Chp1 kromomaiini sitoo h3k9me: n häntää ja nukleosomiydin heterokromatiinin kokoamiseen

plasmidit ja kantojen rakenne

chp1cd-mutantit ilmentymistä ja puhdistumista varten syntyivät käänteisessä PCR: ssä käyttäen täydentävässä taulukossa S2 lueteltuja alukkeita alkaen pet28a CHP1 kromodomaiiniplasmidi . Heterokromatiinin rescue-määritykset suoritettiin lisäämällä plasmideja, jotka sisälsivät CHP1 wt: tä ja chp1-mutanttiproteiinia endogeenisen promoottorinsa alla chp1δ-kannassa (SP170, KS .täydentävä taulukko S3). CHP1-täysmittainen geeni ja sen endogeeninen promoottori (-949 bp CHP1+ – koodaussekvenssin alusta) kloonattiin pREP1-plasmidissa. CHP1 kromodomaiinimutantit on tuotettu käänteisellä PCR: llä käyttäen täydentävässä taulukossa S2 lueteltuja alukkeita ja muunnettu ilmoitetussa chp1Δ-kannassa.

genomien integroinnissa pREP1—plasmidia muutettiin korvaamaan nmt1+- promoottori seuraavalla integraatiokasetilla: (SphI) alue Chp1—geenin (kromosomi I, 2215500-2215055) (AscI)—HphMX6-resistenssikasetti – (SphI) CHP1 endogeeninen promoottori (kromosomi I, 2214829-2214664) – CHP1-koodaussekvenssi – (bamhi) CHP1-terminaattori (kromosomi i, 2210976-2210582) (bamhi). Integraatiokasetti (sekä chp1+ – että chp1LOOP1B/2b-kasetti) monistettiin PCR: ksi ja muunnettiin elektroporaatiolla SP101 -, SP170-ja SP64-kannoiksi. Tämän jälkeen solut valittiin Kyllä+ Hygromysiini (50 mg ml−1 Hygromysiini) – levyillä. Yksittäiset pesäkkeet eristettiin, PCR seulottiin ja sekvensoitiin HphMX6-resistenssikasetin ja LOOP1B/2b-mutaatioiden genomiseksi.

plasmideja sisältäviä kantoja kasvatettiin Edinburgh Minimal Medium Complete (EMMC)-leu-alustalla. Kaikki tässä tutkimuksessa käytetyt kannat ja plasmidit on lueteltu täydentävissä taulukoissa S3 ja S4.

proteiinin puhdistus

His6-SUMO-Chp1CD ja kaikki CD-mutantit ilmaistiin e: nä. coli BL21 (DE3) (pLys) ja puhdistettu affiniteettikromatografialla käyttäen Ni-NTA-hartsia (GE Healthcare, Freiburg, Saksa). His6-SUMO-Chp1CD sisältää trombiinin pilkkoutumiskohtaa kahden tagin välissä .

yhteensä 0, 2 mM IPTG: tä lisättiin indusoimaan proteiinin ilmentymistä ja sen jälkeen kasvua 18 °C O/N: n lämpötilassa.solut kerättiin sentrifugoimalla ja suspendoitiin uudelleen lyysipuskuriin (20 mM 4-(2-hydroksietyyli)-1-piperatsiinietaanisulfonihappo (HEPES) pH 7, 5, 150 mM NaCl, 1 mM ditiotreitoli (DTT), 20 mM imidatsoli). Salamajäädytyksen jälkeen soluja sulatettiin ja inkuboitiin 30 min lysotsyymissä ennen sonikointia (Branson Sonifier 250-lähtö 4, toimintasykli 40). Suspensio sentrifugoitiin (12000 g, 20 min 4 °C: ssa) ja supernatantti lisättiin ni-NTA-hartsiin, joka oli esivakioitu sitovassa puskurissa (20 mm HEPES pH 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM DTT, 20 mM imidatsoli) ja inkuboitiin 30 min 4 °C: ssa pyörimislämpötilassa. Tämän jälkeen hartsi pestiin 5× sitovalla puskurilla ja proteiinit eluoitiin eluutiopuskurissa (20 mm HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 300 mM imidatsoli). Tämän jälkeen chp1cd wt ja mutantit värjättiin O/N puskurissa, jossa oli 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT. His6-SUMO-CHP1CD puhdistettiin edelleen geelisuodatuksella (Superdex 75 pg; GE Healthcare) ja dialysoitiin puskurissa, joka sisälsi 20 mm HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM DTT.

