ClpP-proteaasiaktivaatio johtuu sähköstaattisten vuorovaikutusverkkojen uudelleenjärjestelystä sisäänkäyntihuokosissa

Acp1: n sitova toimintatapa EcClpP: lle

acp128: n, nmclpp: n ja EcClpP: n rakenteiden (Kuva. 1A) kompleksissa ACP1-analogien kanssa etsittiin. Vaikka nmclpp: n rakennetta sidotulla ACP1: llä ei saavutettukaan toistuvista yrityksistä huolimatta, EcClpP: n+ACP1-06-kompleksin rakenne määritettiin 1,9 Å: n tarkkuudella (Kuva. 1b, c, Taulukko 1), joka sisältää tetradekameerin epäsymmetrisessä yksikössä (ketjut A-N). Ecclppin aksiaalisilmukat muodostavien n-terminaalisten jäännösten elektronitiheys on yhtä alayksikköä (ketju B) lukuun ottamatta epäselvä. Aiemmin julkaistuissa rakenteissa nämä aksiaaliset silmukat ovat erittäin taipuisia ja ne ovat kiteessä yleensä epäjärjestyksessä aktivaattorien puuttuessa tai prekluusiota kidepakkauksin23. Yksiselitteinen elektronitiheys havaittiin yhdelle ACP1-06-molekyylille alayksiköiden D ja E muodostamassa taskussa, jossa yhdisteellä on kaksi eri konfiguraatiota (Fig. 2 A, b). Molemmat konfiguraatiot mallinnettiin elektronitiheydellä, jossa ensimmäinen konfiguraatio sijoittaa yhdisteen trifluorimetyylipyridiiniosan hydrofobiseen taskuun (alaskonfiguraatio), kun taas toinen asettaa sen ulos hydrofobisesta taskusta, joka on alttiina liuottimelle (up-konfiguraatio) (Kuva. 2 a). Loput 13 hydrofobista taskua osoittavat monitulkintaista elektronitiheyttä acp1-06: lle. Mallintimme ja jalostimme kaikki 14 ACP1 – 06-molekyyliä sekä ylös-että alas-kokoonpanoissa 0,5: n käyttöasteella, mikä paransi elektronitiheyttä kullekin ligandille.

acp1-06: n sidontatilat (Kuva. 2b-d) likimääräinen kuin ADEPs havaittu kiderakenteissa eri bakteerien ClpPs (Kuva. 2c-f) 6,15,18,19,21,40. Huomaa, että ryhmämme syntetisoimat yhdisteet numeroidaan ACP1-YY: ksi ja ADEP-YY: ksi, kun taas muiden ryhmien tutkimusten yhdisteet nimetään vastaavissa julkaistuissa papereissa. Kaikki proteiinikontaktit ACP1-06: n kanssa ovat luonteeltaan ei-polaarisia lukuun ottamatta kahta merkittävää sähköstaattista sidosta, jotka tapahtuvat (1) y76: n fenolisen hydroksyylisivuketjun ja ACP1-06: n amidihapen ja (2) r206: n guanidinyylisivuketjun (ecclpp: n toiseksi viimeinen Arg) ja acp1-06: n sulfonyylihapen välillä (Kuva. 2b). Kaksi jälkimmäistä vuorovaikutusta esiintyy ACP1-06: n molemmissa konfiguraatioissa. Lisäksi R206 (ketju E) stabiloidaan ionisella sidoksella viereisen alayksikön E65: n kanssa (ketju D) (kuva. 3 A, b).

alaskonfiguraatiossa ACP1-06: n trifluorimetyylipyridiiniosalla on hydrofobinen onkalo, jonka muodostavat L62, T93 ja F96 (ketju D) sekä Y74, Y76, I104, L203 ja L128 (ketju E) (viikunat). 2b ja 3b). Tämä on sama ontelo, jossa on eri ADEP-analogien eksosyklisen Phe-jäännöksen rengas, joka on kiteytetty ClpP: llä, kuten meidän NmClpP+ADEP-0419 (Kuva. 2e, f)tai EcClpP+ADEP1 structures40 (Kuva. 2c, d). Sen sijaan up-konfiguraatiossa trifluorimetyylipyridiiniosa kiertää C–s-sidoksen ympäri ja altistuu liuottimelle samalla kun van der Waals joutuu kosketuksiin y74: n, I104: n, F126: n ja L203: n (e-ketju) (viikunat) kanssa. 2b ja 3b). Jalokividimetyyliosa pinoaa y74: n tasaista rengasta vastaan (ketju E), kun taas laajennettu alifaattinen ketju, joka päättyy ortokloorisubstituoituun fenyylirenkaaseen, istuu ei-polaarisessa urassa vierekkäisten alayksiköiden kahden kierteen välissä (Kuva. 3b). Tämän sitovan halkion muodostavat L62 (ketju D), F63 (ketju D), A66 (ketju D), L37 (ketju E), V42 (ketju E) ja E40: n nonpolaarinen osa (ketju E) (viikunat. 2b ja 3b).

