1.4.1 Homogenization medium
Cell disruption is usually performed in either an lievästi hypo-osmoottinen or an iso-osmoottinen medium preserve morfological integrity. Sakkaroosia käytetään yleisesti osmoottina estämään subsellulaaristen organellien tai rakkuloiden haitallista turvotusta tai kutistumista. Mannitolia ja sorbitolia on käytetty myös silloin, kun sakkaroosin on havaittu häiritsevän solukomponentin biokemiallista analyysiä. Sakkaroosia suositaan suolaliuoksissa, koska jälkimmäiset pyrkivät kasaamaan solunsisäisiä organelleja. Hypo-osmoottisia väliaineita käytetään usein plasmakalvon fraktioiden eristämiseen, koska näissä olosuhteissa häiriintyneet solut tuottavat plasmakalvoja suurten haamujen tai levyjen muodossa. Tämä vähentää merkittävästi näiden fragmenttien koon suurta vaihtelua ennen sentrifugointia. Vaikka homogenisointiväliaine on yleensä luonteeltaan vesipitoinen, ei-vesipitoisia väliaineita, kuten eetteriä/kloroformia, on käytetty eristämään subsellulaarisia organelleja. Muut kuin vesipitoiset väliaineet voivat kuitenkin inaktivoida joitakin entsyymejä ja heikentää joidenkin kudosten morfologista eheyttä.
Homogenointiväliaineeseen voidaan lisätä Kelaatinmuodostajia (EDTA tai EGTA) kahdenarvoisten kationien, kuten MG2+ tai Ca2+, poistamiseksi, joita kalvoproteaasit vaativat. On tärkeää huomata, että proteaasi-inhibiittoreita tulisi silti lisätä väliaineeseen, koska EDTA-ja tiolireagenssit saattavat aktivoida joitakin proteolyyttisiä entsyymejä. Monet membraanimarkkerientsyymit vaativat kuitenkin näitä kationeja aktiivisuuteen ja saattavat estyä kationien poistuttua uutteesta. Mg2+: n tai Ca2+: n lisääminen homogenointivälineeseen ylläpitää ydinkestävyyttä. Nämä ionit voivat kuitenkin aiheuttaa kalvon aggregaatiota ja heikentää mitokondrioiden hengityskontrollia.
kasvikudoksen soluhäiriöt vapauttavat usein fenoleja, joilla voi olla useita haitallisia vaikutuksia kasvien entsyymeihin. Kasvien fenoliyhdisteet koostuvat pääasiassa kahdesta ryhmästä: fenyylipropanoidiyhdisteistä (esim.hydrolysoituvat tanniinit) ja flavonoideista (esim. tiivistyneet tanniinit). Fenoliyhdisteet voivat vetysidostua proteiinien peptidisidosten kanssa tai käydä hapettumassa fenolioksidaasin avulla kinoneiksi. Kinonit ovat voimakkaita hapettavia aineita, joilla on myös taipumus polymeroitua ja tiivistyä reaktiivisten proteiiniryhmien kanssa muodostaen tummaa pigmenttiä nimeltä melaniini, joka muodostaa kasvikudoksen ruskistumisen perustan. Melaniinin kiinnittyminen proteiineihin voi inaktivoida monia entsyymejä. Fenolihydroksyyliryhmät voivat muodostaa ionisia vuorovaikutuksia proteiinien emäksisten aminohappojen kanssa tai vuorovaikuttaa hydrofobisesti proteiinien hydrofobisten alueiden kanssa. Siksi on tärkeää poistaa fenoliyhdisteet mahdollisimman nopeasti ja tämä saavutetaan parhaiten käyttämällä adsorbentteja, jotka sitoutuvat fenoleihin tai kinoneihin, tai käyttämällä suojaavia aineita, kuten boraattia, germanaattia, sulfiitteja ja merkaptobentsotiatsolia, jotka estävät fenolioksidaasin toimintaa. Eristysaineeseen voidaan lisätä fenoli-adsorbentti, polyvinyylipyrrolidoni joko vesiliukoisessa muodossa tai erittäin ristisidoksisena liukenemattomana tuotteena ”Polyklear”. Polyvinyylipyrrolidoni sitoo niitä fenoliyhdisteitä, jotka muodostavat vahvoja vetysidoksia proteiinien kanssa. Naudan seerumin albumiinin on myös raportoitu reagoivan kasvien fenolien kanssa ja se on myös tehokas kinonin raadonsyöjä.
