, digitaalisessa karyotyypityksessä käytetään lokuksen DNA-sekvenssejä koko genomissa kopioluvun vaihtelun laskemiseksi. Kopiolukumuunnokset ovat yleisiä syövissä ja kuvaavat tilanteita, joissa geenin heterotsygoottisuuden menetys voi johtaa toiminnan heikkenemiseen alempien ilmentymien vuoksi tai geenin kahdentumiseen, mikä johtaa yliekspressioon.

uudelleen järjestettyjen päiden Henkilökohtainen analyysi (Pare)Edit

sen jälkeen, kun koko genomi on sekvensoitu suuren läpimenon sekvensointimenetelmällä, kuten Illumina HiSeq, PARE: tä käytetään aineistoon kromosomien uudelleenjärjestelyjen ja translokaatioiden analysoimiseksi. Tämä tekniikka suunniteltiin alun perin kiinteän kasvaimen DNA: n analysointiin, mutta sitä muokattiin ctDNA-sovelluksia varten.

DNA: n metylaatio ja Hydroksimetyyliasetaatti

oikea epigeneettinen merkintä on välttämätön geenien normaalin ilmentymisen ja solujen toiminnan kannalta, ja epigeneettisten kuvioiden poikkeava muutos on syövän tunnusmerkki. Normaali epigeneettinen tila säilyy solussa ainakin osittain DNA-metylaation avulla. Poikkeavien metylaatiomallien mittaaminen ctDNA: ssa on mahdollista ”CpG-saarekkeiksi”kutsuttujen DNA: n alueiden stabiilin metylaation vuoksi. Ctdna: n metylaatio voidaan havaita bisulfiittikäsittelyn avulla. Bisulfiittikäsittely muuttaa kemiallisesti metyloidut sytosiinit urasiiliksi jättäen metyloidut sytosiinit muuttumattomiksi. DNA sekvensoidaan myöhemmin, ja mahdolliset muutokset DNA: n metylaatiokuviossa voidaan tunnistaa. DNA-hydroksimetylaatio on samalla tavoin liittyvä merkki, joka on osoitettu olevan ennustava markkeri terve vs. sairaat tilat cfDNA, mukaan lukien syöpä. Poikkeavien hydroksimetylaatiokuvioiden mittaamista ctDNA: ssa ovat todistaneet Chicagon yliopiston (Chuan He lab,) Stanfordin yliopiston (Quake lab,) ja Cambridge Epigenetix-yhtiön tutkijat.

Targeted approachesEdit

kohdennetussa lähestymistavassa ctdna: n sekvensointi voidaan suunnata geneettiseen paneeliin, joka on rakennettu mutaatiopilkkujen perusteella kiinnostavan syövän varalta. Tämä on erityisen tärkeää hoidosta tiedottamisen kannalta tilanteissa, joissa mutaatioita havaitaan huumaavissa kohteissa. Ctdna: n kohdennetun analyysin Personointi jokaiselle potilaalle on myös mahdollista yhdistämällä nestemäiset koepalat tavallisiin primaarisiin kudosbiopsioihin. Koko genomi tai koko exome sekvensointi primaarikasvain biopsia mahdollistaa löytämisen geneettisiä mutaatioita erityisiä potilaan kasvain, ja sitä voidaan käyttää myöhemmin kohdennettu sekvensointi potilaan ctDNA. Ctdna: n havaitsemisen suurin herkkyys saavutetaan yksittäisten nukleotidipolymorfismien (SNP) kohdennetulla sekvensoinnilla. Yleisesti mutatoituneet geenit, kuten onkogeenit, joilla on tyypillisesti hotspot-mutaatioita, ovat hyviä ehdokkaita kohdennettuihin sekvensointimenetelmiin. Kääntäen, useimmissa tuumorisuppressorigeeneissä on laaja valikoima mahdollisia funktiomutaatioiden menetyksiä koko geenissä, eivätkä ne sellaisenaan sovellu kohdennettuun sekvensointiin.

kohdennettujen lähestymistapojen etuna on ctdna: n vahvistaminen polymeraasiketjureaktioiden (PCR) tai digitaalisen PCR: n avulla. Tämä on erityisen tärkeää analysoitaessa ctDNA: ta paitsi siksi, että verenkierrossa on suhteellisen vähän DNA: ta, myös siksi, että ctDNA muodostaa pienen osan koko soluttomasta DNA: sta. Siksi tärkeiden alueiden monistaminen voi merkittävästi parantaa ctdna: n havaitsemisen herkkyyttä. PCR: n avulla tapahtuva vahvistus voi kuitenkin aiheuttaa virheitä, kun otetaan huomioon DNA-polymeraasien luontainen virhetaso. Sekvensoinnin aikana tehdyt virheet voivat myös vähentää ctdna-mutaatioiden havaitsemisen herkkyyttä.

