Der US Food, Drug and Cosmetic Act von 1938 verpflichtete Hersteller und Pharmaunternehmen als Reaktion auf eine Tragödie, bei der 100 Kinder durch die Anwesenheit von Diethylenglykol in einem antibakteriellen Produkt getötet wurden, für die Sicherheit von Arzneimittelzusatzstoffen / -hilfsstoffen in ihren Produkten verantwortlich zu sein. Um zu klären, was erforderlich ist, um einen neuen Hilfsstoff zu etablieren, veröffentlichte die FDA 2005 einen Leitfaden mit dem Titel ‚Nonclinical Studies for the Safety Evaluation of Pharmaceutical Excipients‘, in dem die Sicherheitsstudien beschrieben werden, die für die Zulassung eines Hilfsstoffs erforderlich sind1,2. Neuere Artikel haben die Notwendigkeit alternativer Hilfsstoffe für die Verwendung in Formulierungen1,3,4 gefordert. Formulierer bevorzugen im Allgemeinen Präzedenzfälle aufgrund ihres gut etablierten Sicherheitsprofils sowie der mit der Zulassung eines neuen Hilfsstoffes verbundenen Risiken und Kosten3. Bei der Qualifizierung eines neuen Hilfsstoffs müssen Sicherheitsstudien durchgeführt werden, und im Falle eines unerwünschten Ereignisses bestehen Zweifel daran, ob das unerwünschte Ereignis auf den Hilfsstoff oder das Produkt zurückzuführen war. Bei der Verwendung eines Hilfsstoffs ist zwar die bisherige Erfahrung mit einem injizierbaren Verabreichungsweg für die Rechtfertigung seiner Anwendung wertvoll, es ist jedoch anzumerken, dass nach den geltenden Vorschriften eine Änderung des Verabreichungsweges oder eine Erhöhung der Konzentration über die derzeit höchste Dosis hinaus zusätzliche Sicherheitsdaten erfordern1,2. Der Bedarf an neuen Hilfsstoffen ist allgemein anerkannt, aber die Erweiterung unseres Wissens über die Verwendung weniger weit verbreiteter Hilfsstoffe ist ebenso wichtig und bietet gleichzeitig einen einfacheren regulatorischen Weg.
Die Bestimmung des richtigen pH-Werts und Puffersystems ist wohl der kritischste Schritt bei der Formulierung eines Proteins, um seine Löslichkeit und Stabilität (chemisch und physikalisch) sicherzustellen 3,5-7. Der Artikel konzentriert sich auf die Stabilisierung von Biotherapeutika. Puffer, die sowohl in kleinen Molekülen als auch in von der FDA zugelassenen parenteralen Proteinformulierungen enthalten sind, werden als Rechtfertigung für die Untersuchung der stabilisierenden Wirkung dieser Puffer auf Proteine herangezogen. Tabelle 1 listet die Anzahl der eindeutigen Formulierungen auf, die auf den Etiketten der von der FDA zugelassenen Produkte zu finden sind. Identische Formulierungen, die sich aus der Formulierung von Generika oder unterschiedlichen Dosierungsstärken ergeben, wurden ausgeschlossen. Wann immer auf die Salzform des Puffers hingewiesen wird, sollte davon ausgegangen werden, dass der Puffer mit Natriumhydroxid oder Salzsäure titriert wird, da dies die häufigsten Titriermittel sind.
Die gebräuchlichsten Puffer, die in parenteralen Formulierungen verwendet wurden, waren Citrat, Phosphat und Acetat. Einige der mit diesen Hilfsstoffen verbundenen Stärken und Schwächen werden hervorgehoben. Das Ziel dieses Papiers ist es, die Aufmerksamkeit auf andere zugelassene, aber weniger häufig verwendete Puffermittel zu lenken, die eine umfassendere Verwendung erfordern, um allgemein akzeptiert zu werden. Während sich dieser Artikel ausschließlich auf Puffer konzentriert, erstreckt sich das gleiche Argument auf andere Arten von Hilfsstoffen. Da sich die Biotechnologie als Industrie weiterentwickelt und mehr einzigartige Proteingerüste entwickelt werden, wird es immer wichtiger, neue Wege zur Stabilisierung dieser Proteine zu finden. Manchmal reichen die gebräuchlichsten Hilfsstoffe nicht aus, um eine ausreichende Stabilität zu gewährleisten oder Technologien zur Arzneimittelabgabe zu ermöglichen.