Äänenvaimennuskokeet

Äänenvaimennuskokeissa käytettävät solut kasvatettiin OD: ksi 0, 7–1 ja normalisoitiin sitten lopulliseksi pitoisuudeksi 1×107 solua ml−1 viljelmää. Kymmenkertaisia sarjalaimennoksia tehtiin niin, että tiheimmässä kohdassa oli 1×105 solua. Soluja havaittiin epäselektiivisillä (Kyllä) ja 5-fluori-oroottihapon (5-FOA 1 g L−1 5-FOA) levyillä. Levyjä inkuboitiin 32 °C: ssa 2-3 päivää ja kuvattiin. Soluissa on ura4-reporterigeeni, joka on työnnetty perisentromeerisiin IMR-toistoihin (heterokromaattinen lokus). Kun ura4 reporter-geeni hiljennetään, solut voivat kasvaa 5-FOA: ta sisältävässä väliaineessa. Heterokromatiinin kadotessa ilmenee ura4-reporter-geeni, eivätkä solut kykene kasvamaan 5-FOA-väliaineessa.

RNA-tasojen osoittaminen qPCR (RT-qPCR)

Hiivaviljelmät (10 ml) kasvatettiin OD600: aan 0, 7–1, 5. Tämän jälkeen solut suspendoitiin uudelleen 500 µl: n hajoamispuskuriin (300 mM NaOAc pH 5,2, 1% natriumdodekyylisulfaattia) ja 500 µl: n fenolikloroformiin ja inkuboitiin 65 °C: ssa 10 minuutin ajan jatkuvalla sekoittumisella. Vesifraktio erotettiin fenoli-kloroformista sentrifugoimalla (10 min, 20 000 g) ja etanoli saostettiin. Nukleiinihappoja käsiteltiin DNaasi I: llä (Roche, Basel, Sveitsi) 30 minuutin ajan 37 °C: n lämpötilassa ja sen jälkeen 15 minuutin ajan 75 °C: n lämpö inaktivaatiossa. Komplementaarinen DNA syntetisoitiin käyttämällä 100 ng RNA: ta ja 1 pmol: a DNA-oligosia Superscript III: lla (Invitrogen, Darmstadt, Saksa) standardiolosuhteissa. RNA-tasot kvantifioitiin qPCR: llä Biozymin Dynamo Flash qRT-PCR kit: n avulla ja normalisoitiin euchromatic geeni tdh1: ksi.

RNA-elektroforeettiset liikkuvuusmuutoskokeet

RNA-siirtymäkokeet tehtiin aiemmin raportoitujen olosuhteiden perusteella . Yhteensä 0.66 pmol: a 32P: n radioaktiivisesti merkittyä 30 nt: n sentromeerista RNA: ta inkuboitiin 10 µM: n CHP1-kromodomaanilla (villityyppinen ja mutantti) puskurissa, jossa oli 20 mM Tris-HCl pH 7, 5, 100 mM KCl, 0, 5 mM DTT ja 3% glyserolia. 100 nt: n DG-sentromeeristen transkriptien RNA: sta 2 pmol: ia 32P: n radioleimattua RNA: ta inkuboitiin 0, 2 (1:1), 10 (1:5), 20 (1:10) Chp1CD-proteiinin pmolit (wt ja LOOP1B / 2b-mutantti) 15 µl lopullisessa tilavuudessa. H3K9me3-peptidi (Eurogentec, Köln, Saksa) lisättiin 1:1 Chp1CD – H3K9me-peptidillä, kuten on raportoitu . Inkubaatiota suoritettiin 1 tunnin ajan jäällä, ja näytteet (20 µl lopullinen tilavuus) lastattiin 10-prosenttiseen akryyliamidi-TBE-kotoperäiseen geeliin (bis-Akryyliamidisuhde 1:29). In vitro-RNA-poistoissa 1 µg SUMO-Chp1CD: tä (villityyppinen ja LOOP1B/2b-mutantti) sitoutui 15 µl: aan ni-NTA-hartsia (GE Healthcare) ja h3k9me3-Tumakompleksi lisättiin Chp1cd-H3k9me3-Tumakompleksin kokoamiseksi sitovaan puskuriin (20 mM HEPES pH 7, 5, 75 mM KCL, 0, 5 mM DTT, 20 mM imidatsoli). Kun hartsi oli pesty kolme kertaa 50 µl: lla sitoutumispuskuria, siihen lisättiin 2 pmol: ia 32P-merkittyä 100nt DG-RNA: ta ja sitä inkuboitiin chp1cd-Nukleosomihartsilla jäällä 1 tunnin ajan. hartsi sentrifugoitiin hitaalla nopeudella (60 g, 10 s) ja läpivirtaus kerättiin. Hartsia pestiin kolme kertaa vähintään 3× (v/v) sitovalla puskurilla ja Chp1CD-Nukleosomi-RNA-kompleksi eluoitiin lisäämällä 300 mM imidatsolipuskuria (20 mM HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM DTT, 300 mM imidatsoli), inkuboitiin 1 tunnin ajan jäällä 5 minuutin välein sekoittamalla (sidottu fraktio). Näytteet lastattiin 10-prosenttiseen TBE-luonnolliseen Akryyliamidigeeliin (bis-Akryyliamidisuhde 1:29), ja ne kestivät 2 tuntia 10 mA: n lämpötilassa 4 °C: ssa.yön yli kestäneen altistuksen jälkeen geelit skannattiin TyphoonFLA9000 phosphoimagerilla.

