resultater og diskussion
under vores undersøgelse af DNA-skadesignalering (32, 33) observerede vi to fremtrædende bånd i chk1-immunoblotter: Chk1-båndet ved 56 kDa og et hurtigere migrerende bånd på 43 kDa. Det hurtigere migrerende bånd blev detekteret af Chk1-antistoffer, der var reaktive over for det indre kinasedomæne eller den C-terminale sekvens, men ikke af Chk1-antistoffer, der genkendte N-terminalen (Fig. 1A). Dette bånd blev ikke genkendt af G4 monoklonalt antistof fra Santa Crus bioteknologi, der almindeligvis anvendes til immunoblotanalyse af Chk1 (24, 29). Nedslagning af Chk1 via siRNA førte til forsvinden af både Chk1 og 43-kDa-båndet, hvilket yderligere bekræftede deres relevans (Fig. 1B). 43-kDa-proteinet blev ikke påvirket af proteasom-og proteasehæmmere (si-Appendiks, Fig. 1), hvilket øger muligheden for, at det kan være en alternativ splejsningsvariant af Chk1. National Center for Biotechnology Information database viser i øjeblikket tre alternativt splejsede humane Chk1 mRNA ‘ er, der har varierende uoversatte regioner, men koder for det samme Chk1-protein i fuld længde på 476 aminosyrer (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1111). Vores Analyse ved hjælp af en EST-baseret alternativ splejsning forudsigelig database (http://genome.ewha.ac.kr/ECgene) foreslog imidlertid muligheden for en unik splejsningsvariant af Chk1, hvor ekson 3 alternativt splejses eller slettes. For direkte at teste denne mulighed udførte vi RT-PCR ved hjælp af primere inden for chk1-kodningssekvensen (Fig. 1C). RT-PCR ved hjælp af primersættet P1, hvor den forreste primer blev designet inden i ekson 3, genererede et enkelt amplikon af den forventede størrelse, hvorimod RT-PCR med P2-eller P3-primersættet (begge baseret på sekvenser flankerende ekson 3) genererede to amplikoner, den ene med den forventede størrelse på Chk1 og den anden 200 BP kortere (Fig. 1C). Sekventering bekræftede, at det længere amplicon faktisk var Chk1, og især det kortere amplicon var en alternativ splejsningsvariant af Chk1, der manglede ekson 3 (Fig. 1D og Si tillæg, Fig. 2A). Denne splejsningsvariant blev forudsagt at oversætte til en n-terminalt afkortet form af Chk1 bestående af 382 aminosyrer, som vi kaldte Chk1-short eller Chk1-s (Fig. 1D og Si tillæg, Fig. 2). I gelelektroforese vandrede in vitro-oversat Chk1 – s på samme måde som 43-kDa-proteinet fra HEK293-celler (Fig. 1E). Vi immunopræcipiterede yderligere 43-kDa-proteinet fra HEK293 cellelysat til massespektrometri og bekræftede dets identitet som Chk1-S. N-terminal trunkering i Chk1 – s er i overensstemmelse med immunoblot-resultaterne, der viser, at det ikke blev genkendt af antistofferne, der var reaktive over for den N-terminale sekvens af Chk1 (Fig. 1A). Realtids-og RT-PCR-analyse detekterede chk1-s mRNA-ekspression i flere humane væv, og udtrykket er generelt højere i føtalvæv (SI-tillæg, Fig. 3 A og D). Immunoblot-analyse detekterede yderligere chk1-s-proteinekspression i humane, mus-og rottecellelinjer og også i humane føtalvæv (SI-tillæg, Fig. 3B) og musens primære renale tubulære celler (si-tillæg, Fig. 3C). CDNA i fuld længde af Chk1 – S blev også klonet fra tre normale humane væv (thymus, tyktarm, føtal lever) og sekventeret for at bekræfte, at det koder for en n-terminalt afkortet splejsningsvariant af Chk1. Sammen har disse eksperimenter identificeret en unik splejsningsvariant af Chk1, der er n-terminalt afkortet og bredt udtrykt i pattedyrceller og væv.
