Introduction
C-type natriuretic peptide (CNP), identified in 1990 by Sudoh et al., on natriureettisen peptidiperheen vanhin jäsen . CNP stimuloi selektiivisesti ihmisen natriureettista peptidireseptoria 2 (NPR2), joka aktivoi cGMP-riippuvaisen kinaasin (cGK) nostamalla cGMP: n solunsisäistä pitoisuutta . Lisäksi CNP sitoo NPR3: A ja puolestaan deaktivoi proteiinikinaasi A: n estämällä Gi-proteiinista riippuvaisesti adenylaattisyklaasia . CNP: llä on anti-proliferatiivisia ja anti-migratorisia ominaisuuksia, ja se tunnistettiin myös endoteelista johdetuksi rentouttavaksi tekijäksi . Lisäksi CNP estää neointimaalista restenoosia, vähentää verisuonten supistumista ja sydämen iskemia-reperfuusiovaurioita . CNP: llä on tärkeä rooli luun kasvussa, lisääntymisessä, hermojen kasvussa, endoteelisaatiossa sekä munuaisten, haiman ja sydämen toiminnassa . Lisäksi CNP: n on viime aikoina todettu osallistuvan ateroskleroottisen plakin muodostumisen kehittymiseen .
CNP: n lukuisten toimintojen vuoksi tämä peptidi on viime vuosina lisännyt kiinnostusta sydän-ja verisuonitutkimukseen. Verinäytteiden CNP-pitoisuuksia koskevat tutkimukset ovat kuitenkin epäjohdonmukaisia. Joissakin näistä tutkimuksista mitattiin CNP: n tai sen aminoterminaalisen propeptidin (nt-proCNP) pitoisuuksia seeruminäytteistä ja toisissa käytettiin plasmanäytteitä . Valitettavasti tietoja mahdollisista viiveistä verinäytteenoton ja myöhemmän näytteen käsittelyn aikana ei ole vielä raportoitu. Tähän mennessä saatavilla olevassa kirjallisuudessa ei ole tietoa CNP/NT-proCNP-pitoisuuksien eroista seerumi-ja plasmanäytteiden välillä. Myös verinäytteen käsittelyn viivästymisen vaikutus on edelleen epäselvä. Lisäksi seerumin ja plasman CNP-pitoisuus vaihteli huomattavasti (Taulukko 1). Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli siksi vastata seuraaviin menetelmäkysymyksiin: 1) aiheuttaako huoneenlämmössä säilytettyjen verinäytteiden käsittelyn viivästyminen harhaa? (2) Onko seerumin ja plasman CNP-tai NT-proCNP-pitoisuuksissa eroa? 3) Ovatko nämä erot ajasta riippuvaisia?
menetelmät
tutkimme 12 miespuolista vapaaehtoista (keski-ikä 29 ± 2 vuotta, normaalipainoisuus, ei lääkehoitoa, ei sydän-ja verisuonisairauksia tai muita sairauksia, 3 tupakoitsijaa). Kaikilta tutkittavilta saatiin tietoon perustuva suostumus. Kolmoset paastoverinäytteistä otettiin kaikilta vapaaehtoisilta aamukahdeksalta. Verinäytteet kerättiin 7, 5 ml: n s-Monovette®-keräysjärjestelmällä (Sarstedt, Nümbrecht, Saksa), joka sisälsi joko hyytymistä aktivoivaa ainetta (kaoliinia) seeruminäytteissä, natriumsitraattia plasmanäytteissä tai kalium–EDTA: ta täysverinäytteissä. Kaikki lähtötilanteen analyysejä varten otetut näytteet sentrifugoitiin välittömästi lämpötilaan 2 000 × g 10 minuutin ajan 4°C: ssa ja supernatantti säilytettiin -70°C: ssa analyysiin asti. Välianalyysejä (30 minuuttia tai 2 