kromatiini-immunopresipitaatio

Hiivaviljelmät (100 ml) kasvatettiin 0, 7: n OD600-arvoon ja yhdistettiin 3% formaldehydiin huoneenlämmössä 15 minuutin ajan kuvatulla tavalla . Reaktiota sammutettiin 125 mM glysiinillä 10 minuutin ajan huoneenlämmössä. Solut suspendoitiin uudelleen 500 µl: n lyysipuskuriin (50 mM HEPES pH 7,5, 1.5 M natriumasetaatti, 5 mM MgCl2, 2 mM etyleenidiamiinitetraetikkahappo, 2 mM etyleeniglykolitetraetikkahappo, 0, 1% NP-40, 20% glyserolia), joka sisältää proteaasinestäjiä (proteaasinestäjä cocktail-tabletit, Roche, Täydelliset, etyleenidiamiinitetra-etikkahappovapaat). Jäätyneet solut lysättiin MP Biospec-helmiveitsellä. Lyysin jälkeen uutetta sonikoitiin 35× 30 sekunnin ajan (Bioruptor, Diagenode, Seraing, Belgia) ja kehrättiin 13 000 grammassa 15 minuutin ajan kromatiinin supernatantin saamiseksi. Syötteen DNA: han käytettiin 50 µl supernatanttia. Immunopresipitaatioissa supernatantit normalisoitiin proteiinipitoisuuden perusteella ja inkuboitiin anti-dimetyloidulla H3K9-vasta-aineella tai anti-Chp1-vasta-aineella (H3K9me2, Abcam no. Ab1220 ja Chp1, Abcam no. Ab18191), immobilisoituna magneettisilla Dynabeadeilla 2 tunnin ajan 4 °C: ssa.helmet ja immobilisoitu proteiini pestiin 5× 1 ml: lla lysis-puskuria. Proteiinit eluoitiin inkuboimalla 150 µl eluutiopuskuria (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM etyleenidiamiinitetraetikkahappo, 1% natriumdodekyylisulfaatti) 65 °C: ssa 15 minuutin ajan. Ristisidokset kumottiin inkuboimalla 65 °C: ssa yön yli, minkä jälkeen RNA: n hajoaminen RNaasi A: lla ja proteiinin hajoaminen proteinaasi K: lla.tämän jälkeen DNA otettiin talteen fenoli–kloroformiuuttamalla ja etanolisaostamalla ja määritettiin qPCR: n avulla. Normalisointiin käytettiin eukromaattista geeniä tdh1. Oligonukleotidit, joita käytetään kromatiinin immunoprecipitaatiomäärityksissä, on lueteltu täydentävässä taulukossa S2.

nukleosomin käyttövalmiiksi saattaminen in vitro ja (H3K9me3) metylointi

Nukleosomit saatettiin käyttövalmiiksi käyttämällä Xenopus laevis-histoneja ja aiemmin kuvattua 601-sekvenssiä . In vitro metylaatio tehtiin kuvatulla tavalla . Huippu + 42 Da on havaittu alkuperäisessä julkaisussa ja se ei ole saastuminen (Matt Simon, henkilökohtainen viestintä ja kuvattu ).