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Häufig verwendete Puffer
Natriumphosphat
Natriumphosphat (pKa 2.1, 7.2 und 12.3) ist der am häufigsten verwendete Puffer in parenteralen Formulierungen (Tabelle 1). Die bemerkenswerteste Einschränkung bei der Verwendung von Phosphat als Puffer ist die Auswirkung des Einfrierens auf Änderungen des pH-Werts. Die Verschiebung des pH-Werts während des Einfrierens wurde ausführlich untersucht. Die pH-Verschiebung wird auf die selektive Kristallisation des zweibasischen Salzes zurückgeführt. Die Kristallisation kann durch die Gefriergeschwindigkeit, den Start-pH-Wert und das Vorhandensein anderer Cosolute beeinflusst werden. Eine Verschiebung des pH-Werts von ungefähr zwei Einheiten ist während des Gefrierens ziemlich typisch, aber Verschiebungen des pH-Werts bis zu 3,6 Einheiten wurden berichtet8-10. Die sich ändernde pH-Umgebung hat das Potenzial, das Protein während der Verarbeitung von Arzneimittelmassensubstanzen oder der Lyophilisierung von Arzneimittelproduktlösungen11-17 zu destabilisieren. Dies ist am besorgniserregendsten unter Bedingungen, bei denen hohe Phosphatkonzentrationen verwendet werden oder andere kristallisierende Hilfsstoffe vorhanden sind, da diese Bedingungen zur Induzierung der Phosphatkristallisation beitragen. Lösungen, die hohe Konzentrationen an Protein oder nicht kristallisierbaren gelösten Stoffen (z. B. Saccharose) enthalten, hemmen die Phosphatkristallisation und minimieren pH-Verschiebungen.
Zitronensäure
Zitronensäure ist einer der am häufigsten verwendeten Puffer (Tabelle 1). Es handelt sich um einen dreiwertigen Puffer, der drei Carbonsäuren mit pKa von 3,1, 4,8 und 6,4 enthält (Tabelle 2) und einen breiten Pufferbereich5 bietet. Laut der Inactive Ingredient Database der FDA ist Citrat in über 100 zugelassenen, injizierbaren Produkten enthalten, was ihm eine lange Anwendungsgeschichte verleiht und seine Sicherheit beweist.
Studien, die subkutane Injektionen von citratgepufferten Formulierungen mit vergleichbaren Formulierungen vergleichen, die mit Phosphat oder Histidin gepuffert sind, haben jedoch gezeigt, dass citratgepufferte Lösungen bei subkutaner Injektion mehr Schmerzen verursachen18-20. Während dieser Schmerz von relativ kurzer Dauer war (weniger als zwei Minuten), wirft er Bedenken hinsichtlich der Compliance des Patienten mit selbstverabreichenden Injektionen mit Citrat auf18. Bei der Formulierung mit Zitronensäure sollten das Zielproduktprofil und der beabsichtigte Verabreichungsweg notiert werden. Wenn häufige subkutane Injektionen vorgesehen sind, kann ein anderes Puffermittel geeigneter sein.
Essigsäure
Essigsäure hat eine pKa von etwa 4,8 und bietet einen Pufferbereich von 3,7-5,6 (Tabelle 2). Die Verwendung von Essigsäure ist ideal für die Formulierung von Proteinen, die im flüssigen Zustand unter sauren Bedingungen stabil sind. Die Lyophilisation von Essigsäurelösungen geht mit einer Erhöhung des pH-Werts einher, da die flüchtige saure Form des Puffers sublimiert wird und das basische Salz zurückbleibt. Dies ist potenziell destabilisierend für das Protein und erschwert die Kontrolle des pH-Wertes in den lyophilisierten Arzneimitteln.