Droplet Digital PCR (ddPCR)Edit

tämä menetelmä on johdettu digitaalisesta PCR: stä, jonka Bert Vogelsteinin ryhmä Johns Hopkinsin yliopistossa alun perin nimesi. Droplet Digital PCR hyödyntää pisarageneraattoria jakaakseen yksittäisiä DNA-paloja pisaroiksi öljy / vesi-emulsiolla. Tämän jälkeen kussakin pisarassa tapahtuu yksittäisiä polymeraasiketjureaktioita käyttäen valittuja alukkeita ctdna: n alueita vastaan ja ne etenevät päätetapahtumaan. Kiinnostavien jaksojen läsnäoloa mitataan fluoresoivilla antureilla, jotka sitoutuvat monistettuun alueeseen. ddPCR mahdollistaa alleeli-ja mutanttitaajuuksien erittäin kvantitatiivisen arvioinnin ctDNA: ssa, mutta sitä rajoittaa fluoresoivien antureiden määrä, joita voidaan käyttää yhdessä määrityksessä (enintään 5). Määrityksen herkkyys voi vaihdella analysoidun DNA: n määrän mukaan ja on noin 1: 10 000.

Helmet, emulgoituminen, monistuminen ja Magnetiikka (sädetys)Edit

tämä tekniikka perustuu pisaroiden digitaaliseen PCR: ään, jotta voidaan tunnistaa ctdna: n mutaatiot virtaussytometrialla. Kun ctdna on uutettu verestä, PCR suoritetaan alukkeilla, jotka on suunniteltu kohdentamaan kiinnostavat alueet. Nämä alukkeet sisältävät myös erityisiä DNA-sekvenssejä eli tunnisteita. Monistunut DNA sekoittuu streptavidiinipäällysteisiin magneettihelmiin ja emulgoituu pisaroiksi. DNA: n vahvistamiseen käytetään biotinyloituja alukkeita, jotka on suunniteltu sitoutumaan tunnisteisiin. Biotinylaatio mahdollistaa monistetun DNA: n sitoutumisen magneettisiin helmiin, jotka on päällystetty streptavidiinilla. Kun PCR on valmis, DNA: han sitoutuneet Helmet erotetaan magneetilla. Helmissä oleva DNA denaturoidaan ja sen annetaan risteytyä kullekin DNA-mallille ominaisten fluoresoivien oligonukleotidien kanssa. Tuloksena olevat helmi-DNA-kompleksit analysoidaan virtaussytometrialla. Tällä tekniikalla pystytään kuvaamaan alleeli-ja mutaatiotaajuuksia, jotka johtuvat kytkemisestä ddPCR: ään. Toisin kuin ddPCR: llä, suurempi määrä DNA-sekvenssejä voidaan kuitenkin kuulustella fluoresenssilla sidottujen antureiden joustavuuden vuoksi. Järjestelmän etuna on myös se, että eristettyä DNA: ta voidaan käyttää myös jälkijuoksun sekvensointiin. Herkkyys on 1,6: sta 104: stä 4,3: een 105: stä.

syövän henkilökohtainen profilointi syväsekvenssillä (CAPP-Seq)Edit

tätä menetelmää kuvasivat alun perin Ash Alizadehin ja Maximilian Diehnin ryhmät Stanfordin yliopistossa. Tässä menetelmässä käytetään biotinyloituja oligonukleotidivalitsinkoettimia CTDNA: n havaitsemisen kannalta merkityksellisten DNA-sekvenssien määrittämiseen. Julkisesti saatavilla olevia syöpätietokantoja käytettiin koettimien kirjaston rakentamiseen syövän toistuvia mutaatioita vastaan laskemalla niiden toistumisindeksi. Protokolla oli optimoitu ctdna: n keräyksessä havaituille alhaisille DNA-tasoille. Sitten eristetyssä DNA: ssa tehdään syväsekvenssejä herkkyyden lisäämiseksi. Tämä tekniikka mahdollistaa satojen DNA-alueiden kuulustelun. CAPP-Seq: n ctdna-detektioherkkyyden on raportoitu olevan 2,5 molekyyliä 1 000 000: sta.