in vitro Chp1CD-H3K9me3 MLA Nukleosomikompleksin muodostuminen ja eluutiot

yhteensä 5 µg Chp1CD: tä sitoutui 15 µl: aan ni-NTA-hartsia sitoutumispuskurissa (20 mm HEPES pH 7, 5, 75 mM KCL, 0, 5 mM DTT, 20 mM imidatsoli) 20 minuutin ajan 4 °C: ssa. Hartsi pestiin kerran viidellä tilavuudella sitovaa puskuria ja siihen lisättiin 10 µg h3k9me3-metyylilysiinianalogin (MLA) nukleosomeja (MLA-nukleosomit dialysoitiin aiemmin sitoutuvassa puskurissa) lopullisessa tilavuudessa 20 µl ja inkuboitiin 1 h jäällä jatkuvalla uudelleensuspensiolla 5 minuutin välein. Inkuboinnin jälkeen hartsi sentrifugoitiin (60 g 10 s) ja läpivirtaus kerättiin. Tämän jälkeen hartsi pestiin kolme kertaa viidellä tilavuudella sidontapuskuria. SUMO-Chp1CD-H3k9me3-Tumakompleksi eluoitiin lisäämällä trombiinia (Sigma, München, Saksa) 2 tunnin ajan jäällä 20 µl: aan sitoutuvaa puskuria. Kompleksinmuodostusta arvioitiin sitten SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla 15% akryyliamidigeelillä ja negatiivisella em-tahralla.

Chp1CD H3K9me3-peptidisidontakokeet

yhteensä 1 µg-Histoni H3 (1-21)-Ggk(biotiini) – peptidiä (Eurogentec) inkuboitiin 15 µl streptavidiini-agaroosihartsia (Invitrogeeni) 20 mm HEPES pH 7, 5, 75 mM KCl, 0, 5 mM DTT. Tämän jälkeen noin 5 µg Chp1CD: tä (sekä wt että mutantteja) lisättiin lopulliseen tilavuuteen 20 µl ja inkuboitiin 1 tunti jäällä samoissa puskuriolosuhteissa. Hartsi pestiin kolme kertaa ja sen jälkeen sidontatehokkuus arvioitiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla 15% akryyliamidigeelillä. Sidonnan kvantifiointi tehtiin ImageJ-ohjelmiston avulla. Kunkin mutantin sitoutuminen normalisoitiin wt Chp1CD: ksi kussakin määrityksessä.

mikroskooppinen termoforeesi (MST)

MST: lle SUMO-tunniste poistettiin Chp1CD-konstruktioista, joissa oli Ulp1-proteaasi. Yhteensä 100 µg villityyppistä ja mutanttia Chp1CD: tä leimattiin fluoresenssilla käyttäen Mo-L003 Monolith Protein Labeling Kit BLUE-NHS (Amine Reactive) valmistajan ohjeiden mukaan (Nanotemper Technologies, München, Saksa). Fluoresenssi: Proteiinisuhde 1: 1 arvioitiin Nanodrop1000−ohjelmiston ”Proteins and Labels” – ominaisuuden avulla, ja jokainen CHP1-Kromodomaani suoritettiin 15-prosenttisella SDS-akryyliamidigeelillä pitoisuuksien normalisoimiseksi 0, 1 mg ml-1: een.

reaktiot koottiin 20 µl: aan 300 ng fluoresoivaa Chp1CD: tä ja lisääntyviä määriä-Histoni H3 (1-21)-Ggk(biotiini) peptidiä (Eurogentec) tai H3k9me3-Nukleosomeja puskuriin, jossa oli 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5 mM DTT ja 0,05% Tween-20. H3k9me3nukleosomeja sitovissa määrityksissä glyserolia lisättiin 10%: n lopulliseen konsentraatioon. H3k9me3-määrityksissä näitä laimennoksia käytettiin mittauksissa: 0 nM, 9 nM, 13 nM, 20 nM, 31 nM, 46 nM, 70 nM, 105 nM, 158 nM, 237 nM, 355 nM, 530 µM, 800 µM, 1,2 µM, 1,8 µM. H3k9me3-Tumakokeessa käytimme mittauksissa seuraavia laimennoksia: 0 nM, 18 nM, 27 nM, 41 nM, 62 nM, 93 nM, 140 nM, 210 nM, 316 nM, 474 nM, 711 nM, 1.06 µM, 1.2 µM, 1.4 µM, 1.6 µM, 2.4 µM.

