tulokset
Gastrulaatiovirheet Chrd -/-hiirillä
Chrd: n erittämä BMP: tä sitova proteiini ilmaistaan hiiren solmussa ja sen johdannaisissa, notochordissa ja nielun endodermissä(Kuva. 1A-F). Chrd-proteesinsisältää neljä kysteiinirikasta(CR) verkkotunnusta, jotka kaikki pystyvät sitomaan Bmps: ää.CR1 ja CR3 osoittavat suurimman affiniteetin Bmp4: lle ja voivat antagonisoida BMP-signalsupon mRNA-injektion xenopusalkioihin (Larrain et al., 2000). Togenate null alleelin Chrd, olemme valmistelleet kohdistaminen konstruktwith käännös stop kodonit kolmessa mahdollisessa lukukehykset sisällä signal peptidi alueella. Pysäytyskodoneita seurasi kehyksensiirto ja CR1: n jälkeen IRES-lacZ-ja PGK-neo-kasettien kehitys, joka edelleen hajotti Chrd-geenin (Kuva.1G). Transkriptit tästä Chrdtm1DR-alleelista (jäljempänä Chrd -) olivat havaitsemattomia inchrd -/ – alkioita solmuvaiheessa(Kuva. 1J, nuolenkärki).
heterotsygoottiset Chrd-hiiret olivat elinkelpoisia ja lisääntymiskykyisiä, ja ne pariutuivat eri kehitysasteiden khrd-/- alkioihin stages.At päivä E8. 5, havaitsimme resorptiokyhmyjen esiintymisen raskaana olevien naisten kohdussa ja pienen vähenemisen odotetussa alkioiden määrässä (50 talteen, 57 odotettavissa). Neljän genotyypin homotsygoottiset mutanttialkiot osoittivat alkioalueen koon selvästi pienenevän, minkä lisäksi allantois laajeni suhteessa muuhun alkioon (Kuva.2 A, A’). Histologisissa jaksoissa huomattava hermolevyn hypoplasia (Kuva.2B, B’), somiittien ja notochordin puuttuminen(Kuva. 2C, C’), ja allantoisissa olevien mesodermaalisten solujen runsaus (Kuva. 2D, D’) huomioitiin. Muut mutantit (46) olivat morfologisesti erittämättömiä heterotsygoottisista ja villeistä poikuetovereistaan. Fourabnormaalisten mutanttien fenotyyppi oli samanlainen, mutta vähemmän voimakas kuin mesodermin ventralisaatio, joka havaittiin kaksoishomotsygooteilla Chrd:llä; Nogmutanteilla (Bachiller et al.,2000), jossa oli lisäksi neuraalilevyn anteriorisia katkelmia.
Chrd-/- alkioiden gastrulaatio-fenotyyppi. A) villityypin ja A’) mutanttien alkiot somiittivaiheessa. Mutanteilla keho pelkistyy ja allantois (al) suurenee suhteellisesti.(B-D’) Sektiot villityypin(B-D) ja mutanttialkioiden (B’-D’) kautta kohdissa a ja A ” ilmoitetuilla tasoilla. Huomaa mutantin (B’) huono erilaistunut hermolevy (np) ja sen trunk mesodermin (C’) puute. (D’) alkion ulkopuolisten mesodermaalisten solujen lisääntyminen mutantin allantoisissa. somiitti.
Seeprakalalla ja Xenopuksella KRD: n inaktivoituminen aiheuttaa ventraalisen mesodermin ekspansion ja dorsaalisen mesodermin ja neuraalilevyn pelkistymisen (Schulte-Merker ym.,1997). Nisäkkäillä Mesodermi muodostaa gastrulaation aikana epiblastisoluja primitiivisen juovan kautta. Alkukantaisen juovan takapäästä poistuvat solut siirtyvät alkion ulkopuoliselle alueelle, jossa ne synnyttävät mesodermaalisen sukulinjan (allantois, amnion ja ruskuaispussin verisolut), joka vastaa xenopuksen ventraalista mesodermiä. Sen sijaan, solut sijaitsevat enemmän anterior alueilla thestreak pysyvät sisällä alkion varsinainen ja tuottaa paraksiaalinen, Välituote ja lateral levy mesoderm tulevaisuuden runko. Chrd – / – mutanttien varhainen fenotyyppi, jossa allantois laajenee mesodermin alkionmenolla, on yhdenmukainen hiiren alkion varhaisen ventralisoitumisen kanssa. Tämän fenotyypin on johdettava siihen sairastuneiden eläinten kuolemaan, sillä yhtään homotsygoottista mutanttia, jolla oli poikkeava allantois, ei löydetty myöhemmissävaiheissa ilmenneistä häiriöistä. Tätä fenotyyppiä ei analysoitu molekyylimerkeillä, koska poikkeavia alkioita saatiin niin vähän.