sekä EcClpP: n ACP1-06 – että ADEP1-sidonnaisissa rakenteissa on intrasubuniittinen suolasilta R36: n ja E40: n välillä, jossa adep1: n läheinen alifaattinen häntä tai ACP1-06: n kloorisubstituoitu fenyylirengas muodostaa hydrofobisen vuorovaikutuksen E40: n sivuketjun kanssa (kuva. 3b, c). Kaksi aktivaattoria stabiloituu edelleen hydrofobisessa kohdassa kahdella erillisellä vetysidoskuviolla. Kun taas ACP1-06 on suojattu liuottimelle altistuneella ionisella vuorovaikutuksella sen sulfonyyliryhmän ja C-terminaalisen r206-jäännöksen välillä (Kuva. 3b), ADEP1 pysyy paikallaan kahdella vetysidoksella, joiden hydroksyyliryhmä Y76 on eristäytynyt hydrofobiseen kohtaan (Kuva. 3c). Liuotinvälitteinen vetysidos E65: n ja ADEP1: n n-asyylife-sivuketjun karbonyyliryhmän välillä vahvistaa edelleen sen vuorovaikutusta EcClpP: n kanssa (kuva. 3c). Tämä ylimääräinen vetysidos sekä syklisen depsipeptidirenkaan suurempi koko, jolla on enemmän pinta-alaa van der Waals-vuorovaikutusten muodostamiseksi verrattuna pienempään acp1: n trifluorimetyylipyridiiniryhmään, voivat selittää ADEPs: n yleensä tiukemman sitoutumisen kuin ACP1s28: n.

EcClpP+ACP1-06-rakenteesta löytyi selittämätön elektronitiheys Kaikissa 14 alayksikössä, jotka ulottuivat katalyyttisen Triadin nukleofiilisesta jäännöksestä S111, mikä viittaa kovalenttiseen muunnokseen (täydentävä Kuva. 1 A, b). Tiheys ulottuu suunnilleen suorassa kulmassa vastakkaisiin suuntiin poispäin S111-sivuketjuista. Laajoista ponnisteluista huolimatta sitä ei voitu vakuuttavasti varustaa peptideillä, asyyliketonituotteilla tai erilaisilla tunnetuilla seriiniproteaasin estäjämolekyyleillä.

Adep: n sitova tila Nmclpp: lle

NmClpP: llä on lyhyempi pro-sekvenssi N-terminaalissa, kun taas C-terminaalissa on neljä ylimääräistä jäämää EcClpP: hen verrattuna (Kuva. 1 A). Vaikka NmClpP ilmaistiin täyspitkänä proteiinina, jossa oli n-terminaalinen His6-tag, havaitsimme toistuvasti, ettei se sitoudu Ni-nitrilotrietikkahappohartsiin. Puhdistetun proteiinin n-terminaalinen sekvensointi paljasti, että kypsä NmClpP alkaa jäämästä Y6 (Kuva. 1a), mikä osoittaa autoproteolyysiä n-terminaalisen pro-sekvenssin (1MSFDN5) vapauttamiseksi.

