La Ley de Alimentos, Medicamentos y Cosméticos de Estados Unidos de 1938 requería que los fabricantes y las compañías farmacéuticas fueran responsables de la seguridad de los aditivos / excipientes de medicamentos en sus productos en respuesta a una tragedia en la que 100 niños murieron por la presencia de dietilenglicol en un producto antibacteriano. Para ayudar a aclarar lo que se necesita para establecer un nuevo excipiente, la FDA publicó un documento de orientación en 2005 titulado «Estudios no clínicos para la Evaluación de la Seguridad de excipientes Farmacéuticos», que describe los estudios de seguridad necesarios para tener un excipiente aprobado1, 2. Artículos recientes han llamado a la necesidad de más excipientes alternativos para su uso en formulaciones1,3,4. Por lo general, los formuladores prefieren excipientes con antecedentes debido a su perfil de seguridad bien establecido, así como a los riesgos y costos asociados con la aprobación de un nuevo excipiento3. Al calificar a un nuevo excipiente, es necesario realizar estudios de seguridad y, en el caso de un acontecimiento adverso, existen dudas sobre si el acontecimiento adverso se debió al excipiente o al producto. Cuando se utiliza un excipiente, si bien la experiencia previa con cualquier vía de administración inyectable es valiosa para justificar su uso, vale la pena señalar que,según la normativa vigente, cambiar la vía de administración o aumentar la concentración más allá de su dosis máxima actual puede requerir datos de seguridad adicionales1, 2. La necesidad de nuevos excipientes es bien reconocida, pero ampliar nuestro conocimiento en el uso de excipientes menos utilizados es igual de importante, al tiempo que ofrece un camino regulatorio más fácil.
Determinar el pH correcto y el sistema tampón es posiblemente el paso más crítico en la formulación de una proteína para garantizar su solubilidad y estabilidad (química y física)3,5-7. El artículo se centrará en la estabilización de los bioterapéuticos. Los tampones que se encuentran tanto en moléculas pequeñas como en formulaciones parenterales de proteínas aprobadas por la FDA se referirán como justificación para explorar los efectos estabilizadores de estos tampones en las proteínas. La Tabla 1 enumera el número de formulaciones únicas encontradas en las etiquetas de los productos aprobados por la FDA. Se excluyeron formulaciones idénticas derivadas de la formulación de productos genéricos o dosis diferentes. Siempre que se alude a la forma salina del tampón, se supone que el tampón se titula con hidróxido de sodio o ácido clorhídrico, ya que estos son los dosificadores más comunes.
Los tampones más comunes utilizados en formulaciones parenterales han sido el citrato, el fosfato y el acetato. Se destacarán algunos de los puntos fuertes y débiles asociados con estos excipientes. El objetivo de este documento es llamar la atención sobre otros agentes tampón aprobados, pero de uso menos común, que requieren un uso más extenso para ser generalmente aceptados. Si bien este artículo se centrará exclusivamente en los tampones, el mismo argumento se extiende a otros tipos de excipientes. A medida que la biotecnología evolucione como industria y se desarrollen más estructuras proteicas únicas, será cada vez más importante encontrar nuevas formas de estabilizar estas proteínas. A veces, los excipientes más comunes no serán suficientes para proporcionar una estabilidad adecuada o permitir las tecnologías de administración de medicamentos.
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Tampones comúnmente utilizados
Fosfato sódico
El fosfato sódico (pKa 2.1, 7.2 y 12.3) es el tampón más utilizado que se encuentra en las formulaciones parenterales (Tabla 1). La limitación más notable en el uso de fosfato como tampón es el efecto de la congelación sobre los cambios en el pH. El cambio en el pH durante la congelación se ha estudiado ampliamente. El desplazamiento del pH se atribuye a la cristalización selectiva de la sal dibásica. La cristalización puede verse afectada por la velocidad de congelación, el pH inicial y la presencia de otros cosolutos. Un cambio en el pH de aproximadamente dos unidades es bastante típico durante la congelación, pero se han reportado cambios en el pH de hasta 3,6 unidades8-10. El entorno de pH cambiante tiene el potencial de desestabilizar las proteínas durante el procesamiento de la sustancia farmacológica a granel o la liofilización de las soluciones de los medicamentos11-17. Esto es especialmente preocupante en condiciones en las que se utilizan altas concentraciones de fosfato u otros excipientes cristalizantes están presentes, ya que estas condiciones ayudan a inducir la cristalización de fosfato. Las soluciones que contienen altas concentraciones de proteínas o solutos no cristalizables (por ejemplo, sacarosa) inhibirán la cristalización de fosfato y minimizarán los cambios de pH.