identifikation af Chk1 – s som en unik, n-terminalt afkortet splejsningsvariant af Chk1. (A) HEK293 cellelysat blev analyseret ved immunoblotting ved anvendelse af antistoffer, der specifikt genkendte N-terminalen (Kurt-Chk1-NT), kinasedomænet (Kurt-Chk1-KD) eller C-terminalen af Chk1 (Kurt-Chk1-CT). Ud over Chk1 blev et 43-kDa-protein afsløret af Kurt-Chk1-KD og Kurt-Chk1-CT, men ikke Kurt-Chk1-NT. (B) HEK293-celler blev transficeret med Chk1 siRNA (siChk1) eller en krypteret sekvens (siCon) i 48 timer til opsamling af helcellelysat til immunoblotanalyse under anvendelse af purpur-Chk1-KD. siChk1 formindskede ekspressionen af både Chk1 og 43-kDa-proteinet. (C) RNA blev isoleret fra HEK293-celler til RT-PCR ved anvendelse af tre forskellige sæt primere til Chk1: P1, P2 og P3 (relative sekvensplaceringer er vist i diagrammet). To amplikoner blev detekteret ved RT-PCR under anvendelse af primersætene, der flankerede ekson 3 (P2 og P3), hvorimod kun et amplikon blev forstærket under anvendelse af primersættet P1, hvoraf den forreste primer var inden for ekson 3 af Chk1. D) skematisk gengivelse af alternativ splejsning af Chk1, hvilket resulterer i et n-terminalt afkortet protein, Chk1-S. (E) Chk1-s blev klonet til in vitro-translation, og det oversatte protein sammen med HEK293 cellelysat blev analyseret ved immunoblotanalyse. In vitro oversat chk1 migreret på samme måde som 43-kDa-båndet i HEK293-celler.
Hvad er funktionen af Chk1-s? Regulerer det cellecykluskontrolpunkter som Chk1? Med disse spørgsmål bestemte vi først de tidsmæssige og rumlige ekspressionsmønstre for Chk1-s i cellecyklussen. HEK293 celler blev synkroniseret ved G1 -, G1/S-eller G2/M-faser ved henholdsvis serumsult, dobbelt thymidinblok eller nocodasol. Chk1 – s var lavt i G1-faseceller og højere i G1/S-og G2/M-celler (si-tillæg, Fig. 4 A og B). Når celler blev synkroniseret ved G1 / s-fase ved dobbelt thymidinblok og derefter frigivet, steg både chk1 og Chk1-s-ekspression efter indtræden i S-fase (Fig. 2A). En tydelig forskel mellem chk1 og Chk1-s udtryk var, at mens Chk1 udtryk toppede i midten af S fase, chk1-s udtryk fortsatte med at stige fra S til M fase (Fig. 2A). Interessant nok blev høje niveauer af chk1-s-ekspression observeret ved 7 timer efter cellecyklusfrigivelse fra dobbelt thymidinblok, et tidspunkt, hvor cellerne endnu ikke var mitotiske (SI-tillæg, Fig. 4C). Vi kvantificerede yderligere chk1-s:Chk1-forholdet i asynkron og S eller G2/M synkroniserede celler. På trods af variationerne af chk1-s-ekspression i HEK293, U2OS og primære renale tubulære celler var chk1-s:Chk1-forholdet over 1 i alle celler i G2/M-fase (SI-tillæg, Fig. 5). I asynkrone celler blev Chk1-s og Chk1 hovedsageligt lokaliseret i kernen (si-tillæg, Fig. 6A). I G2 / M-faseceller akkumulerede nogle Chk1-s og Chk1 imidlertid i centrosomer (SI-tillæg, Fig. 6 B og C). Lokaliseringen af Chk1 i centrosomer er kritisk for dens G2/M kontrolpunktfunktion, hvor den forhindrer for tidlig aktivering af Cdk1 og mitotisk indgang (34, 35). Vores resultater indikerer, at Chk1-s også kan lokaliseres til centrosomer, hvilket giver en rumlig og tidsmæssig regulering af Chk1 for at indlede mitotisk indrejse. Dernæst bestemte vi virkningerne af Chk1 eller Chk1-s overekspression i HEK293 og U2OS celler. Sammenlignet med GFP-Chk1 inducerede GFP-Chk1-s