François Clouet nació en Tours, como hijo del pintor de corte Jean Clouet. Jean Clouet era nativo del sur de los Países Bajos y probablemente de la zona de Bruselas. François Clouet estudió con su padre. Heredó el apodo de su padre ‘Janet’ y es mencionado como tal en algunas fuentes tempranas y en la literatura antigua.
La referencia más antigua a François Clouet es un documento fechado en diciembre de 1541 en el que el rey renuncia en beneficio de la herencia de su padre, que había renunciado a la corona como herencia de un extranjero. En este documento, se dice que el joven Clouet siguió a su padre muy de cerca en su arte. Al igual que su padre, ocupó el cargo de novio de la cámara y pintor ordinario del rey, y en lo que respecta al salario, comenzó donde lo dejó su padre. Muchos dibujos se atribuyen a este artista, a menudo sin una certeza perfecta. Sin embargo, hay más que hacer que en el caso de su padre.
A medida que los escritores de la época cantaban las alabanzas de François Clouet, su nombre se conservó cuidadosamente de reinado en reinado, y hay una tradición antigua e ininterrumpida en la atribución de muchas de sus pinturas. No hay, sin embargo, ningún testimonio original de sus obras, ni se conocen documentos que garanticen las ascripciones generalmente aceptadas. A él se le atribuyen los retratos de Francisco I en los Uffizi y en el Louvre, y varios dibujos relacionados con ellos.
Probablemente también pintó el retrato de Catalina de Médici en Versalles y otras obras, y con toda probabilidad un gran número de los dibujos que se le atribuyeron fueron de su mano.
Uno de sus retratos más notables es el de María, Reina de Escocia, un dibujo en tizas en la Bibliothèque Nationale, y de carácter similar son los dos retratos de Carlos IX y el de Chantilly de Margarita de Francia. Quizás su obra maestra es el retrato de Isabel de Austria en el Louvre.Esta pieza causó una impresión importante en Claude Lévi-Strauss. En particular, ayudó a inspirar su teoría de la modèle réduit, o de las obras de arte como «modelos en miniatura», y otras teorías de obras de arte, en su libro La Mente salvaje.
Clouet residió en París en la rue de Ste Avoye en el barrio del Templo, cerca del Hotel de Guise, y en 1568 se sabe que estuvo bajo el patrocinio de Claude Gouffier de Boisy, Señor de Oiron, y su esposa Claude de Baune. Otro hecho comprobado sobre François Clouet es que en 1571 fue convocado a la oficina de la Corte de la Casa de la Moneda, y su opinión fue tomada en la semejanza al rey de un retrato hecho por la casa de la moneda. Preparó la máscara mortuoria de Enrique II, ya que en 1547 había tomado una máscara similar de la cara y las manos de Francisco I, para que la efigie que se usaría en el funeral pudiera prepararse a partir de sus dibujos; y en cada una de estas ocasiones ejecutó la pintura que se usaría en las decoraciones de la iglesia y las banderas para la gran ceremonia.
Se cree que varias miniaturas son su obra, un retrato muy notable es la figura de medio cuerpo de Enrique II en la colección de J. Pierpont Morgan. Otro de sus retratos es el de François, duque de Alençon, en la colección Jones del Victoria & Albert Museum. Catalina de Médici describió los esfuerzos de Maistre Jamet (usó el nombre de su padre) en el retrato de Alençon al embajador en Londres, Mothe Fénélon.Ciertas representaciones de miembros de la familia real que estaban en la colección del Palacio Hamilton y en la venta de Magniac se le atribuyen generalmente.
Murió el 22 de diciembre de 1572, poco después de la masacre de San Bartolomé, y su testamento, en el que se menciona a su hermana y a sus dos hijas ilegítimas, y se trata de la disposición de una considerable cantidad de bienes, sigue existiendo. Sus hijas se convirtieron posteriormente en monjas.