MST-ajot suoritettiin NT: llä standardikäsitellyillä hiussuonilla (Nanotemper Cat#K002).115 Monolith instrument. Kaikki mittaukset tehtiin käyttäen 80% LED-ja 40% MST-tehoa, 30 s Laser on time ja 5 s Laser Off time. Jokaista koetta varten tehtiin viisi yksittäistä mittausta.

tiedot analysoitiin GraphPad Prism-ohjelmiston versiolla 6.00 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) ja SigmaPlot software version 13.0 (Systat Software, San Jose, CA, USA). Peptidisidontakokeissa, joissa käyrät osoittavat erillisen sigmoidisen suuntauksen, sovitimme Richards five-parametrin logistisen epäsymmetrisen sigmoidisen yhtälön ja laskimme automaattisesti KD: n. H3k9me3nukleosomia sitovissa määrityksissä, koska raakatietosuuntaus ei ollut enää sigmoidi kaikille analysoiduille proteiineille, käytettiin kolmannen kertaluvun polynomiyhtälöä (kuutioyhtälö) villityypin Chp1CD: n ja eri mutanttien raakatietopisteiden sovittamiseen ja vertailuun. Kd laskettiin GraphPad prism-ohjelmiston ”interpolaatio” – ominaisuuden perusteella käyttäen 50%: n sidottua/sitoutumatonta arvoa y-akselilla.

Nukleosomitrypsiinin digestio

Pyrstöttömät nukleosomit valmistettiin inkuboimalla rekonstruoituja nukleosomeja immobilisoidulla Tpck-Trypsiinihartsilla (Termoscientific) 2 tunnin ajan huoneenlämmössä puskurissa, jossa oli 20 mm HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM DTT . Tryptic digestion tuottaa hyvin määritelty Histoni bändejä ja se on kuvattu yksityiskohtaisesti, missä tarkalleen trypsiini leikkaa .

Nukleosomeja sitovat määritykset, joissa oli Chp1CD-mutantteja

chp1cd-villityyppisiä ja mutanttinukleosomeja sitovia määrityksiä, tehtiin edellä kuvatulla tavalla Chp1CD-H3KC9me3 MLA—Nukleosomikompleksin muodostumiselle 20 mm HEPES: ssä pH 7, 5, 100 mM KCL, 0, 5 mM DTT, 40 mM imidatsoli. Hartseja ja sisääntuloja käytettiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla 15% akryyliamidigeeleillä. Kaikki näytteet analysoitiin immunoblot anti-H3 Histoni (AbCam, Cambridge, UK, 1: 1000), tai anti-h3k9me3 vasta (AbCam, 1:1000), anti-goat IgG-HRP (BioRad, 1: 3000) anti-rabbit IgG-HRP (BioRad, München, Saksa, 1:3000).

negatiivinen värjäyselektronimikroskopia

trombiinieluution jälkeen 3 µl Chp1CD–H3KC9me3-nukleosomikompleksia havaittiin hehkupurkatussa kupariverkossa (CU 400 mesh Q11916, Quantifoil, Großlöbichau, Saksa), joka oli päällystetty 1 nm: n hiilikalvolla 45 sekunnin ajan. uranyyliasetaatti. Negatiiviset tahrakuvat kerättiin Fei Morgagnin transmission elektronimikroskoopilla.

Kryo-EM Chp1CD–H3KC9me3-nukleosomikompleksi

Kryo-EM-Ristikot (Holey-hiilipäällysteiset Ristikot, Cu 300 Mesh R3/3+1 nm hiilikerros, Kvantifoil) valmistettiin Vitrobot Mark IV-menetelmällä (Fei-yritys). Cryo-EM-tiedot kerättiin Titan-Krios-siirtoelektronimikroskoopilla (Fei Company, Hillsboro, OR, USA) 200 KeV ja suurennoksella 113 000× CCD: n tasolla käyttäen f816 CMOS-kameraa (TVIPS GmbH, Gauting, Saksa), jolloin kuvan pikselikoko oli 1,2 Å per pikseli kohteen mittakaavassa (CCD: n pikselikoko oli 13,6 µm). Automaattisessa tiedonkeruussa käytettiin EM-TOOLS-ohjelmistoa ja dataa kerättiin defocus-alueella 10 000-40 000 Å.