Perinataalikuolleisuus
vain 49% (95/194) odotetuista Chrd- / – – eläimistä havaittiin syntymähetkellä, ja kaikilla eläimillä oli sama täysin penetrantyyppi. Näistä suurin osa syntyi kuolleena,mutta muutamat yrittivät tuloksetta saada keuhkonsa täyteen. Ulkoisesti homotsygoottiset mutanttineonat olivat hieman villityyppisiä pentuetovereitaan pienempiä ja niissä ilmeni syanoosia, mikrokefaliaa ja ulkokorvan supistumista, joka oli asetettu epänormaalin lähelle silmää(Kuva. 3 a’).Histologinen tutkimus (Kuva.3B ’-C’) paljasti kateenkorvan (t, johdos kolmannesta nielun pussista) ja toissijaisen kitalaen (p) puuttumisen sekä sisäkorvan hypoplasian (ts.) mutanteilla. Anteriorinen lohko ja pars intermedia of thepitutary rauhanen(pi), molemmat peräisin dorsal oral ectoderm välittömästi adjacented cephalic rajalla anterior endodermin, olivat normaaleja (Kuva. 3C, C’). Tämä määritteli suunielun fenotyypin rostraalirajan, ja muodonmuodot rajoittuivat Chrd-expressingendodermin johdannaisiin. Kilpirauhanen, joka muodostaa ventraalisen nielun endodermin foramen umpisuolessa, erottui, mutta oli hypoplastinen ja epäsäännöllisen muotoinen(th, kuva. 3C’). Lisäkilpirauhaset, nielun pussien 3 ja 4 johdannaiset, puuttuivat (tietoja ei näy), mikä vastaa vastasyntyneiden hypokalsemiaseosta Digeorgen oireyhtymää sairastavilla(DiGeorge, 1968). Päätämme, että Chrd-/- kuolleena syntyneiden hiirten fenotyyppi sisältää suurimman osan tällaisissa yksilöissä kuvatuista piirteistä.
Chrd- / – vastasyntyneiden hiirten morfologinen ja histologinen analyysi. (A, a’) villin tyypin (A) ja homotsygoottimutantin (a’) hiirten ulkoinen ulkonäkö. Mutantit näyttävät syanoottisilta; niiden ulkokorva on pienentynyt ja asettunut lähemmäksi silmää kuin villityypillä. (B,B’) villin tyypin (B) ja mutantin (B’) hiirten Sagittalsections. Mutanteilla toinen kitalaki (p) ja kateenkorva (t) puuttuvat ja kurkunpään rustot(l) ovat voimakkaasti pienentyneet. Tämä ei vaikuttanut keskushermoston morfologiaan eikä kokoon. (C, C’) C-tyypin ja C-tyypin hiirten Koronaaliset osat kaulan tasolla. Huomaa sisäkorvan (ie) ja ruokatorven (oe) puuttuminen sekä henkitorven (tr) ja kilpirauhasen (th) pieneneminen. pii, aivolisäke.