Ácido cítrico
El ácido cítrico es uno de los tampones más utilizados (Tabla 1). Es un tampón trivalente que contiene tres ácidos carboxílicos con pKa de 3.1, 4.8 y 6.4 (Tabla 2) que ofrece un amplio rango de tampón5. De acuerdo con la Base de Datos de Ingredientes Inactivos de la FDA, el citrato se encuentra en más de 100 productos inyectables aprobados, lo que le da un gran historial de uso y demuestra su seguridad.
Sin embargo, los estudios en los que se compararon las inyecciones subcutáneas de formulaciones tamponadas con citrato con las de fórmulas similares tamponadas con fosfato o histidina han establecido que las soluciones tamponadas con citrato inducen más dolor tras la inyección subcutánea18-20. Si bien este dolor tuvo una duración relativamente corta (menos de dos minutos), plantea la preocupación de que el paciente cumpla con las inyecciones autoadministradas que contienen citrato18. Cuando se formule con ácido cítrico, se debe tener en cuenta el perfil del producto objetivo y la vía de administración prevista. Cuando se prevean inyecciones subcutáneas frecuentes, puede ser más apropiado otro agente tampón.
Ácido acético
El ácido acético tiene un pKa de aproximadamente 4,8, ofreciendo un rango de amortiguación de 3,7 a 5,6 (Tabla 2). El uso de ácido acético es ideal para la formulación de proteínas estables en estado líquido en condiciones ácidas. La liofilización de las soluciones de ácido acético se acompaña de un aumento del pH debido a la sublimación de la forma ácida volátil del tampón, dejando atrás la sal básica. Esto es potencialmente desestabilizador para la proteína y dificulta el control del pH en los medicamentos liofilizados.
Tampones aprobados adicionales
Trometamina
La trometamina (Tris) (pKa 8.1) tiene propiedades similares al fosfato (pKa 7.2) y podría utilizarse como sustituto en condiciones de pH casi neutro. Ambos tampones exhiben un cambio de pH durante la congelación. En condiciones idénticas, el desplazamiento del pH de la trometamina (+2,1) fue aproximadamente igual al del fosfato ( 1,8), pero en la dirección opuesta (Tabla 2) 8.
La elección de un tampón sobre otro probablemente dependería de la sensibilidad de la proteína individual a la dirección del cambio de pH y de cualquier interacción específica entre proteína y tampón. Se ha demostrado que la trometamina y la histidina son mejores estabilizadores que el fosfato cuando la eritropoyetina fue sometida a estrés a altas temperaturas, lo que evita la agregación al ayudar a la reversibilidad del desdoblamiento21. Ure2p demostró ser más estable contra la formación de fibras cuando se formuló en trometamina versus fosfato22.
Histidina
La histidina, un aminoácido esencial, se está volviendo cada vez más común en formulaciones de terapias proteicas. Con un pKa de 6,1, es ideal para las formulaciones de proteínas en condiciones cercanas a la neutra (Tabla 2).
Se ha demostrado que la histidina protege un anticuerpo monoclonal en estado líquido y liofilizado frente al estrés calorí23-25. Los estudios que examinaron la estabilidad del interferón-tau mostraron que las formulaciones que contenían histidina (seguidas de Tris y luego fosfato) eran las más estables frente a la agregación inducida por calor. Esta estabilización se atribuyó a la unión directa de la histidina a la proteina26. Durante la liofilización, se ha demostrado que la histidina y el ácido aspártico protegen los anticuerpos al actuar como donante de enlace de hidrógeno para preservar las láminas β-intramolecular24-25. Además, se ha encontrado que la histidina tiene las propiedades de un antioxidante debido a su capacidad para unir iones de hierro y oxigeno24,27. El inconveniente del uso de histidina es que se ha observado que las soluciones de histidina cambian de color a temperaturas aceleradas y pH ácido, así como que extraen hierro del acero inoxidable24.
Ácido glucónico, láctico y tartárico
El ácido glucónico, láctico y tartárico son excipientes que se han utilizado casi exclusivamente en formulaciones de moléculas pequeñas. El gluconato de calcio ha sido autorizado para el tratamiento de quemaduras de fluoruro de hidrógeno a través de una aplicación tópica. En casos más graves, se ha utilizado una infusión de una solución de gluconato cálcico al cuatro por ciento en solución salina para prevenir daños tisulares28. De las 23 formulaciones inyectables disponibles comercialmente que contienen ácido láctico que se encuentran en la base de datos de Ingredientes Inactivos de la FDA, cuatro formulaciones se utilizan para productos biológicos: dos péptidos y dos proteínas. De las 12 formulaciones que contienen ácido tartárico, solo una se ha utilizado para formular una proteína. Estos tampones pueden ser sustitutos adecuados del acetato y el citrato.