aiemmin oli selvitetty nmclpp: n rakenne adep-0419: llä. Tässä tutkimuksessa määritimme Apo-NmClpP: n rakenteen 2,0 Å: ksi ja NmClpP: n sidotulla ADEP-14: llä 2,7 Å: ksi (kuva. 1b, c, täydentävä Kuva. 1c, Taulukko 1). Apo-NmClpP: n rakenne sisältää tetradekameerin epäsymmetrisessä yksikössä, eikä siinä ole selvää tiheyttä yhdellekään 14 n-terminaaliselle aksiaaliselle silmukalle. Heikko elektronitiheys havaitaan silmukoissa, jotka muodostuvat jäämistä G133-G137 kahvan alueen säikeessä β8 (Kuva. 1 A). Nmclpp+ADEP-14-Kiteen epäsymmetrinen yksikkö sisältää kaksi tetradekameria (täydentävä Kuva. 1d). Elektronitiheyttä ei havaittu jäämille 1-22 kaikista 28 alayksiköstä kidepakkauksen vuoksi (kuva. 1c, täydentävä Kuva. 1d). Lisäksi β8-juoste (jäämät 130-137; Kuva. 1a) näkyy vain osittain kaikissa alayksiköissä. ADEP-14 on sidottu NmClpP: hen samanlaisessa konfiguraatiossa kuin ADEP-04 (Figs. 2e, f ja 3e, f). Lyhyesti ADEP-14: n difluorifenyyliosalla on hydrofobinen tasku, jonka muodostavat yhden alayksikön Y67, L95, L97 ja L119 ja viereisen alayksikön V49, L53, T84 ja F87 (Kuva. 3 e). Pipekolihappoosan kuusijäseninen rengas on liuotinvalkoinen ja sitä stabiloivat F117: n fenyylirengas ja l97: n, L119: n ja L196: n hydrofobiset sivuketjut (Kuva. 3 e). Ylimääräinen metyylisubstituutio depsipeptidirenkaan allo-treoniinijäämässä (Kuva. 1B) altistetaan liuottimelle. Kuten ADEP-04, ADEP-14 on kiinnitetty erittäin komplementaariseen hydrofobiseen taskuun kahdella vetysidosvuorovaikutuksella Y67: n fenolisen hydroksyyliryhmän, difluorifenyylialaniinijäämän aminoryhmän ja alaniinikarbonyyliryhmän välillä depsipeptidirenkaassa ja liuotinvälitteisellä vetysidoksella E56 (Kuva. 3 e, f). Adep-14: n oktadieenihapon sivuketju sijaitsee kapeassa hydrofobisessa kanavassa, jonka muodostavat yhden alayksikön L53, F54 ja S57 sekä viereisen alayksikön R27, L28, E31, I33, F35 ja Y67 (Fig. 3 e).

ACP1 – ja ADEP-sitova vaikutus aiheuttaa selviä allosteerisia vaikutuksia ClpP – piippuun

käyttämällä ecclpp: n ja nmclpp: n apo-ja yhdisteisiin sitoutuneiden muotojen rakenteita (Kuva. 1c), tutkimme allosteerisia vaikutuksia, joita esiintyy aktivaattorin sitoutumisen yhteydessä. Kuten on esitetty täydentävässä Kuvassa. 2, aktivaattorisidonta toimii kiilana, joka aiheuttaa kahden vierekkäisen alayksikön sivuttaissiirtymän. Acp1-06-sidonnan aiheuttaman globaalin konformaatiomuutoksen laajuus (rmsd = 0,84 Å suhteessa apo-EcClpP: hen) on samanlainen kuin ADEP-04: ssä (rmsd = 0.73 Å suhteessa apo-nmclpp: hen), mutta vähemmän kuin ADEP-14: llä (rmsd = 2,47 Å suhteessa apo-nmclpp: hen). Mielenkiintoista on, että siirtymä on erilainen kahden aktivaattoriluokan välillä(täydentävä Kuva. 2 ja täydentävät Elokuvat 1-4). Kahden Adep: n välillä ADEP-14 aiheuttaa suuremman rakenteellisen häiriön NmClpP-sylinteriin (vertaa Supplementary Movies 3 vs. 4). ADEP-sitoutuminen johtaa nmclpp: n apikaalisen pinnan laajenemiseen, johon liittyy suppeneminen Päiväntasaajan alueella. Tämän liikkeen pivot on kahvan alueella, joka koostuu helix aE: stä ja säikeestä β8. Tämä ilmiö on havaittu kaikissa tähän mennessä tunnetuissa ADEP-sitoutuneissa ClpP-rakenteissa,joissa clpp-sylinterien15,18,19,23, 40 tiivistyminen vaihtelee. Sen sijaan Acp1-06: n Sitominen EcClpP: hen aiheuttaa kaikkien alayksiköiden sisäänpäin suuntautuvan liikkeen, joka johtaa ClpP: N Sylinterin kiristymiseen (Supplementary Movie 1). Näin ollen rakenteet osoittavat, että Acp1: t ja Adep: t aktivoivat ClpP: tä indusoimalla erillisiä allosteerisia vaikutuksia.