luuston viat
Chrd – / – vastasyntyneiden eläinten luustolääkkeissä appendicular-ja lannerangan luusto olivat normaalit, mutta kallonpohjassa ja anteriorisessa aksiaaliluussa oli useita vikoja. Luunmuutoksia olivat squama temporalis (st): n puuttuminen ja poskiluun kaaren lyhentyminen (Kuva.4 A, A’). Havaitsimme myös melkoisen hypoplasian kieliluussa ja kilpirauhasen ja krikoidisten kurkunpään rustoissa(Kuva. 4B’), ja anabnormaalisen pieni leuka (Kuva.4C’). Kallon tyvessä alisfenoidi (as)näytti normaalilta, mutta keskiviivalla basisfenoidi(bo) ja basisfenoidi (BS) luut olivat fuusioituneet, ja presfenoidi(ps) oli hypoplastinen (Fig. 4D, D’). Histologisista löydöksistä huolimatta palatiinihyllyt eivät ulottuneet mediaalisesti toissijaisen kitalaen muodostamiseksi. Korvassa tärykalvon rengas ja otic kapseliväheni ja epämuodostunut (Kuva.4D’). Luuston epämuodostumia havaittiin myös selkärangan kohdunkaulan ja rintakehän alueilla. Nikamat (VB) olivat pienimmät chrd-/- vastasyntyneillä(Kuva. 4E’), jolloin nikamien muut osat, kutenspiiniset prosessit, hermokaaret ja Atlaksen etukaari (Kuva. 4 E ’ andFig. 5 a’).
luonnontyyppisten ja mutanttinuorten Luurankovalmisteet. (A-E) villityypit. Mutanttipentuetovereita. Luu on värjätty alitsariininpunaiseksi ja rusto Alkian siniseksi. (A,a’) Theskullin lateraalinen näkymä, joka osoittaa mikrokefaliaa ja squama temporaliksen (st) puuttumista themutantissa (A’). (B,B’) henkitorven ja kurkunpään rustot villityypissä (B) ja mutantissa (B’); TH, kilpirauhanen; cr, kricoid rustot; hy, Hyoidbone. (C,C’) alaleukaluun sivusuunnassa; huomaa, että mutanttileuassa (C’) ei ole koronoidia (cor), kondylaaria(con) eikä kulmikasta (an) prosessia. (D,D’) Selkänäkymä kallon tyvestä. as, alisfenoidi; pl, palatiini; ps, presfenoidi; bs, basisfenoidi; bo,basioccipital; tr, tärykapseli; oc, otic-kapseli. (E, E’) kaulan selkärangan ventraalinen näkymä. Atlaksen etukaari (aaa) on mutantissa vinossa ja nikamien luutumiskeskukset(vb) supistuvat.
Chrd – / – alkioiden fenotyyppi kohdassa E14. 5. (A,A’)villityypin (A) ja (A’) mutanttipentuetovereiden Luurankovalmiste.Nuolenkärjet A’: ssa viittaavat alikehittyneisiin nikamahermokaariin.B, B’) Selkänäkymä kallon tyvestä. B-kirjaimen nuolet osoittavat etummaisen notokortin näkyvyyden. Nuolenkärjet kohdassa B ’ osoittavat kantavan sillan, joka yhdistää basisfenoidin (bs) ja basioccipitaluun (bo) primordian. oc, otic-kapseli; LC, kurkunpään rustot.(C,C’) ulkoinen näkymä villityypin (C) ja mutantin (C’) eläimistä.Huomaa vakava turvotus (nuolenkärjet) ja verenvuoto KRD-/- alkiossa. (D,D’) Wild-type (d) andChrd -/ – (D’) mutant hearts. ao, aortta; pt, pulmonarytrunk; ta, truncus arteriosus. (E-F’) villin tyypin (E,F) ja mutantin (E’,F’) alkioiden Koronaaliset osat. Mutantin(E’) rintakehässä jakamaton truncus arteriosus on selvästi näkyvissä. Mutantissa näkyy notochordin (no) sijasta suurentunut selkäydinvaltimon anteriorinen Valtimo (asa, syvennys F’). Huomaa, että nielu (ph) on pienentynyt huomattavasti ja Korvatorvi (eu) on hävinnyt mutanteilla. aortta laskeutuu.
Chrd-mutanttien luustovirheet olivat jo havaittavissa inkartilage-kondensaatioissa E14.5 (Kuva.5 A, A’). Basiocipital ja basisfenoidirustot fuusioituivat, ja basiocipital luutumiskeskus oli kapeampi ja ulottui basisfenoidiin (Kuva.5B, B’). Anteriorinen notokordi, joka oli villin tyypin basioccipital-suvussa, puuttui Chrd-mutanteilta(Kuva. 5B, B’). Anteriorisen notochordin poissaolo vahvistettiin servisen alueen histologisella tutkimuksella kohdassa E14. 5 (Kuva.5F’).