solujen tai kudosten fraktiointi suoritetaan poikkeuksetta +4°C: n lämpötilassa kalvoproteaasien aktiivisuuden vähentämiseksi. Proteaasit voidaan jakaa endopeptidaaseihin ja eksopeptidaaseihin. Endopeptidaaseja, jotka ovat sisäisiä peptidisidoksia pilkkovia entsyymejä, ovat muun muassa happoproteaasit, joiden pH-optima on pH 2,5-3,8 ja joita siirtymätilan inhibiittori pepstatiini voi inhiboida; seriiniproteaasit, joita di-isopropyylifluorifosfaatti ja fenyylimetyylisulfonyylifluoridi voivat inhiboida, ja sulfhydryyliproteaasit, joita inhiboi N-etyylimaleimidi tai E-64 (l-Trans-epoksisukkinyylileusyyliamidi–butaani). Esimerkkejä eksopeptidaaseista ovat useimmissa kasvikudoksissa esiintyvät karboksipeptidaasit, jotka hydrolysoivat helposti useimmat C-terminaaliset aminohapot. Di-isopropyylifluorifosfaatti inhiboi kaikkia tähän mennessä tutkittuja kasvikarboksipeptidaaseja. Kasveissa on havaittu myös aminopeptidaaseja, dipeptidaaseja ja tripeptidaaseja. Muita homogenisoinnissa käytettyjä yhdisteitä ovat disulfidia pelkistävät aineet kuten 2-merkaptoetanoli, ditiotreitoli, ditioerytritoli, pelkistetty glutationi tai kysteiini. Tämä johtuu siitä, että monet entsyymit sisältävät tärkeän aktiivisen kohdan sulfhydryyliryhmän, jonka on pysyttävä pienenä entsyymiaktiivisuuden ylläpitämiseksi. Monet organellen eristämisen ongelmista liittyvät hauraiden kalvojen, esimerkiksi vakuolia ympäröivän tonoplastin, repeämiseen. Näiden kalvojen fyysisen tuhoutumisen lisäksi kasvikudokset sisältävät aktiivisia lipolyyttisiä entsyymejä, jotka voivat hyökätä suoraan kalvojen lipidikomponentteihin ja häiritä organelleja. Asyylihydrolaasien hydrolyyttisen vaikutuksen vapauttamat vapaat rasvahapot voivat estää mitokondrioiden, kloroplastien ja plasmakalvon Atpaasiaktiivisuutta. Myös muut rasvahappojen haitalliset vaikutukset ovat hyvin selvillä. On olemassa tiettyjä ehtoja, jotka voivat vähentää lipidien hajoamista lipaasien ja lipolyyttisten asyylihydrolaasien kasveissa. Näitä ovat esimerkiksi (1) eristysaine, jonka pH on 7.5-8, joissa useimmilla lipolyyttisillä entsyymeillä ja LiPo-oksigenaasilla on vain vähän aktiivisuutta, (2) kelatoivat aineet, kuten EDTA, koska monet fosfolipaasit ovat Ca2+-riippuvaisia; monet lipolyyttiset entsyymit eivät kuitenkaan vaikuta kelatoiviin aineisiin ja (3) muut lisäaineet, kuten antioksidantit, jotka estävät rasvahappojen hydroperoksidien hapettavan hajoamisen, disulfidia pelkistävät aineet, spesifiset entsyymin estäjät ja vapaita rasvahappoja sitovan naudan rasvahapposeerumialbumiinin käytön. Jokainen yksittäinen homogenointiväliaine on erilainen ja voi sisältää spesifisiä inhibiittoreita entsyymeille, kuten fosfolipaaseille tai fosfataaseille. Eristysaineeseen lisätään usein esimerkiksi glyserolia fosfatidihappofosfataasin inhiboimiseksi. Etanoliamiinia ja koliinikloridia käytetään yleisesti fosfolipaasi D: n estämiseen.
kasvisolujen fraktioinnissa käytettävän homogenisointivälineen puskurointikapasiteetin on oltava suuri, jotta häiriintynyt vakuoli, joka muodostaa huomattavan määrän solua, voi vapauttaa orgaanisia happoja. Homogenisointiväli voidaan muotoilla joko empiirisen arvioinnin tai rationaalianalyysin avulla. Esimerkiksi sen varmistamiseksi, että kyseinen puhdistettu proteiini pysyy koskemattomana, kaikki tärkeimmät proteaasien inhibiittorit voidaan lisätä homogenointivälineeseen tai vaihtoehtoisesti fysiologiset liuokset voidaan kopioida. Koska kasvisolun sytoplasmainen pH on noin 7,5-8,0, homogenisointiväliaineen tulee heijastaa solun fysiologista tilaa ja on siksi heikosti puskuroitu sytoplasmaiseen pH: han.