Tagged Amplikon deep Sequencing (TAM-Seq)Edit

TAM-Seq mahdollistaa kokonaisten geenien kohdennetun sekvensoinnin mutaatioiden havaitsemiseksi ctDNA: ssa. Ensin tehdään yleinen vahvistusvaihe käyttäen alukkeita, jotka kattavat koko kiinnostavan geenin 150-200bp-jaksoissa. Tämän jälkeen mikrofluidijärjestelmää käytetään liittämään adaptereita, joilla on yksilöllinen tunniste jokaiseen amplikoniin, jotta DNA vahvistuu edelleen rinnakkaisissa singleplex-reaktioissa. Tämä tekniikka osoitettiin onnistuneesti tunnistaa mutaatioita hajallaan TP53 tuumorisuppressorigeeni pitkälle munasarjasyöpäpotilailla. Tämän tekniikan herkkyys on 1: 50.

Safe-SEQ (Safe-SEQ)Edit

tätä menetelmää kuvasi alun perin Bert Vogelstein ryhmineen Johns Hopkinsin yliopistossa. Safe-Seq vähentää massiivisesti rinnakkaissekvensoinnin virhetasoa, jotta voidaan lisätä herkkyyttä harvinaisille mutanteille. Se saavuttaa tämän lisäämällä yksilöllisen tunnisteen (UID) sekvenssin jokaiseen DNA-malliin. Tämän jälkeen DNA monistetaan lisättyjen Uidien avulla ja sekvensoidaan. Kaikilla DNA-molekyyleillä, joilla on sama UID (UID-perhe), pitäisi olla sama raportoitu DNA-sekvenssi, koska ne monistettiin yhdestä molekyylistä. Mutaatioita voi kuitenkin syntyä monistumisen kautta, tai sekvensointi-ja analysointivaiheissa voidaan kutsua virheellisiksi emäsluokituksiksi. Uid: n olemassaolo mahdollistaa näiden menetelmävirheiden erottamisen ctdna: n todellisista mutaatioista. Mutaatiota pidetään ”supermutanttina”, jos 95% sekvensoiduista lukemista on yhtäpitäviä. Tämän lähestymistavan herkkyys on 9 miljoonasta.

Duplex sequencingEdit

tämä menetelmä on parannus Safe-Seq-tekniikkaan lisättyihin yksittäisiin uid-lukuihin. Duplex-sekvensoinnissa satunnaistettu kaksijuosteinen DNA toimii ainutlaatuisina tunnisteina ja on kiinnitetty invarianttiin välikappaleeseen. Tunnisteet on kiinnitetty DNA-fragmentin molempiin päihin (α – Ja β-tunnisteet), minkä seurauksena PCR: lle muodostuu kaksi ainutlaatuista mallia: toisessa säikeessä on α – tunniste 5′ – päässä ja β-tunniste 3′ – päässä ja toisessa β-tunniste 5′ – päässä ja α-tunniste 3′ – päässä. Nämä DNA-fragmentit monistetaan sitten alukkeilla tagien invariantteja sekvenssejä vastaan. Monistettu DNA sekvensoidaan ja analysoidaan. DNA: ta ja duplex-adaptereita verrataan keskenään ja mutaatiot hyväksytään vain, jos molempien säikeiden välillä vallitsee yksimielisyys. Tämä menetelmä ottaa huomioon sekä sekvensoinnin virheet että varhaisen vaiheen PCR-vahvistuksen virheet. Lähestymistavan herkkyys mutanttien löytämiseen on 1: 10^7.

Integrated Digital Error Suppression (iDES)-enhanced CAPP-SeqEdit

iDES parantaa ctdna: n CAPP-Seq-analyysiä virheiden vähentämiseksi ja siten havaitsemisherkkyyden lisäämiseksi. Vuonna 2016 raportoitu iDES yhdistää CAPP-Seq: n duplex-viivakoodaussekvenssiteknologiaan ja laskennalliseen algoritmiin, joka poistaa CAPP-Seq-hybridisaatiovaiheeseen liittyvät stereotyyppiset virheet. Menetelmä integroi myös duplex-sekvensoinnin mahdollisuuksien mukaan, ja sisältää menetelmiä tehokkaampaan duplex-talteenottoon soluttomasta DNA: sta. Tämän parannellun CAPP-Seq-version herkkyys on 4 100 000 kopiossa.