Chrd-mutaation vaikutuspiirissä olevien luiden alkuperä on hyvin erilainen. Basioccipital on puhtaasti somiittista alkuperää; osa basisfenoidista syntyy kefalisen mesenkymen endokondriaalisesta luutumisesta; thepalatine on peräisin neuraalisen crest-derivoidun mesenkymen intramembranoottisesta luutumisesta; otic-kapselit eroavat paraksiaalisista mesodermand neural crest-soluista, ja kieliluu on puhtaasti neural crest-johdettu (Le Douarin and Kalcheim, 1999). Keskellä tällaista monimuotoisuutta lineages, yhdistävä periaate fenotyyppi näyttää olevan sijainti epämuodostunut rakenteita theproximity Chrd-ilmentävän aksiaalisen mesendodermin (Fig. 1 E). Tämä tulkinta on yhdenmukainen Chrd-/- eläimillä havaitun anteriornotochordin ennenaikaisen rappeutumisen kanssa sekä prechordal plate-ja mesendodermin johdettujen signaalien vaatimuksen kanssa pään theskeleton kehittämiseksi (Belo et al.,1998; Couly et al., 2002; David et al.,2002).
Digeorgen kaltaiset sydänviat
syntymähetkellä havaittu syanoosi voi olla merkki sydämen toimintahäiriöstä. Lisätutkimuksentoteutettiinalkionkehityksen eri vaiheissa tehtyjä dissektioita. E14: Ssä.5, sydämet ofChrd – / – eläinten osoitti yhden aluksen, sijasta thenormal kaksi, sydämen ulosvirtaus kanava(Kuva. 5D, D’, E, E’).Tämä tila tunnetaan ihmisillä nimellä persistent truncus arteriosus, ja se on merkittävä epämuodostuma digeorgen oireyhtymää sairastavilla henkilöillä. Nousevan aortan ja keuhkorungon välisen erotuksen puuttuminen voi lisätä oikean kammion työkuormaa aiheuttaen sen hypertrofian sekä vasodilataation, turvotuksen ja verenvuodon E14. 5-alkioissa(Kuva. 5C’). Kuten indigeorgen syndrooma, sydän-ja verisuonijärjestelmän viat ulottuivat ulosvirtauskanavan ulkopuolelle ja sisälsivät suuret alukset, jotka olivat peräisin nielun arkkipartioista (Kuva. 6). Vastasyntyneillä mutanteilla yhteiset kaulavaltimot liittyivät suoraan tynkäarteriosukseen, minkä seurauksena brakiokefalinen valtimo ja osa aortan kaaresta puuttui (Kuva. 6A-C).Keuhkovaltimot saivat alkunsa suoraan proksimaalisesta tynkäarteriosuksesta, jolloin yhteinen keuhkorunko puuttui(Kuva. 6A-C). Lisäksi havaittiin lateraalisuuden vikoja, joiden aortainin poikkeava oikeanpuoleinen kääntyminen 40% mutanteista (Kuva. 6, vertaa 66F). Kun dissections suoritettiin posterior, sevoitaisiin nähdä, että riippuen lateraalisuus laskevan aortan, theright tai vasen subclavian valtimoiden hyväksyi epänormaali retroeesofagealposition (Kuva. 6D-F). Samanlaisia piirteitä on kuvattu poikasten alkioissa, joissa on hermoharjusolujen ablaatioita (Kirby et al., 1983), ja inmice kuljettaa poistoja DiGeorge congenic alueella(Lindsay et al., 1999; Merscher ym., 2001) taimutaatiot tbx1: ssä ja Fgf8: ssa(Abu-Issa et al., 2002; Frank et al., 2002; Jerome and Papaioannou, 2001; Lindsay et al., 2001; Vitelli et al., 2002b).