tuntia) varten plasmanäytteitä sentrifugoitiin 2 000 × g: n lämpötilassa 10 minuutin ajan huoneenlämmössä. Supernatantti poistettiin ja säilytettiin huoneenlämmössä 30 minuuttia tai 2 tuntia. Veren hyytymisen jälkeen seeruminäytteet käsiteltiin samalla tavalla kuin plasmanäytteet. Supernatantti säilytettiin ja säilytettiin myös huoneenlämmössä 30 minuuttia tai 2 tuntia. Täydelliset verinäytteet säilytettiin huoneenlämmössä ilman sentrifugointia. 30 minuutin tai 2 tunnin kuluttua täydet verinäytteet sentrifugoitiin lämpötilassa 2 000 × g 10 minuutin ajan 4°C: ssa.supernatantti poistettiin ja säilytettiin -70°C: ssa analyysiin asti. CNP: n pitoisuus mitattiin CNP-22 EIA-pakkauksella (#EK-012-03, Phoenix Pharmaceuticals, Karlsruhe, Saksa) valmistajan protokollan mukaisesti. NT-proCNP-pitoisuus mitattiin NT-proCNP EIA-pakkauksella (Biomedica, Wien, Itävalta) valmistajan protokollan mukaisesti. Ryhmien vertailussa käytettiin yksisuuntaista ANOVAA. Parivertailuissa käytettiin t-testiä. Tiedot esitetään keskiarvoina ± keskihajonta (SD) tai 95 prosentin luottamusväli (95%-CI). Tilastollisen merkitsevyyden oletettiin olevan P < 0, 05. Tiedot analysoitiin käyttäen MedCalc® for Windows-versiota 10.0.1.0 (MedCalc Software, Mariakerke, Belgia).
tulokset
kuten kuvassa 1a esitetään, CNP: n lähtötason pitoisuudet seerumissa olivat 0, 997 ± 0, 379 ng/ml, plasmassa 1, 933 ± 0, 699 ng/ml ja täysverinäytteissä 0, 991 ± 0, 489 ng/ml. CNP: n pitoisuus plasmassa oli merkitsevästi suurempi kuin seerumi-ja täysverinäytteissä kaikissa ajankohdissa (ANOVA, P = 0, 001 lähtötilanteessa, p < 0, 001 30′ minuutin kohdalla. ja p = 0.003 120′ min.). Seerumin ja täysverinäytteiden välillä ei havaittu merkitsevää eroa missään vaiheessa (ANOVA, p > 0, 05). NT-proCNP: n lähtötason pitoisuudet seerumissa olivat 58, 5 ± 28, 3 pg/ml, plasmassa 60, 3 ± 23, 9 pg/ml ja täysverinäytteissä 50, 7 ± 21, 4 pg/ml (Kuva 1b). Ryhmien välillä ei havaittu merkitsevää eroa missään vaiheessa (ANOVA, p > 0, 05). Täysissä verinäytteissä laktaattipitoisuus suureni merkittävästi 2 tunnin kuluttua lähtöarvosta (3, 2 ± 0, 8 mm vs. 2, 0 ± 0, 6 mM, p < 0, 001). Lisäksi pH-arvo laski 7, 34 ± 0: sta.03 lähtötilanteessa arvoon 7, 29 ± 0, 03 2 tunnin kuluttua (p < 0, 001).
CNP: n ja nt-proCNP: n pitoisuudet verinäytteissä. a) CNP: n pitoisuus seerumi -, plasma-ja täysverinäytteissä (keskiarvo, 95 prosentin luottamusväli). CNP-pitoisuudet plasmanäytteissä ovat merkitsevästi korkeammat kuin seerumi-ja täysverinäytteissä kaikissa ajankohdissa (ANOVA, P = 0, 001 lähtötilanteessa, p < 0, 001 30′: ssa ja p = 0, 003 120′: ssa). Seerumin ja täysverinäytteiden välillä ei ole merkitsevää eroa missään vaiheessa (ANOVA, p > 0, 05). b) NT-proCNP-pitoisuus seerumi -, plasma-ja täysverinäytteissä (keskiarvo, 95%: n luottamusväli). Ryhmien välillä ei ole merkitsevää eroa missään vaiheessa (ANOVA, p > 0, 05).