aktivaattorisidoksissa EcClpP-ja NmClpP–rakenteissa renkaan ja renkaan rajapinnan sähköstaattiset sidokset, jotka stabiloivat tetradekameeria, säilyvät konformaatiomuutoksista huolimatta (täydentävä Fig. 3). Lisäksi, huolimatta maailmanlaajuisesta rakennemuutoksesta aktivaattorisidonnassa, EcClpP: n ja NmClpP: n ser-His-Asp: n katalyyttiset triadit säilyttävät katalyyttisesti pätevät geometriat, koska aktiivisen kohdan lähellä tapahtuu vain pieniä Ca-selkärangan siirtymiä (täydentävä Kuva. 1a-c). Analyysi kaikista olemassa olevista CLPP: n AKP1 – ja ADEP-sitoutuneista rakenteista osoittaa, että yhdisteen sitoutuminen johtaa myös päiväntasaajan alueen supistumiseen (Supplementary Fig. 4).

määritimme CLPP-sylinterin tiivistymisen ACP1-tai ADEP-sidonnassa mittaamalla vastaavien katalyyttikammioiden tilavuudet (täydentävä Kuva. 4). ACP1 – 06 Sitominen aiheuttaa ~5%: n laskun katalyyttikammion tilavuudessa suhteessa apo-EcClpP: hen. ADEP1-sitoutuminen EcClpP: hen johtaa samanlaiseen katalyyttikammion tilavuuden vähenemiseen. Tämä on havaittu myös muilla aktivaattoreihin sitoutuneilla ClpP-rakenteilla, kuten ADEP-14-sitoutuneella NMCLPP: llä, ADEP-sitoutuneella Bsclpp: llä ja ADEP-sitoutuneella MtClpP1P2-heterooligomeerisella kompleksilla (Supplementary Fig. 4).

ClpP-aktivaatio johtaa elektrostaattisen sidosverkon uudelleenorganisointiin aksiaalihuokosissa

Apo-nmclpp: n rakenteessa kaksi aksiaalisen huokosten lähellä olevaa sähköstaattista sidosta stabiloivat minkä tahansa kahden vierekkäisen alayksikön rajapinnan (Kuva. 3D, täydentävä Kuva. 5). Ensinnäkin yhden alayksikön negatiivisesti varautunut E58-karboksylaattiryhmä muodostaa ioniparin viereisen alayksikön positiivisesti varautuneen R27-guanidiniumryhmän kanssa. Toiseksi kahden vierekkäisen alayksikön S57-hydroksyyli-ja E31-karboksylaattiryhmät muodostavat vetysidoksen. ADEP-sidoksen yhteydessä nämä kaksi epäkovalenttia sidosta katkeavat, kun taas saman alayksikön R27: n ja E31: n välinen ionisidos lyhenee eli vahvistuu (Kuva. 3 e, f). Apo-EcClpP: ssä vain yksi ionisidos E67: n ja R36: n välillä yhdistää kaksi vierekkäistä alayksikköä, koska nmclpp: n S57: ää vastaava jäännös on EcClpP: n alaniini eikä siten pysty muodostamaan vetysidosta E40: n kanssa (kuva. 3 A). Kuten nmclpp: ssä, acp1: n tai ADEP1: n Sitominen EcClpP: hen poistaa intrasubunit E67-R36 ionisidoksen ja synnyttää vahvemman intrasubunit ionisidoksen R36: n ja E40: n välille (Kuva. 3b, c, täydentävä Kuva. 5).

näiden havaintojen tarkentamiseksi suunnittelimme NmClpP: n ja EcClpP: n pistemutantit, jotka johtavat edellä mainittujen intersubuniittien sähköstaattisten sidosten menetykseen. Kuten kuvassa. 4a, vaikka WT NmClpP ei pystynyt hajottamaan proteiinikaseiinia, nmclpp E58A-mutantin havaittiin hajottavan kaseiinia nopeammin kuin E31A-mutantti. Tärkeää on, että kaksoismutantti E31A + E58A: lla oli jopa suurempi aktiivisuus kuin yksittäisillä mutanteilla. Kaksoismutantin nmclpp: n aktivaation laajuus on sama kuin 1 µM ADEPs: n tai 10 µM: n Acp1: n läsnä ollessa (Kuva. 4 A). Samankaltaista käyttäytymistä havaittiin EcClpP: llä, jolla oli samanlaiset mutaatiot (E40A ja E67A; Fig. 4b). Vastaava EcClpP-kaksoismutantti ei liukene, eikä sitä voitu testata.