El ácido glucónico es un compuesto que se forma naturalmente a partir de la oxidación de la glucosa. Es un compuesto interesante, ya que tiene el potencial de actuar como agente tampón, estabilizador y quelante debido a que tiene una estructura que contiene ácidos carboxílicos y grupos hidroxilos.
Se ha demostrado que el tartarato mejora la retención de monómero sobre citrato en una formulación de anticuerpos a pH 4,0-4,5 cuando se almacena en líquido a 25°C29. Se ha planteado la hipótesis de que los grupos hidroxilo del tartarato, el citrato, el malato y, por extensión, el lactato y el gluconato podrían suministrar enlaces de hidrógeno estabilizadores en la fase amorfa de un pastel liofilizado 30-31.
Ácido aspártico y glutámico
Tanto el ácido aspártico como el glutámico se encuentran en infusiones administradas a lactantes y pacientes pediátricos con concentraciones plasmáticas insuficientes de aminoácidos. En TrophAmine®, el aspartato y el glutamato se infunden a concentraciones de 22 mm y 34 mm, respectivamente32. Estas concentraciones son lo suficientemente altas como para proporcionar una amortiguación adecuada de las formulaciones de proteínas.
Se ha demostrado que el ácido glutámico cuando se formula con cantidades iguales de arginina mejora la estabilidad y solubilidad de las proteínas intracelulares23,33,así como previene la agregación durante la reconstitución 23, 34-35. Los estudios sobre insulina y albúmina sérica humana indican que la adición de glutamato y aspartato fue capaz de inhibir la formación de agregados36-38. Los estudios con pegfilgrastim indicaron que la estabilidad de pegfilgrastim formulado en glutamato o formiato era comparable a la del acetato39.
Intermedios del ciclo del ácido cítrico
El citrato, fumarato, α-cetoglutarato, malato y succinato son todos intermedios en el ciclo del ácido cítrico que se encuentran seguros y efectivos como tampones o iones contrarios en formulaciones inyectables. Se han utilizado fumarato, α-cetoglutarato, malato y succinato en un número limitado de productos (Tabla 1). Es lógico pensar que los otros productos intermedios del ciclo de Krebs también pueden ser apropiados para su uso en parenterales. Estos compuestos incluyen aconitato, isocitrato y oxaloacetato. Al ser ácidos carboxílicos divalentes y trivalentes, tienen pKa que van de 2,0 a 6,4, lo que hace que estos compuestos sean adecuados para una amplia gama de formulaciones (Tabla 2).
Debido al uso limitado de estos compuestos como tampones, no está claro si el mismo dolor en la inyección asociado con las inyecciones subcutáneas de citrato estaría asociado con estos compuestos. Sin embargo, hay otras ventajas asociadas con su uso. Se ha demostrado que el citrato induce la gelificación de soluciones de anticuerpos cuando la concentración de proteínas es superior a 100 mg/ml. Esto se atribuyó a la naturaleza trivalente del amortiguador. El succinato, que tiene solo dos ácidos carboxílicos, no se encontró que tenga el mismo efecto al mismo pH40.
Conclusión
Determinar el pH y el sistema tampón correctos es fundamental para llevar los bioterapéuticos a la clínica y al mercado. La necesidad de nuevos excipientes, así como una mejor comprensión de los excipientes existentes, es muy deseable. La histidina, la trometamina y una serie de otros tampones alternativos ofrecen ventajas sobre los excipientes de uso convencional. El uso de estos tampones alternativos no puede hacer más que ayudar a aumentar las herramientas que tienen los formuladores y puede permitir el desarrollo de un tratamiento que de otro modo podría haber fracasado. Para estabilizar el gran número de terapias proteicas en desarrollo, todos los enfoques deben estar abiertos a la consideración.
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Sobre el autor
David Sek obtuvo su licenciatura en Química del Bates College y su Maestría en Química y Biología Química de la Northeastern University. Tiene 10 años de experiencia como científico de formulación y ha pasado los últimos ocho años trabajando en Pfizer estudiando la estabilidad de nuevos bioterapéuticos.