Zusätzliche zugelassene Puffer
Tromethamin
Tromethamin (Tris) (pKa 8.1) hat ähnliche Eigenschaften wie Phosphat (pKa 7.2) und könnte als Ersatz in der Nähe von neutralen pH-Bedingungen verwendet werden. Beide Puffer zeigen beim Einfrieren eine pH-Änderung. Unter identischen Bedingungen war die pH-Verschiebung für Tromethamin (+2,1) etwa gleich der von Phosphat (1,8), jedoch in entgegengesetzter Richtung (Tabelle 2)8.
Die Wahl eines Puffers gegenüber einem anderen wäre dann wahrscheinlich von der Empfindlichkeit des einzelnen Proteins gegenüber der Richtung der pH-Verschiebung und irgendwelchen spezifischen Protein-Puffer-Wechselwirkungen abhängig. Tromethamin und Histidin erwiesen sich als bessere Stabilisatoren als Phosphat, wenn Erythropoetin einer hohen Temperaturbelastung ausgesetzt war, und verhinderten die Aggregation, indem sie die Reversibilität der Entfaltung förderten21. Ure2p erwies sich als stabiler gegen Fibrillenbildung, wenn es in Tromethamin im Vergleich zu Phosphat formuliert wurde22.
Histidin
Histidin, eine essentielle Aminosäure, wird in Formulierungen von Proteintherapeutika immer häufiger eingesetzt. Mit einem pKa von 6,1 ist es ideal für die Proteinformulierungen unter nahezu neutralen Bedingungen (Tabelle 2).
Es wurde gezeigt, dass Histidin einen monoklonalen Antikörper sowohl im flüssigen als auch im lyophilisierten Zustand vor Hitzestress schützt23-25. Studien, die die Stabilität von Interferon-tau untersuchten, zeigten, dass Formulierungen, die Histidin (gefolgt von Tris-Phosphat) enthielten, am stabilsten gegen hitzeinduzierte Aggregation waren. Diese Stabilisierung wurde auf die direkte Bindung von Histidin an das Protein zurückführt26. Während der Lyophilisation wurde gezeigt, dass Histidin und Asparaginsäure Antikörper schützen, indem sie als Wasserstoffbrückendonor wirken, um intramolekulare β-Blätter zu erhalten24-25. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass Histidin aufgrund seiner Fähigkeit, Eisenionen und Singulett-Sauerstoff zu binden, die Eigenschaften eines Antioxidans hat24,27. Der Nachteil der Verwendung von Histidin besteht darin, dass beobachtet wurde, dass Histidinlösungen unter beschleunigten Temperaturen und saurem pH-Wert ihre Farbe ändern und Eisen aus rostfreiem Stahl extrahieren24.
Gluconsäure, Milchsäure und Weinsäure
Gluconsäure, Milchsäure und Weinsäure sind Hilfsstoffe, die fast ausschließlich in niedermolekularen Formulierungen verwendet wurden. Calciumgluconat wurde zur Behandlung von Fluorwasserstoffverbrennungen durch eine topische Anwendung zugelassen. In schwereren Fällen wurde zur Vorbeugung von Gewebeschäden eine Infusion einer vierprozentigen Calciumgluconatlösung in Kochsalzlösung angewendet28. Von den 23 im Handel erhältlichen, injizierbaren Formulierungen, die Milchsäure enthalten, die in der FDA–Datenbank für inaktive Inhaltsstoffe enthalten sind, werden vier Formulierungen für Biologika verwendet – zwei Peptide und zwei Proteine. Von den 12 Formulierungen, die Weinsäure enthalten, wurde nur eine zur Formulierung eines Proteins verwendet. Diese Puffer können geeignete Ersatzstoffe für Acetat und Citrat sein.
Gluconsäure ist eine Verbindung, die auf natürliche Weise durch Glucoseoxidation gebildet wird. Es ist eine interessante Verbindung, da es das Potenzial hat, als Puffer, Stabilisator und Chelatbildner zu wirken, da es eine Struktur aufweist, die Carbonsäuren und Hydroxylgruppen enthält.
Es wurde gezeigt, dass Tartarat die Retention von Monomer gegenüber Citrat in einer Antikörperformulierung bei pH 4,0-4,5 verbessert, wenn es als Flüssigkeit bei 25 ° C gelagert Wird29. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass die Hydroxylgruppen in Weinstein, Citrat, Malat und im weiteren Lactat und Gluconat stabilisierende Wasserstoffbrückenbindungen in der amorphen Phase eines lyophilisierten Kuchens liefern30-31.