myöhemmin määritimme Nmclpp E58A-ja NmClpP E31A + E58A-mutanttien Röntgenrakenteet (Taulukko 1). Molempien mutanttien katalyyttialueet eivät ole häiriintyneitä (täydentävä Kuva. 1 e). Nmclpp e58a-yksittäisessä mutaatiossa mutaatio poistaa intrasubunit E58–R27-ionisidoksen ja synnyttää voimakkaamman intrasubunit R27-E31-vuorovaikutuksen, kun taas vetysidos S57: n ja E31: n välillä säilyy (Fig. 4c). Samanlainen” kiilaefekti ” on siis havaittavissa rakenteessa, mikä näkyy nmclpp-mutantin Ca-selkärangan hienoisessa globaalissa konformaatiomuutoksessa (rmsd = 0.33 Å suhteessa WT NmClpP: hen) (täydentävä elokuva 5). Sekä E31: n että E58: n mutaatio alaniiniksi kaksoismutantin nmclpp E31A + E58A tuottamiseksi (rmsd = 0.29 Å suhteessa WT NmClpP: hen) poistaa kaksi stabiloivaa intersubunit sähköstaattista vuorovaikutusta sekä intrasubunit R27–E31 ionisidoksen, joka on läsnä nmclpp e58a: ssa (Kuva. 4d ja täydentävä elokuva 6)ja ADEP-sidottu NmClpP (Kuva. 3 e, f). Siten nmclpp e31a + e58a-kaksoismutantti eroaa adep-sitoutuneesta nmclpp: stä eliminoituneen intrasubuniitti-ionisidoksen kanssa, mutta on kuitenkin aktivoitunut proteiini, jonka luontainen proteolyyttinen aktiivisuus on verrattavissa pienimolekyyliaktivoituun ClpP: hen (Kuva. 4 A). Kuten ADEP-sitoutuneen NmClpP: n, sekä nmclpp: n yksi-että kaksoismutanttien katalyyttikammion tilavuus on pienentynyt ClpP: n tynnyrin tiivistymisen vuoksi (täydentävä Kuva. 4).

tällainen sidosverkon uudelleenjärjestely havaitaan kaikilla PDB: ssä käytettävissä olevilla aktivoiduilla ClpP-rakenteilla, joko pienimolekyylisten aktivaattoreiden läsnä ollessa tai erityisten mutaatioiden vuoksi (täydentävä Fig. 6). Esimerkiksi B. subtilis ClpP: iin (bsclpp), S. aureus ClpP: hen (SaClpP), M. tuberculosis ClpP: hen (MtClpP) ja Homo sapiens ClpP: hen (HsClpP) sitoutuva pienimolekyylinen aktivaattori poistaa yhden tai kaksi intersubuniittia elektrostaattista sidosta lähellä aksiaalista huokosta ja synnyttää voimakkaamman intrasubuniitin ionisen vuorovaikutuksen (Supplementary Fig). 6a–e, g-l)6,15,18,21,39. MtClpP2: ssa E58–R27-vuorovaikutusta vastaavaa intersubunit-ionisidosta NmClpP: ssä ei ole olemassa 18. Nmclpp: n E58: n vastaava jäämä on L66 MtClpP2: ssa, eikä se voi osallistua ioniseen vuorovaikutukseen MtClpP2: n K35: n kanssa (vastaa NmClpP: n R27: ää). Sen sijaan s65: n ja E39: n välinen intersubunit vetysidos stabiloi rajapinnan (Supplementary Fig. 6g, h). Adep-sidos MtClpP2: een rikkoo S65-E39-vetysidoksen ja vahvistaa intrasubuniitti-ionisidosta K35: n ja E3918: n välillä.