en fremtrædende nuklear fænotype, der var karakteriseret ved nuklear kondensation og dannelse af mikronuklei og flere eller multilobede kerner (Fig. 2B). På tidligere tidspunkter viste de transficerede celler nuklear / kromatinkondensation markeret med svag og punkteret histon-H3 phosphorylering (Fig. 2B), der indikerer for tidlig mitotisk indtræden. Senere udviklede disse celler mikrokerner eller multilobede kerner, karakteristika for mitotisk katastrofe (Fig. 2B). Celletælling viste, at GFP-Chk1-s inducerede den nukleare fænotype i 20% af u2os-celler (Fig. 2C). Lignende virkninger blev vist ved YFP-Chk1 – s og Chk1-s-Myc (Fig. 2C), hvilket indikerer, at den observerede nukleare fænotype blev induceret af Chk1-s og ikke af fusionsproteinmærkerne. I modsætning hertil blev for tidlig mitotisk indtræden ikke induceret af Chk1 eller dens kinase-døde mutant Chk1-KD (Fig. 2C). Chk1 – s inducerede også den slående nukleare fænotype i andre celletyper (SI-tillæg, Fig. 7). Især blev der rapporteret om en lignende nuklear fænotype i celler og murine modeller, der manglede en eller begge Chk1-alleler (7, 36, 37), hvilket antyder, at Chk1-s kan fungere som en endogen hæmmer af Chk1. For yderligere at teste denne mulighed genererede vi tet-on U2OS-cellelinjer, der kan induceres til at udtrykke Chk1, Chk1-KD eller Chk1-S. cellerne blev synkroniseret ved G1/s-fase ved dobbelt thymidinblok, induceret af doksycyclin og derefter frigivet til nocodasolholdigt medium. Cirka 80% af chk1-s-ekspressive celler kom ind i mitose , mens 60% af chk1 – eller Chk1-KD-ekspressive celler gjorde det (Fig. 2D). Det er vigtigt, at mens de fleste mitotiske celler i chk1 – og Chk1-KD-ekspressionsgrupperne havde 4n DNA, havde 25% af mitotiske celler fra Chk1-s-ekspressionsgruppen mindre end 4N DNA-indhold (Fig. 2D), hvilket indikerer afvigende mitotisk indtræden i disse celler uden afslutning af DNA-replikation. Derudover resulterede Chk1-s overekspression i tidligere indtræden i mitose, som indikeret ved udseendet af pH3-positive celler (SI-tillæg, Fig. 8). Chk1 er en nøgleregulator for mitotisk indrejse eller S-til-G2/M-overgangen i cellecyklussen. Ved at phosphorylere CDC25A (inducere dets nedbrydning) og Affald1 forhindrer Chk1 CDK1-aktivering og mitotisk indtræden (5, 15-20). Vi viste, at induktion af Chk1-s af doksycyclin i Tet-on U2OS-cellerne resulterede i højere niveauer af CDC25A og lavere niveauer af phospho-CDK1, hvilket antyder, at Chk1-s antagoniserede Chk1 for at inducere mitotisk indtræden (Fig. 2E). Specifik nedlukning af Chk1-s via RNAi var ikke vellykket, fordi Chk1-s-sekvensen er indeholdt i chk1 mRNA. Imidlertid kunne et antisense-oligonukleotid komplementært til det unikke ekson2–ekson4-kryds i Chk1-s specifikt reducere chk1-s-ekspression (SI-tillæg, Fig. 9A). Chk1 – s nedregulering markant reduceret celleproliferation (si Appendiks, Fig. 9B). Interessant nok ændrede Chk1 – s nedregulering ikke signifikant cellecyklusprofilen (si-tillæg, Fig. 9C). Fordi Chk1 fungerer ved flere cellecykluskontrolpunkter (f.eks. G2/M, spindel, intra-s), kan Chk1-s antagonisere Chk1 for at lette cellecyklusprogression på flere steder. Som et resultat kan inhibering af Chk1-s bremse cellecyklussen i forskellige faser og resultere i undertrykkelse af proliferation uden større ændringer i cellecyklusfordelingen.