Keskustelu
tutkimuksemme osoitti, että CNP ja NT-proCNP ovat stabiileja seerumissa ja täysissä verinäytteissä vähintään kaksi tuntia huoneenlämmössä. Näin ollen CNP-peptidin stabiiliuteen ei todennäköisesti vaikuta se, että Näytteiden käsittely viivästyy vähintään kaksi tuntia. ProCNP: n on jo raportoitu (valmistajan protokolla, verinäytteiden tuntemattomat säilytysolosuhteet) olevan stabiili vähintään 2, 5 tuntia. Näin ollen kokeemme vahvistivat NT-proCNP: n vakauden jopa huoneenlämmössä. NT-proCNP: n pitoisuus kaikissa näytetyypeissä pysyi muuttumattomana koko ajan 2 tunnin ajan, mikä osoittaa, että tämä proteiini säilyy pitkään stabiilina. Kuten taulukossa 1 on lueteltu, NT-proCNP: n keskimääräinen pitoisuus (56, 5 ± 24.Tässä tutkimuksessa mitattu 3 pg/ml oli terveillä henkilöillä ilmoitetulla vaihteluvälillä (KS.Taulukko 1) (3, 7-432 pg/ml).
toisin kuin NT-proCNP: llä, CNP: n pitoisuus plasmanäytteissä oli huomattavasti suurempi kuin seerumi-ja täysverinäytteissä (Kuva 1). Tähän mennessä ryhmämme tai valmistajien tekninen palvelu ei ole löytänyt mitään näyttöä näytetyypin vaikutuksesta tässä tutkimuksessa käytettyyn ELISA-määritykseen. Lähtötilanteessa plasman supernatantti ja täydet verinäytteet olivat kuitenkin identtiset lukuun ottamatta käytettyä veren hyytymisen estäjän tyyppiä. Tämä estäjä oli natriumsitraatti plasmaryhmässä ja EDTA täyden verinäytteen ryhmässä. Täydet verinäytteet osoittivat vastaavia tuloksia kuin seeruminäytteet (p = 0,98). Sen vuoksi on erittäin todennäköistä, että natriumsitraatti voi merkittävästi vaikuttaa CNP: n mitattuun pitoisuuteen plasmassa ja siten vääristää tällä menetelmällä saavutettuja tuloksia.
odottamatta CNP: n lähtötason pitoisuudet sekä plasmanäytteissä että seerumissa olivat noin tuhatkertaiset muihin raportteihin verrattuna (Taulukko 1) . Kaikissa näissä tutkimuksissa käytettiin radioimmunomääritystä (RIA-Kit) CNP-pitoisuuksien määrittämiseen. Sen sijaan kahdessa muussa tutkimuksessa mitatut CNP-pitoisuudet seerumi-ja plasmanäytteissä olivat mittojen suuruuden osalta verrattavissa tuloksiimme . Mielenkiintoista on, että jälkimmäisessä tutkimuksessa käytettiin samaa ELISA-pakkia kuin meidän tutkimuksessamme. Vaikka erilaisia sisäisiä ja ulkoisia tekijöitä olisi arvioitu laajasti, tälle ristiriidalle ei löytynyt tyydyttävää selitystä. Kontrollimittaukset, joissa käytettiin ihmisen seerumissa eksogeenista CNP: tä, paljastivat ei-merkittävän mittausvirheen, joka oli +7,8% (95%-KI:–). Vertailukäyrässä käytetyn CNP-peptidin syntetisoi valmistaja itse (Phoenix). Sen sijaan ”eksogeenisena” kontrollina käytettyä CNP-peptidiä toimitti Bachem. Kuten molemmat valmistajat vakuuttivat, aminohapposekvenssit olivat identtisiä ja molemmissa peptideissä muodostui disulfidisidoksia.
sisäisen valvonnan mittaustulokset voidaan kuitenkin tiivistää seuraavasti: Ensinnäkin tutkimuksessamme tehdyt kontrollimittaukset osoittivat, että ELISA-sarjoja käytettiin asianmukaisesti, valmistajan ohjeiden mukaisesti. Toiseksi mittauksissa, joissa käytettiin kontrollinäytteitä, vahvistettiin käytetyn standardikäyrän soveltuvuus. Kolmanneksi, kontrolliseeruminäytteet, jotka sisälsivät eksogeenista CNP: tä, osoittivat hyväksyttävän tarkkuuden ja tulokset olivat odotetun suuruusluokan sisällä. Neljänneksi korkeampi CNP-pitoisuus plasmanäytteissä on todennäköisesti natriumsitraatin aiheuttama artefakti.