mielenkiintoista on, että jopa aktivoitu SaClpP Y63A variant41, jonka aktivoiva mutaatio löytyy hydrofobisen kohdan keskeltä, eikä siten vastaa tässä esitettyjä nmclpp: n aktivoivia mutaatioita, tukee ehdotettua malliamme vetysidosverkoston uudelleenorganisoinnista aksiaalisen huokosen ympärillä clpp-aktivaation yhteydessä (täydentävä Kuva. 6 f). SaClpP Y63A-mutantin rakenteessa intersubunit–ioniparin (Q54–R23) välinen etäisyys kasvaa, kun taas intrasubunit-suolasilta (R23-D27) vahvistuu (täydentävä Kuva. 6d, f). Loimme myös vastaavan Y63A-mutaation sekä EcClpP: ssä että NmClpP: ssä. Nmclpp Y67A-mutantti oli liukenematon, kun taas EcClpP Y76A: n aktiivisuus oli hieman korkeampi kuin E40A-mutantin, mutta pienempi kuin E67A-mutantin (Kuva. 4b).

ClpP-aktivaatio johtaa n-terminaalisen aksiaalisen silmukan rakenteellisen heterogeenisuuden vähenemiseen

kuten edellä todettiin, nmclpp+ADEP–04-kompleksin järjestetyssä aksiaalisessa silmukassa, joka muodostaa β1-β2-hiusneulakierroksen, ADEP-sidos vapauttaa R27: n intersubunit ionisidoksesta E58: n kanssa ja vahvistaa intrasubunit ionisidosta E31: n kanssa helix aA (Kuva. 5 a). Näin ollen R27 muodostaa ionisidoksen aksiaalisen silmukan β1-juosteen D23: n kanssa. Tämä stabiloiva vuorovaikutus havaitaan kaikissa clpp: n aktivaattorisidonnaisissa rakenteissa, joissa aksiaaliset silmukat ovat järjestyksessä (Kuva. 5a-e).

EcClpP+ACP1 – 06–rakenteessa aksiaaliset silmukat (jäännökset 14-31) ovat osittain järjestyneet kiteessä siten, että vain 1 14: stä aksiaalisesta silmukasta muodostaa β1-β2-hiusneulakierroksen (Kuva. 1C-täydellinen tilaaminen näyttää osittain estyvän kristallipakkaustehosteilla). Alayksikön a järjestetyssä aksiaalisessa silmukassa R36: n vapautuminen intersubunit ionisidoksesta E67: n kanssa mahdollistaa sen muodostamaan vahvemman intrasubunit ionisidoksen E40: n kanssa helix aA (Kuva. 5 F). Β1-säikeen E22: n ja helix aA: n R36: n välillä ei kuitenkaan ole stabiloivaa ionista vuorovaikutusta, mikä todennäköisesti johtuu osittaisesta järjestyksestä (Fig. 5 F). Ylimääräinen vetysidos säikeiden β2 D32 ja helix aA S21 välillä ankkuroi aksiaalisen silmukan EcClpP – ydinalueeseen (Kuva. 5 F). Vastaavasti Enterococcus faecium ClpP (EfClpP)-ADEP4-rakenteen aksiaaliset silmukat ovat vain osittain järjestyksessä21. Helix aA: n ARG-jäännöksen ja nauhan β1 negatiivisesti varautuneen jäännöksen välistä säilynyttä vetysidosta ei nähdä osittain järjestyneissä EfClpP: n aksiaalisissa silmukoissa, vaikka EfClpP: llä on potentiaalisia vetysidoksen muodostavia jäämiä säikeessä β1 (T6) ja silmukan yhdistävissä säikeissä β1 ja β2 (E9, Q10, S11, S12, E15) (Kuva. 5g).

säilyneiden sähköstaattisten vuorovaikutusten lisäksi laajat hydrofobiset kontaktit ClpP-päädomeenin kanssa vakauttavat aksiaalisia silmukoita. Ecclpp+ACP1-06: ssa säikeiden β1 ja sitä edeltävän jäsennellyn käämin n-terminaaliset jäännökset osallistuvat hydrofobisiin vuorovaikutuksiin saman alayksikön helixin aA ei-polaaristen jäännösten kanssa ja viereisen alayksikön helixin aA’ ja aB’ hydrofobisilla pinnoilla (täydentävä Kuva. 7 a). Kierteillä aA, aB’ ja β3′ olevat ei-polaariset jäännökset muodostavat jatkuvan hydrofobisen laastarin aksiaalisen huokosen kehällä (täydentävä Kuva. 7b)15.