regulering af cellecyklussen af Chk1-S. (A) HEK293-celler blev synkroniseret med dobbelt thymidinblok og derefter frigivet til medium indeholdende. (Venstre) Cellecyklusprofil analyseret ved propidiumiodid (PI) farvning og FACS analyse. (Højre) Immunoblotanalyse af Chk1 og Chk1-s i cellelysatet opsamlet på angivne tidspunkter efter frigivelsen fra thymidinblok. Asynkrone celler (B) u2os-celler blev transficeret med GFP-Chk1 eller GFP-Chk1-s (grøn) og derefter fikseret til immunofluorescens af phospho-histon H3 (rød) og nuklear farvning med Hoechst33342 (blå). (Øvre) Chk1-s, men ikke Chk1, inducerede for tidlig kromatinkondensation og svag pH3-farvning (pile). (Lavere) på et sent tidspunkt viste Chk1-s-transficerede celler egenskaberne ved mitotisk katastrofe inklusive mikronuklei og multilobede kerner (pile). (C) u2os-celler blev transficeret med de angivne gener, og celler med den nukleare fænotype af for tidlig kromatinkondensation og mitotisk katastrofe blev talt. Data angiver middelværdi af SD-værdi; * P < 0,05 versus vektorgruppe. Resultaterne viser, at Chk1-s overekspression specifikt førte til den nukleare fænotype. (D) U2OS-celler blev transficeret med de angivne gener, synkroniseret med dobbelt thymidinblok og frigivet i 7 timer. cellerne blev derefter fikseret til pH3-immunofluorescens og PI-farvning og analyseret ved FACS. Data angiver middelværdi af SD-værdi; * P < 0,05 versus vektorgruppe. Resultaterne viser, at Chk1-s specifikt inducerede for tidlig mitotisk indtræden uden afslutning af DNA-replikation (celler med <4N DNA). E) tet-on u2os-celler blev induceret med eller uden doksycyclin. Cellerne blev derefter synkroniseret ved S-fase ved dobbelt thymidinblok og frigivet i 7 timer. Helcellelysat blev opsamlet til immunoblotanalyse af de indikerede proteiner. Resultaterne viser, at induceret chk1-s-ekspression førte til en stigning i CDC25A og fald i phospho-CDK1, hvilket bidrog til for tidlig mitotisk indtræden.
hvordan modvirker Chk1-s Chk1? Vi antog, at Chk1-s kunne interagere med Chk1 for at blokere dens kinaseaktivitet. Konsekvent flag-Chk1-s udtrykt i HEK293 celler coimmunoprecipiteret med endogen Chk1 (Fig. 3A). Desuden in vitro oversat Myc-Chk1 og Chk1-s coimmunoprecipiteret (Fig. 3B), hvilket tyder på en direkte chk1-Chk1-s interaktion. Vi demonstrerede yderligere coimmunudfældning af Chk1 med det N-terminale domæne, men ikke det C-terminale domæne, af Chk1-s (Fig. 3C), hvilket tyder på kravet om N-terminalsekvensen i Chk1-s for dets interaktion med Chk1. Funktionelt bestemte vi virkningerne af Chk1-s på Chk1-kinaseaktivitet. Chk1-Myc blev udtrykt og immunopræcipiteret til in vitro kinaseanalyse i fravær eller tilstedeværelse af oprenset Chk1-S. Som vist i Fig. 3D, Chk1-kinaseaktivitet blev delvist endnu signifikant undertrykt af Chk1-s, men ikke af varmedenatureret Chk1-S. I modsætning hertil mindskede Chk1-s ikke Chk2-aktivitet, som har lignende substratpræferencer som Chk1. Sammenlignet med Chk1 mangler Chk1-s en del af kinasedomænet inklusive ATP-bindingsstedet (Fig. 1D) og viste som forventet ikke signifikant proteinkinaseaktivitet (Fig. 3D). Chk1 – s kan også undertrykke kinaseaktiviteten af N-terminalt mærket Chk1 (FLAG-Chk1) i en in vitro kinase-analyse (SI-tillæg, Fig. 10). Disse resultater antyder, at Chk1-s kan hæmme Chk1 via molekylær interaktion. En nylig undersøgelse viste, at vask af chk1-immunopræcipitater med en strengere radioimmuno-Udfældningsassay (RIPA) buffer kan markant øge Chk1-kinaseaktiviteten, hvilket antyder, at Chk1 normalt hæmmes af undertrykkende faktorer (29); identiteten af de undertrykkende faktorer er imidlertid ukendt. Vi bekræftede effekten af RIPA-buffervask, og især viste vi yderligere, at tilsætning af eksogen Chk1-s kunne vende effekten af RIPA-buffervask på Chk1-kinaseaktivitet (si-tillæg, Fig. 11), hvilket antyder, at Chk1-s kan være en af de vigtigste endogene undertrykkende faktorer for Chk1.
