DNA: n uuttaminen kuivuneista Veriläiskistä käyttäen Chelex – hartsia

jokainen biotutkija, joka haluaa analysoida DNA: ta, tietää, että prosessi alkaa DNA: n erottamisella kiinnostavista soluista. Nämä solut voivat olla RBC: tä, loisia tai bakteereja muutamia mainitaksemme. Lisäksi on olemassa erilaisia DNA: n uuttamismenetelmiä1, joista valita riippuen näytteen tyypistä, jatkotutkimuksesta jne. Monet tutkijat aloittavat kuivuneista veriläiskistä (DBS), joten DNA: n uuttaminen tällaisista näytteistä on erityisen kiinnostavaa. DBS valmistetaan yleisesti keräämällä verta Whatman FTA card2-tai Whatman kromatografinen 3 mm suodatinpaperille ja antamalla sen kuivua jonkin aikaa (~4 tuntia) ennen käsittelyä. Tätä bionäytteenottomenetelmää on käytetty vuosikymmeniä.

seuraavassa kuvataan hyödyllinen menetelmä DNA: n eristämiseksi tällaisista näytteistä BT Chelex 100 Resin3-menetelmällä.

ensimmäinen vaihe: punasolujen hajoaminen

• leikkaa kuiva veriläikkä ja laita se mikrosentrifugiputkeen (1, 5 ml) reikäpistimellä. Älä unohda merkitä putki, varsinkin työskenneltäessä useita näytteitä. Laadunvalvontaa varten, myös positiivisen kontrollin veren paikalla.
• lisätään 1 ml 0, 5% saponiinia mikrosentrifugiputkeen, jossa on veripilkku. Sulje, pyörre, ja inkuboidaan 4 0C vähintään 4 tuntia, tai vielä parempi, yön yli. Tässä vaiheessa saponiini kompleksit kolesterolin kanssa erytrosyyttikalvossa, mikä johtaa huokosten muodostumiseen kalvossa ja siten hemolyysiin.4 saponiini on yleisesti käytetty lyysireagenssi loisten (esimerkiksi malarialoisten) vapauttamisessa punasoluista.
• pyöräytä muutaman sekunnin ajan 4000 rpm: n nopeudella poistaaksesi pisarat sisäkannesta ja ime saponiinia putkesta käyttäen Pasteur-pipettiin kiinnitettyä estotonta pipetin kärkeä tyhjiökokoonpanokoneessa. Voidaan käyttää myös muovista pasteur-pipettiä. Jätä kohta mikrosentrifugiputkeen.

Vaihe kaksi: pesu

• lisätään 1 ml fosfaattipuskuroitua suolaliuosta mikrosentrifugiin, suljetaan, pyörrytetään ja inkuboidaan 4 0C: ssa 20-30 minuuttia. Yön yli hautominen ei aiheuta haittaa. Tämä vaihe varmistaa, että saponiini poistuu putkesta.
• pyöräytä muutama sekunti nopeudella 4 000 rpm ja poista sitten PBS samalla tavalla kuin poistit saponiinin. Jätä kohta mikrosentrifugiputkeen.

vaihe kolme: DNA: n uuttaminen Kelex-hartsilla

periaate: Chelex-hartsi toimii estämällä DNA: n hajoamista hajoavista entsyymeistä (Dnaasit) ja potentiaalisista kontaminanteista, jotka saattavat estää jatkokarsinnan analyysejä. Yleensä Chelex-hartsi vangitsee tällaiset epäpuhtaudet, jättäen DNA: n liuokseen. Chelex-hartsi pidättää kationeja, kuten Mg2+: ta, joka on tärkeä dnaasin vaikutukselle vaikuttava tekijä ja suojaa siten DNA: ta hajoamiselta.5,6

• Pipetoidaan ja lisätään 150µl 6, 7% Chelex-hartsiliuosta Spotin sisältävään mikrosentrifugiputkeen. Sulje putki. Tärkeä muistutus: kun valmistat 6,7% Chelex-liuosta, käytä vettä, joka ei sisällä Dnaaseja, nukleaaseja (tai mitään, mikä voi vahingoittaa ja heikentää DNA: ta).
• inkuboidaan 95 0C: ssa 10 minuutin ajan käyttäen lämpölohkoa/ ravistinta. On tärkeää avata putki kahdesti, 2 minuutin välein, paineen vapauttamiseksi ja ravistella sen jälkeen muutaman sekunnin ajan. Tämä vapauttaa DNA: n liuokseen.