jotta saataisiin selkeämpi kuva ClpP: n aksiaalisten silmukoiden konformatiivisesta heterogeenisuudesta, suoritettiin metyyli-TROSY NMR-kokeita. Aluksi nmclpp: n(T10C) aksiaalisissa silmukoissa esiintyi yksi kysteiinimutaatio. Syntyi tasaisesti deuteroitua proteiinia, joka reagoi sen jälkeen 13C-metyyli-metaanitiosulfonaatin (MMTS) kanssa. Tämä johtaa yksittäisen NMR–näkyvän 13ch3-S-ryhmän kiinnittymiseen kysteiinin sivuketjuun, jolloin muodostuu S-metyylitio-kysteiini (MTC) – residue42. Tämä menetelmä tarjoaa helpon tavan seurata suurten kompleksien rakennetta ja dynamiikkaa liuoksessa. Kun seurataan kiinnitetyn spin-anturin NMR-korrelaatioita entsyymin vapaissa, aktivaattoriin sitoutuneissa tai mutatoituneissa muodoissa, saadaan lukema aksiaalisten huokosten liuoskonformaatiosta.

aluksi tehtiin kontrollikokeita sen varmistamiseksi, että T10MTC-osan käyttöönotto ei häiritse NmClpP: n rakennetta. Lyhyesti, 1h-13c heteronuclear multiple quantum coherence (hmqc) korrelaatiot WT ja T10MTC NmClpP merkitty 13ch3 sivuketjussa ILVM jäämien muuten täysin deuteroitu Tausta verrattiin ja todettiin olevan lähes identtisiä. Myöhemmin eri osavaltioissa saatiin NMCLPP T10MTC: n 1h–13c HMQC-korrelaatioita (Kuva. 6 A). Apo-muodossa (siniset ääriviivat) on suuri määrä korrelaatioita, jotka ilmaisevat rakenteellisesti heterogeenisiä aksiaalisia silmukoita. Adep-28: n kaksinkertaisen mooliylimäärän lisääminen (aktiivisuus esitetty kuvassa. 4a) yli monomeerinen ClpP vähensi merkittävästi korrelaatioiden (punaiset ääriviivat) määrää, mikä viittaa jäykkyyteen tai rakenteelliseen järjestykseen. Sitä vastoin ACP1-17-sitoutuminen (molaarinen kaksiosainen ylitys monomeeriseen ClpP: hen nähden; aktiivisuus esitetty kuvassa. 4a) johtaa havaittaviin muutoksiin havaituissa korrelaatioissa (vihreät ääriviivat), mikä tarkoittaa, että aksiaaliset silmukat ovat muuttumattomia.

tätä lähestymistapaa hyödynnettiin myös mutaatioiden aktivoivan vaikutuksen seurannassa (Fig. 4A, b) aksiaalisilla silmukoilla. Näissä kokeissa aktivoivat mutaatiot otettiin käyttöön t10c (labeling) – mutaation taustalla. Kuten kuvassa. 6a, korrelaatiot NmClpP T10MTC / e31a mutantti (punaiset ääriviivat) on hieman vähemmän heterogeeninen kuin pseudo WT muoto, kun taas nmclpp T10MTC/E58A mutantti (oranssi ääriviivat) ovat lähes muuttumattomia. Molempien aktivoivien mutaatioiden samanaikaisella läsnäololla (NmClpP T10MTC/E31A + E58A) on paljon dramaattisempi vaikutus kuin yksittäisillä mutaatioilla ja se poistaa suuren määrän aksiaalisia silmukoita vastaavia korrelaatioita (mustat ääriviivat). Tämä on yhtäpitävä havainnon kanssa, että kaksoismutantti on aktiivisempi kuin yksittäiset mutantit (Kuva. 4 A).

ClpP-aktivaatio johtaa kahvan alueen konformisen heterogeenisuuden vähenemiseen

samaa NMR-lähestymistapaa käytettiin aktivaattorin sitoutumisen ja mutaatioiden vaikutuksen tutkimiseen kahvan alueella. NMR valmisti ja tutki nmclpp: n i144mtc (helix aE) – mutantin apo -, ADEP-28-ja ACP1-17-sidotuissa muodoissa. Apo-muoto (siniset ääriviivat, Kuva. 6a) esittelee pari huippuja, mikä osoittaa, että kahva alue liittyy pari rinnakkain konformaatioita, kuten nähdään edellisessä työssämme EcClpP4. Mielenkiintoista on, että ACP1: n ja ADEP: n lisääminen johtaa yhden huipun katoamiseen. Koska aktivaattorin sitoutumiskohta on distaalinen NMR-spin-anturiin nähden, näyttää siltä, että ACP1-tai ADEP-sitoutumiskohta allosteerisesti valitsee yhden kahvan alueen konformaatioista. Vaihtoehtoisesti aktivaattorit voivat sitoa molemmat muodot, mutta aiheuttaa muutoksen yhteen tilaan.