chp1cd–H3KC9me3-kompleksille valittiin yhteensä 2 480 mikrografia ja H3KC9me3-nukleosomikontrollille 991 mikrografia yksihiukkasanalyysia varten Xmipp-ohjelmistopaketin avulla (täydentävä Kuva S9A) . Muutama tuhat hiukkasta poimittiin käsin ja puhdistettiin huolellisesti melusta. Näitä hiukkasia käytettiin tämän jälkeen puoliautomaattiseen ja automaattiseen hiukkaskeräykseen XMIPP: ssä. Kontrastinsiirtofunktio määritettiin ctffind3: lla . Valitut yksittäishiukkaset muunnettiin SPIDER-ja RELION-formaatteihin tarkempaa analyysiä varten (täydentävä Kuva S9B). Kaksiulotteiset luokkakeskiarvot on tuotettu RELION-ohjelmistopaketilla (täydentävä Kuva S9C) . Huonot luokkakeskiarvot poistettiin aineiston tarkemmasta analysoinnista. Kolmiulotteiset tarkennukset tehtiin myöhemmin SPIDER-ja RELION-ohjelmistopaketeilla .

valvomaton hiukkasluokitus suoritettiin satunnaiskylvöllä täydellisillä tiheyskartoilla ilman kohdennettua luokittelua SPIDER-ohjelmistopaketissa. Yritykset käyttää keskitettyä luokittelua johtivat voimakkaaseen harhaan ja melun ylittämiseen kiinnostavilla alueilla. Siksi emme käytä keskittynyt luokittelu vähentää harhaa. SPIDERILLÄ tehdyssä alustavassa luokittelussa luokat C0–C6 ja N0-N5 oli taustaprojekteoitu käyttäen kulmia C0-ja N0-kartoista, eikä näitä luokkia ollut täysin Tarkennettu. Tässä halusimme vain valita luokkia, joilla on lisätiheys sitoutuneena nukleosomiin. Partikkelit, jotka tuottivat karttoja eri chp1cd-tiheyksillä, erotettiin toisistaan ja luokiteltiin edelleen. Satunnaiskylvöluokituksia tehtiin noin 20 kierrosta, kunnes partikkelit on jaettu viiteen eri ryhmään (täydentävä Kuva S3). Luokat C11-C15 tarkennettiin RELION-ohjelmistopaketilla. CHP1CD-H3k9me3-Nukleosomikompleksien (C15-luokka) ja Nukleosomikontrollin lopulliset tarkennukset tehtiin RELION-ohjelmistopaketilla. Lopullista tarkennusta varten viite suodatettiin arvoon ~50 Å (RELION-suodatin). Käyttämässämme referenssissä ei ollut mitään hienostuneissa rekonstruktioissa havaittuja piirteitä (DNA: n kaksoiskierre ei ratkea, pääura ei näy, α-kierteet eivät ratkea). Tämä viittaa siihen, ettei rakenteemme ole vinoutunut. Nukleosomiohjauksen resoluutio saavutti 7,3 Å käyttäen automaattista tarkennusta RELION-ja C2-symmetriassa (FSC 0,143 cutoff kahdesta itsenäisesti tarkennetusta kartasta). Chp1CD-H3K9me3Nucleosome complex tarkennettiin 10 Å: ksi (FSC 0.143 cutoff kahdesta itsenäisesti tarkennetusta kartasta) ilman symmetriaa.

paikallinen resoluutio laskettiin ResMap-ohjelmiston avulla (lopullinen yksittäinen äänenvoimakkuus, minRes=7, maxRes=14, automask). Resmap-menetelmällä määritetty keskimääräinen resoluutio on 9,4 Å Chp1CD-H3k9me3nukleosomikompleksille, mikä vahvistaa itsenäisesti aiemmin määritetyn keskimääräisen resoluution 10 Å (FSC 0,143) (Kuva 1c). Chp1cd-H3k9me3nukleosomikompleksille paikallinen resoluutio nukleosomille on 9-10 Å ja ligandille ~10 Å (Kuva 2a). Euler-kulmajakauma lopullisessa rekonstruktiossa on esitetty sekä Nukleosomi – että Chp1CD-H3k9me3-Nukleosomikompleksille (täydentävä Kuva S9D). Kaikki suuntaukset ovat läsnä suosimalla ylä-ja sivunäkymiä.

Molekyylimallit rakennettiin käyttäen Chimera-ohjelmistopakettia, jossa käytettiin kiderakenteiden jäykkää runkoasennusta . Fit into density tehtiin Chimera vaihtoehtoja ”Fit in Map” ja ”Fit in Segments” vain pieniä manuaalisia muutoksia. Kaikkien Kryo-EM-karttojen segmentointi ja visualisointi tehtiin myös Chimera-ohjelmistolla .