Vaihe neljä: Vältä Chelex-Hartsihelmiä lopullisessa uutteessa

• Spin 5 minuuttia nopeudella 4000 rpm
• Pipetoidaan mahdollisimman paljon uutetta pienempään mikrosentrifugiputkeen (0, 6 ml) aerosolisuojan kärjellä ja vältetään samalla Chelex-helmien siirtyminen.
• sentrifugoidaan 0, 6 ml: n mikrosentrifugia nopeudella 4 000 rpm 10 minuutin ajan. Toisen pyöräytyksen ideana on poistaa kaikki jäljellä olevat Chelex-helmet, jotka saattavat siirtyä lopulliseen uutteeseen. Miksi tämä on tärkeää? Kaksi pääsyytä: 1) Chelex sitoutuu magnesiumioneihin (PCR: ssä käytettävän Taq-polymeraasin välttämätön yhteistekijä) ja 2) Chelex-fluoresensseihin. Jos fluoresenssi on tapa visualisoida tulos, se voi luoda väärän positiivisen tuloksen.
• Pipetoidaan noin 100 µL ja siirretään lopullinen uute uuteen mikrosentrifugiin. Etiketti ja säilytä jääkaapissa.

muutama vinkki DNA-uuttoa tehtäessä

• työskentele puhtaassa ympäristössä, jossa ei ole epäpuhtauksia
• käytä pipettikärkiä, joissa ei ole nukleaaseja
• käsittele kaikkia näytteitä käsineillä
• uudelleen, vältä Chelex-helmiä lopullisessa uutteessa

Conclusion

Chelex Resin7, tarjoaa yksinkertaisen ja nopean DNA-uuttomenetelmän DBS: stä käytettäväksi erilaisissa Molekyylianalyysisovelluksissa. Tämä menetelmä ei vaadi kalliita laitteita ja on luotettava, kun testataan muita menetelmiä.

1. GE Healthcare (2010). Luotettava dna-näyte Whatman FTA-korteista. Hakemushuomautus 28-9822-22 AA. Buckinghmashire, Iso-Britannia: GE Healthcare.
2. Whatman (o. s. Valmistelen VAPAAKAUPPALEVYÄ DNA-analyysiä varten. Whatman FTA protokolla BD08.
3. Bio-Rad (n.d.) Chelex® 100 and Chelex 20 Chelating Ion Exchange hartsi Instruction Manual. LIT200RevB. Hercules, CA: Bio-Rad Laboratories.
4. Baumann, E., Stoya, G., Völkner, A., Richter, W., Lemke, C., and Linss, W. (2000). Ihmisen punasolujen hemolyysi saponiinilla vaikuttaa kalvon rakenteeseen. Acta Histochemica, 102(1), 21-35.
5. IBRC (2016). Louhintaprotokolla: Chelex. Ibrc: n verkkosivut. Retrieved from http://ibrc-bali.org/research/protocol/
6. Kambara, C. S., Boissaye, R., Stewart, J., and Staton, P. (n. d.). Suun kautta otettavien Referenssipyyhkeiden Chelex ® – DNA-Uuttoprotokollan kehittäminen ja sisäinen validointi.
7. Walsh, P. S., Metzger, D. A., and Higuchi,R. (2013). BioTechniques 30th Anniversary Gem Chelex 100 välineenä yksinkertaiseen DNA: n erottamiseen PCR-pohjaista Tyypitystä varten rikosteknisestä materiaalista. Biotechniques, 54(3), 134-139.