Magnetointivaihtokokeet, joissa sekoitetaan viivejaksoja 100, 200, 300, 400, 500, ja 600 ms 40 °C: n lämpötilassa ei kyetty havaitsemaan WT NmClpP: n kahvan alueella havaittavaa konformeerien välistä transkonversiota. Tämä osoittaa, että vaihtoprosessi on liian hidas NMR: n luonnehtimiselle.

SAXS osoittaa aktivaattorin indusoimat ClpP-konformaatiomuutokset liuoksessa

oligomeerisen tilan ja rakennemuutokset yhdisteen sitoutuessa, apo-nmclpp-ja nmclpp+ADEP-04-näytteille oli ominaista SAXS (Kuva. 6b-g ja täydentävä Kuva. 8). Lopulliset yhdistetyt käyrät on esitetty kuvassa. 6b, ja SAXS profiilit saatu muistutti kuin ontto rakenteita43. Kokonaistaipeessa ei havaittu merkittäviä muutoksia (täydentävä viikuna. 8), pyörähdyksen säde (Rg) ja oligomeerinen tila, kun ADEP-04 lisättiin NmClpP: hen (täydentävä Kuva. 8 c). Jotta edelleen analysoida NmClpP SAXS profiilit ja tuottaa ratkaisu ab initio rakenteita, GNOM ohjelma käytettiin rakentaa pari etäisyysjakauma toimintoja, p(r). Apo-NmClpP p(r) paljasti hienovaraisen oikean siirron ja suuremman maksimiulottuvuuden (Dmax) verrattuna ADEP-04-sidottuun NmClpP: hen (Kuva. 6c ja täydentävä Kuva. 8 c). Myöhemmin, dummy atom mallit (DAMs) luotiin käyttäen SAXS data visuaalisesti analysoida nmclpp ratkaisu rakenteita (Fig. 6d-g). Apo-NmClpP: lle ja ADEP-04: lle sidotulle NmClpP: lle valmistettiin kymmenen mallia, joista valittiin todennäköisimmät. Nämä mallit osoittivat, että kaiken kaikkiaan kaksi nmclpp-ratkaisurakennetta ovat samanlaisia (onttoja sylintereitä). Kuitenkin, kun päällekkäin vastaavat kiderakenteet, eroja, jotka sopivat korkean resoluution rakenteita oli helppo havaita (Kuva. 6d, e). Kaikkien kymmenen padon aksiaalisten korkeuksien mitta apo-ja ADEP-04-sidotulle NmClpP: lle johti arvoihin 93,0 ± 5,4 Å apo-muodolle ja 103,5 ± 6,1 Å ADEP-04-sidotulle muodolle. Tämän havainnon vahvistamiseksi keskimääräiset patojen todennäköisyyskartat ja korkeimmat das: N käyttöastekartat (Kuva. 6F, g) analysoitiin. Aksiaaliset korkeudet osoittivat noin 10 Å: n lisäystä ADEP-04-sidotulle NmClpP: lle verrattuna apo-nmclpp: hen. Lisäksi ADEP-04-sidotulla NmClpP: llä oli suurempi aksiaalinen huokoskehä kuin apo-nmclpp: llä (Kuva. 6f, g). Saxs-tekniikan matalasta resoluutiosta huolimatta tulokset viittaavat siihen, että ADEP-04: n sitoutuminen NmClpP: hen ei vaikuta nmclpp: n oligomeeriseen tilaan, vaan aiheuttaa aksiaalisten huokosten laajenemisen ja lisääntyneen miehityksen nmclpp: n+ADEP-04: n padon ylä-ja alaosissa (Kuva. 6e, g) verrattuna apo-nmclpp: hen. Tämä todennäköisesti heijastaa konformaatiomuutoksia, jotka johtavat röntgen-ja NMR-menetelmällä havaittuun Nmclpp: n n-terminaalisten aksiaalisten silmukoiden rakenteen pienempään heterogeenisuuteen.