Valtimoviat Chrd – / – vastasyntyneillä. Frontal (A-C) andposterior(D-F) näkymät ulosvirtauskanavasta ja suurista astioista villin tyypin (A,D) ja kahden Chrd-/ – (B,C,E,F) vastasyntyneen kanssa. Auriclesit on poistettu havainnoinnin helpottamiseksi. Villityypissä(A,D) aortta (Ao) ja keuhkorunko (Pt) ovat erilliset. Aortta alkaa vasemmalta vuontricle ja kääntyy vasemmalle. Laskeva aortta (dAo) sijaitsee ruokatorven (oe) vasemmalla puolella. Brachiocephalic Valtimo (bc) haarautuu oikealta puolelta aortan kaari aiheuttaa oikean yhteisen kaulavaltimon(rcc) ja oikean solisvaltimoiden (RS). Vasen yhteinen kaulavaltimo (LCC)ja vasen solisluu (ls) ulos suoraan aortan kaari. (B, E) mutanttieläin, jolla on vasemmalle kääntyvä aortan kaari. Vasen ja oikea yhteenkarotidit ovat peräisin truncus arteriosus (Ta). Brachiocephalic arteryis puuttuu ja oikea solisluu on epänormaalisti sijaitsee posterior theoesophagus. Vasen (lpa) ja oikea (RPA) keuhkovaltimot syntyvät themost proksimaalinen osa tynkä. (C,F) mutanttieläin, jossa oikealle kääntyvä kaari. 40 prosentilla mutanteista on epänormaali aortan kääntyminen oikealle. Laskeva aortta on sijoitettu ruokatorven oikealle puolelle ja vasen solisluu kulkee sen takana. Useita aluksia on pysäytetty tarkkailun helpottamiseksi. rl, oikea keuhko, ll, vasen keuhko, lpv, vasen keuhkolaskimo, rpv, oikea keuhkolaskimo.
syntyessään vain 49% odotetuista Chrd-homotsygooteista mutanteista löydettiin. Odotetuista 56: sta (86%) Chrd-/-alkiosta 48 oli kuitenkin vielä elossa pentueissa, jotka leikeltiin kohdassa E14.5.esiintymistiheys ei poikkea merkittävästi kohdassa E8.5 havaitusta (88%). Voimakas kasvu kuolleisuudessa E14.5: n jälkeen on sama kuin kardiovaskulaarisen fenotyypin täydellinen ilmentyminen, ja se viittaa siihen, että verenkiertohäiriö on tärkeä syy Chrd-/- alkioiden kuolleisuuteen myöhäisen raskauden aikana.
nielun poikkeavuudet
selvittääksemme nielun fenotyypin puhkeamista leikkasimme raskausfemalesin heterotsygoottisista pariutumisista eri aikoina coitumin jälkeen. E9: Ssä.0, astage, jossa Chrd ilmaistaan nielun endodermin, Chrd – / – alkiot voidaan tunnistaa sisennys kaulan alueella (Kuva.7A”, nuoli). Mutanttien otic-vesikkelit pienenivät puoleen normaalista läpimitastaan (Kuva.7A’, nuolenkärjet) ja toinen (kieliluu) nielun kaari oli vinossa. Nielun kaaria kolmesta kuuteen ei koskaan muodostunut mutanttialkioissa(Kuva. 7B ’ ja tietojen ilmoittamatta jättäminen). Puuttuvat tai epämuodostuneet rakenteet ovat joko suoria esiasteita tai niillä on induktiivinen rooli monien syntymähetkellä vaikuttavien elinten kehityksessä Chrd – / – hiirillä. Koska suurin osa vastasyntyneillä mutanteilla havaituista fenotyyppisistä poikkeavuuksista on alkioalkuperää nielun endodermissa ja nielun reuna-alueella, analysoimme useiden geenien ilmentymistä, joilla tiedetään olevan tärkeä kehitysrooli ihmisen perinnöllisessä sairaudessa.