kuten Clerico ja työtoverit ovat raportoineet, myös esimerkiksi ANP: n ja BNP: n tulokset ovat verrattain suuria eri RIA-ja YVA-menetelmien välillä . Clerico ja työtoverit päättelivät, että näiden tulosten suuret erot johtuvat todennäköisimmin käytettyjen monoklonaalisten tai polyklonaalisten vasta-aineiden spesifisyydestä, immunomääritysjärjestelmän rakenteesta (kilpaileva vs. ei-kilpaileva määritys), käytetystä analyyttisestä matriisista (seerumi vs. EDTA vs. heparinisoitu plasma) ja natriureettisten peptidien lukuisista kiertävistä muodoista, kuten aiemmin on raportoitu ANP-ja BNP-immunomäärityksissä . Nämä menetelmälliset harhan lähteet voivat olla mahdollisia myös CNP-ja nt-proCNP-määrityksissä, ja ne selittävät siten mainittujen tutkimusten tulosten suuren eron (Taulukko 1).
Tutkimuksen rajoitukset
myönnämme, että otoskoko 12 on liian pieni, jotta voitaisiin päätellä, ettei eroa ole lainkaan. Tilastollisesta näkökulmasta olisi kuitenkin tärkeää täsmentää, kuinka suuri eron on oltava, jotta sillä olisi lääketieteellistä merkitystä. Tietojemme mukaan jälkimmäistä ei ole vielä määritelty selkeästi. Siksi kuviossa annettiin kaikkien toimenpiteiden keinot ja 95 prosentin luottamusvälit, jotta jokainen lukija voi tehdä myös oman tulkintansa aineistosta.
seerumin ja plasman pitoisuuksien osalta on mainittava, että taulukossa 1 ilmoitetut arvot mitattiin eri menetelmillä (RIA, ELISA) potilailla, joilla oli erilaisia sairauksia. Olisi ollut erittäin hyödyllistä verrata CNP-RIA: ta CNP-ELISA-määrityksiin, joissa käytettiin suoraan samoja näytteitä, koska suuruusluokassa on edelleen tuhatkertainen ero. Valitettavasti RIA: n mittauksia ei ollut saatavilla laboratoriossamme. Olney ja työtoverit tutkivat NT-proCNP-pitoisuuden osalta jälkimmäistä vertailua, joka osoitti, että kaupallinen ELISA (Biomedica Medizinprodukte GmbH & Co KG, Wien, Itävalta) antoi arvot, jotka olivat keskimäärin 21% (vaihteluväli 11-52%) RIA-arvoista. ELISA-sarjan vertailustandardin ristivalidoinnissa Ria-määritystä käyttäen ilmeni 15 prosentin erimielisyyttä .
Summary
CNP: n ja NT-proCNP: n mittauksiin ei todennäköisesti vaikuttanut näytteen kulkuajan viivästyminen tai verinäytteen tyyppi (lukuun ottamatta PLASMANÄYTTEIDEN CNP: tä). Plasmanäytteistä ainoastaan EDTA-antikoagulanttiveri verinäytteet soveltuivat tässä tutkimuksessa käytettyyn CNP ELISA-määritykseen. Näin ollen CNP: n ja NT-proCNP: n pitoisuuksia voitaisiin käyttää kliinisissä sovelluksissa CNP: n vaikutusten määrittämiseksi. On myös otettava huomioon, että NT-proCNP-pitoisuus, joka on vain aktiivisen peptidin sivutuote, saattaa peittää CNP: n todellisen luonteen. Poikkeamat joko RIA-määrityksillä tai ELISA-määrityksillä määritetyissä mitatuissa CNP-pitoisuuksissa ovat kuitenkin edelleen selittämättömiä, mutta ne näyttävät todennäköisimmin johtuvan metodologisista seikoista. Siksi CNP: n immunomääritykset on ANP: n ja BNP: n suositusten mukaisesti standardoitava tai yhdenmukaistettava tulevaisuudessa.