Asparaginsäure und Glutaminsäure
Sowohl Asparaginsäure als auch Glutaminsäure werden in Infusionen gefunden, die Säuglingen und pädiatrischen Patienten mit unzureichenden Plasmakonzentrationen von Aminosäuren verabreicht werden. In TrophAmine® werden Aspartat und Glutamat in Konzentrationen von 22 mm bzw. 34 mm infundiert32. Diese Konzentrationen sind ausreichend hoch genug, um eine ausreichende Pufferung von Proteinformulierungen bereitzustellen.
Es wurde gezeigt, dass Glutaminsäure bei Formulierung mit gleichen Mengen Arginin die Stabilität und Löslichkeit intrazellulärer Proteine verbessert23,33 sowie Aggregation während der Rekonstitution verhindert23,34-35. Studien an Insulin und humanem Serumalbumin zeigen, dass die Zugabe von Glutamat und Aspartat die Bildung von Aggregaten hemmen kann36-38. Studien mit Pegfilgrastim zeigten, dass die Stabilität von Pegfilgrastim, das in Glutamat oder Formiat formuliert wurde, mit Acetat vergleichbar war39.
Zitronensäurezyklus-Zwischenprodukte
Citrat, Fumarat, α-Ketoglutarat, Malat und Succinat sind alle Zwischenprodukte im Zitronensäurezyklus, die sich als sicher und wirksam als Puffer oder Gegenionen in injizierbaren Formulierungen erwiesen haben. Fumarat, α-Ketoglutarat, Malat und Succinat wurden in einer begrenzten Anzahl von Arzneimitteln verwendet (Tabelle 1). Es liegt nahe, dass die anderen Zwischenprodukte des Krebs-Zyklus auch für die Verwendung in parenteralen geeignet sein können. Diese Verbindungen umfassen Aconitat, Isocitrat und Oxalacetat. Als zwei- und dreiwertige Carbonsäuren weisen sie PKAS im Bereich von 2,0 bis 6,4 auf, wodurch diese Verbindungen für eine Vielzahl von Formulierungen geeignet sind (Tabelle 2).
Aufgrund der begrenzten Verwendung dieser Verbindungen als Puffer ist unklar, ob die gleichen Schmerzen bei der Injektion, die mit subkutanen Injektionen von Citrat verbunden sind, mit diesen Verbindungen verbunden wären. Es gibt jedoch andere Vorteile, die mit ihrer Verwendung verbunden sind. Es wurde gezeigt, dass Citrat die Gelierung von Antikörperlösungen induziert, wenn die Proteinkonzentration über 100 mg / ml lag. Dies wurde auf die dreiwertige Natur des Puffers zurückgeführt. Succinat mit nur zwei Carbonsäuren zeigte bei gleichem pH40 nicht die gleiche Wirkung.
Fazit
Die Bestimmung des richtigen pH-Wertes und Puffersystems ist entscheidend, um Biotherapeutika in die Klinik und auf den Markt zu bringen. Der Bedarf an neuen Hilfsstoffen sowie ein besseres Verständnis bestehender Hilfsstoffe ist sehr wünschenswert. Histidin, Tromethamin und eine Reihe anderer alternativer Puffer bieten Vorteile gegenüber herkömmlich verwendeten Hilfsstoffen. Die Verwendung dieser alternativen Puffer kann nur dazu beitragen, die Werkzeuge zu erweitern, die Formulierer haben, und kann die Entwicklung eines Therapeutikums ermöglichen, das andernfalls möglicherweise gescheitert wäre. Um die große Zahl der in der Entwicklung befindlichen Proteintherapeutika zu stabilisieren, sollten alle Ansätze in Betracht gezogen werden können.
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Über den Autor
David Sek erwarb seinen BS in Chemie vom Bates College und seinen MS in Chemie und Chemischer Biologie von der Northeastern University. Er verfügt über 10 Jahre Erfahrung als Formulierungswissenschaftler und hat die letzten acht Jahre bei Pfizer damit verbracht, die Stabilität neuartiger Biotherapeutika zu untersuchen.