nielun häiriöt Chrd – / – alkioissa raskauden puolivälissä.(A,a’) wild-tyypin (A) ja mutantin (a’) ulkoinen näkymä E9. 0embryos; mutanteilla on täysin Läpitunkeva fenotyyppi, joka koostuu otic-rakkulan reduktiosta (nuolenkärjet), toisen (kieliluun) nielun kaaren puuttumisesta ja kaulassa näkyvästä painaumasta (nuoli). (B, B’) E9.5-alkioiden Kokovuoren insitu-hybridisaatio sox10-koettimella, joka labelsgliaalisia soluja. Kolmois – (tr) ja vestibulocochlear (VC) – gangliot muodostuvat ja siirtyvät mutanttiin (B’). (C, C’) pax3whole-mount in situ hybridisaatio E10.5 alkioita. Mutanttialkiossa(C’) ei ole neuraaliharjasoluja (nuolenkärkiä), jotka vaeltavat nielun reuna-alueen läpi sydämen läheisyyteen (h). md, mandibularcomponent of the first nigeal arch; hy, kieliluu tai second nigeal arch; dm, dermomyotomes; fl, forelimb. Epänormaalit aksonaaliset ulokkeet vestibulo-sisäkorvaan ovat indisoituja (nuolenkärki). Mutanteilla ei esiinny plasodijohdannaisia geniculate (g), petrosaali (p) ja nodoosi (n)-ganglioita. ov, otic rakkula; drg, selkäjuuren ganglia.(D-F’) Whole-mount in situ-hybridisaatio pax9-luotaimen kanssa.(D,D’) sivusuunnassa näkymä kohtaan E9.5 villityypin (D) ja mutantin (d’) embryos transparent with benzyl benzoate. Pax9 nielun ilmaisu vähenee mutantissa. pe, nielun endodermi; pg, suolisto. E, E’) samojen alkioiden Selkänäkymä; mutantissa nielu on pienentynyt ja nielupussit II, III ja IV puuttuvat. (F,F’) E10.5-tyypin luonnonvaraisten ja mutanttien alkioiden sivusuuntainen näkymä. Huomaa pax9-ekspression puute erityisesti mutantin nielun endodermissa (pe). fm, kasvojen mesenchyme;sc, sclerotome.
tutkimme ensin pax3: n ilmentymistä, transkriptiofaktorexpressed in neural crest, dorsal neural tube and somites(Goulding et al., 1991). Inhumans, PAX3 on mutatoitunut hermoharjutaudeissa, joita kutsutaan Waardenburgin syndroomatyypeiksi 1 ja 3 (Strachan and Read, 1994), ja se on yhdessä sox10: n kanssa mikroftalmian orMITF-geenin (Bondurand et al., 2000), transkriptiotekijä mutatoitui Waardenburgin oireyhtymätyypissä 2a ihmisillä (Tassabehji et al.,1994). Pax3: n mutaatio splotch-hiiressä(Sp2H) aiheuttaa sydänvikoja, mukaan lukien pysyvä tynkä arteriosus, sekä kateenkorvan, kilpirauhasen ja lisäkilpirauhasten epämuodostumia (Conway et al.,1997). Havaitsimme, että pax3: n ilmentymä oli erotettavissa mutanttien ja villin tyypin alkioiden välillä kohdassa E7.5 (ei esitetty),mutta kohdassa E10.5 havaittiin merkittäviä eroja. Pax3-positiveneuraalinen harjusolut, jotka vaeltavat nielun kaarien 3, 4 ja 6 kautta(kuva. 7C, nuolenkärjet) olivat hyvin havaittavissa Chrd – / – eläimillä(Kuva. 7 C’). Nämä neuralcrest solut kansoittavat septum erottaa aortan keuhkojen arteryn ulosvirtauskanavan, tai conotruncal alue, sydämen (Li et al., 2000). Se, että sydämen hermoharju ei pääse sydämeen, selittää ulosvirtauksen puutteen ja myöhemmän kardiovaskulaarisen fenotyypin, joka on havaittu chrd-mutanteissa. Mielenkiintoista on, että pax3: n ilmentyminen muissa kudoksissa, kuten nielun ensimmäisen kaaren alaleuassa (MD), dermomyotomeissa(dm) ja myoblastin esiasteissa eturaajoissa (fl), ei vaikuttanut(Kuva. 7 C’).
seuraavaksi teimme in situ-hybridisaation Sox10: n kanssa, joka on genemutoitu Waardenburgin syndroomaa sairastavilla henkilöillä tyyppi 4(Pingault et al., 1998) tämä ilmaistaan neural Crestin ja Schwannin soluissa. Kohdassa E7.5 sox10: n lauseke oli sama Chrd-/- alkioilla ja niiden villityyppisillä pentuetovereilla (tietoja ei näy). E9. 5: ssä sox10-ilmentymä takaruumiin selkäjuuren hermosolmussa (drg) oli normaali(kuva. 7B, B’), mutta Sox10: tä ilmentävien gliasolujen jakautuminen paljasti erityisiä vaikutuksia ääreishermoston organisaatiossa mutanttien kaulan ja pään alueella (Kuva.7B’). Erityisesti kallon sensorinen ganglia osoitti merkittynormaalisuus. Aivohermoja V ja vestibulo-sisäkorvan hermosolmu (VC) sijaitsivat chrd -/- – alkioissa enemmän yhdessä kuin villeissä tyypinliittäjätovereissa. Lisäksi näitä kahta yhdistäviä epänormaaleja hermoprojektioita nähtiin (Kuva. 7B”, nuolenkärki). Geniculate (g), petrosal (p) ja nodose (n) ganglia,jotka vastaavat kallon hermoja VII, IX ja X, olivat eniten kärsineet, osoittaen joko äärimmäistä koon pienenemistä tai täydellistä puuttumista. Nämä kolme gangliaoriginate alkaen epibranchial placodes, ja tiedetään vaativan induktiivisignals anterior endoderm niiden asianmukaisen kehityksen(Begbie et al., 1999). Epibranchial placode-derivoidun ganglian puuttuminen osoittaa, että erittämää proteinkrd: tä tarvitaan nielun endodermin vapauttaman induktiivisen signaalin aktiivisuuteen.
Pax9 on transkriptiotekijä, jota tarvitaan nielun endodermin ja sen johdannaisten kehittymiseen hiiressä(Peters and Balling, 1999;Peters et al., 1998). E9: Ssä.5, pax9: n ilmentyminen nielun endodermin ofChrd-/- alkioissa oli heikompaa kuin niiden luonnonvaraisissa tyypinliittäjätovereissa (pe, Kuva.7D, D’). Pax9-lauseke paljasti, että nielun koko ja muoto muuttui Chrd-mutanteissa, ja faryngealpouches vähennettiin yhteen turvotukseen anterior-useimmilla alueilla (Kuva. 7 E, E’). Nielun hyperplasia vahvistettiin E14.5embryosin histologisilla osioilla, joissa anteriorinen endodermi ilmestyi ohuena putkena, joka hahmotteli huomattavasti pienentynyttä lumenia (ph, Kuva.5F, F’). Nielun endodermin vähenemistä on havaittu myös Xenopus Chrd knockdowneissa (Oelgeschläger et al.,2003). Nielun ulkopuolisilla alueilla, joilla pax9 mRNA ilmaistaan normaalisti, kuten somiittisissa sklerotomeissa(sc) ja kasvojen mesenchymessä (fm), ei ilmennyt eroja transcriptien jakautumisessa tai runsaudessa (Fig.7F, F’).
näiden tutkimusten perusteella päätellään, että pax3: n, Sox10: n ja pax9: n ilmentymisen muutokset rajoittuvat hyvin rajalliseen alueeseen widerexpression alueilla, mikä viittaa siihen, että eritetyn proteiinin Chrd: n puute häiritsee erityisesti paikallisia säätelyreittejä, jotka vaikuttavat Chrd: tä ilmentävää endodermia ympäröivällä reuna-alueella.
Tbx1 ja Fgf8 ekspressio vaatii kordin
tutkiaksemme Chrd: n interaktiota geenien kanssa, joiden tiedetään aiheuttavan hiirillä digeorgen tai Digeorgen kaltaisia fenotyyppejä, analysoimme oftbx1: n ja Fgf8: n ilmentymistä Chrd-mutanttien alkioissa. Tbx1 kuuluu transkriptiotekijöiden T-box-perheeseen (Papaioannou and Silver, 1998). Se kartoittaa sisällä DGS/VCFS 22q11 microdeletion in humansand on äskettäin osoitettu aiheuttavan DiGeorge kaltainen fenotyyppi kun inaktivointi hiirillä (Jerome and Papaioannou, 2001; Lindsay et al., 2001; Merscher ym.,2001; Vitelli et al., 2002a). Tbx1: n ilmentymistä muutettiin inChrd-/- alkioilla. Luonnonvaraisissa E7. 5-tyypin eläimissä Tbx1 ilmaistaan etuselässä (tuleva nielun endodermi)ja pään Mesodermi (Kuva. 8 A). Tässä vaiheessa mutanttipentueet osoittivat tbx1-Ekspressiotasojen vähentyneen selvästi samoilla alueilla (Kuva.8 a’). Tbx1 mRNA: n väheneminen oli yhtä selvää Chrd: n homotsygoottisten alkioiden nielun alueella E8.0, E8.5 jae9.0 (Kuva.8B”, C”, D”). Poikittaiset histologiset osiot osoittivat, että solutasolla tbx1-transkriptioiden runsaus väheni rajusti endodermissa sekä nielussa että keulassa maksan divertikkelin tasoon asti (Kuva.8F-H’) tbx1-MRN-pitoisuuden pieneneminen näkyi myös mesodermissä, mukaan lukien pää, splanchnic (nuolenkärjet) ja automatic mesoderm (nuolet) nielun reuna-alueella(Kuva.8F”, G”, H”). Lisäksi Tbx1-ekspressio E9: ssä ensimmäisen nielukaaren mesodermaaliytimessä oli vaikeakulkuinen, ulottuen useimpiin kaariin, ja tbx1-transkriptiot olivat peräisin otic-rakkulasta (Kuva.8D-D’).
Fgf8 on erittyvä kasvutekijä, joka on ilmaistu useissa eri muodoissa, mukaan lukien nielun endodermi ja sen naapurissa oleva Mesodermi(Crossley and Martin, 1995;MacArthur et al., 1995).Varhaisessa kehityksessä tarvitaan fgf8 gastrulaatioon (Sun et al., 1999) ja The establishment of the left/right axis of symmetry(Meyers and Martin, 1999). Atlater vaiheissa Fgf8 vaaditaan raajan (Lewandoski et al., 2000; Moon and Capecchi, 2000) andcraniofacial (Trumpp et al., 1999) kehitys. Viimeaikaiset kokeet ovat osoittaneet, että hiirillä, joilla onvähentynyt fgf8-aktiivisuus, on kirjo sydän-ja kurkunpään vikoja, jotka muistuttavat läheisesti Digeorgen oireyhtymää (Abu-Issa et al., 2002; Frank et al., 2002). Lisäksi Fgf8-ekspressio poistuu nielun endodermin ofTbx1 – / – mutanteissa ja molemmat geenit vuorovaikuttavat geneettisesti nielun kaaren valtimoiden erilaistumisen aikana(Vitelli et al., 2002b). Ate9, Fgf8 expression Chrd mutants on normaali themid-takaraivo kannas, frontonasal näkyvyys ja häntä. Pharyngealendodermissa fgf8-transkriptiotasot kuitenkin vähenevät rajusti(Kuva. 8 e”). Tbx1: n ja Fgf8: n ekspression reduktio Chrd-/-alkioissa esitti, että molemmat geenit toimivat chrd: n alajuoksulla sameerigulatorisessa reitissä. Näissä kokeissa ei määritellä, tarvitaanko Chrdis: ää nielun ja läheisten kudosten tbx1: n ja fgf8: n ylläpitoon tai induktioon.
testataksemme, voiko Chrd indusoida Tbx1: tä ja Fgf8: aa,ruiskutimme Chrd mRNA: ta (50 pg) Xenopus-alkioiden ventraalialueelle nelisoluisessa vaiheessa. Ventraalinen marginaalivyöhyke (VMZ) – räjähteet leikeltiin varhaisessa gastrula-vaiheessa, viljeltiin, kunnes sisarukset saavuttivat varhaisen neurula-vaiheen ja analysoitiin RTPCR: llä. Tbx1 ja fgf8 mRNAs-arvot ilmaistiin tässä vaiheessa suurina pitoisuuksina kokonaisalkioissa ja dorsalmarginaalivyöhykkeellä (DMZ) ja pieninä pitoisuuksina VMZ: ssä(kuva. 8 I, kaistat 1-3). Uponmikroinjektio, Chrd mRNA lisäsi tbx1: n ja fgf8: n tasoja VMZ:ssä (kuva. 8 I,kaista 4). In situ hybridisaatio mikroinjektioiduista Xenopus-alkioista vahvisti, että Chrd mrnawin indusoimat tbx1-transkriptit sijaitsivat nielun endodermissä (tietoja ei näy). Voimme päätellä, että chrd, Bmp-antagonisti, voi indusoida Tbx1-ja Fgf8-ekspressiota Ksenopuksen alkioissa, ja sitä tarvitaan näiden geenien täydelliseen ilmentymiseen hiiren alkion nielun alueella.