Chk1-s interagerer med Chk1 for at undertrykke sin kinaseaktivitet. (A) HEK293-celler blev transficeret med FLAG-Chk1-s eller tom vektor til opsamling af lysat til immunudfældning (IP) ved anvendelse af Anti-FLAG-antistoffer. Immunopræcipitaterne blev analyseret for Chk1 og FLAG-CHK1-s ved immunoblotting ved anvendelse af henholdsvis Anti-FLAG og anti-N terminus Chk1 antistoffer. Resultaterne viser co-IP af FLAG-Chk1 – s med endogen Chk1. (B) Chk1-Myc og Chk1-S blev fremstillet ved hjælp af TNT in vitro transskription/translation kit (Promega). (Til venstre) in vitro produceret Chk1-Myc og Chk1-s vist ved immunoblotting. (Til højre) Chk1-Myc blev immunopræcipiteret under anvendelse af anti-Myc-antistoffer efter inkubation med eller uden Chk1-S. immunopræcipitaterne blev analyseret for Chk1-s og Chk1-Myc ved immunoblotting. Resultaterne indikerer en direkte interaktion mellem Chk1 og Chk1-S. (C) HEK293-celler blev transficeret med Myc-mærket Chk1 – s eller dets C-eller N-terminale deletionsmutanter for at indsamle lysat til immunudfældning ved hjælp af anti-Myc-antistoffer. Immunopræcipitaterne blev undersøgt for tilstedeværelsen af Chk1. Resultaterne viser coimmunudfældning af Chk1 med Chk1-s og dens C-terminal deletion mutant, men ikke med dens N-terminal deletion mutant. (D) HEK293-celler blev transficeret med Myc-mærket Chk1-s, Chk1 eller Chk2 for at indsamle lysat til immunudfældning ved anvendelse af anti-Myc-antistoffer. Immunopræcipitaterne, indeholdende Chk1-s-Myc, Chk1-Myc eller Chk2-Myc, blev inkuberet med eller uden Chk1-s i 1 time og derefter tilsat til kinaseaktivitetsanalysen under anvendelse af Chktide som substrat. Denatureret Chk1 – S blev fremstillet ved kogning. Data angiver middelværdien af SD-SD; * P < 0,05 versus chk1-Myc-gruppen. Resultaterne viser, at native Chk1-s specifikt kan hæmme Chk1. (E) HEK293 celler blev transficeret med chk1-Myc eller Chk1-Myc (S317A/S345A) mutant. Cellerne blev derefter ubehandlet eller behandlet med 100 nM camptothecin i 2 timer for at opsamle lysat til immunudfældning med anti-Myc antistoffer. Immunopræcipitaterne blev analyseret for Myc-Chk1, phosphoryleret (serin 345) Chk1 og Chk1-s ved immunoblotting. Chk1 input blev også verificeret i prøverne. Resultaterne viser, at Chk1-s coimmunopræcipiteret eller associeret med Chk1 i normale celler, og at forbindelsen blev formindsket under camptothecin-induceret DNA-skade. Forbindelsen mellem Chk1-s og chk1(S345A/S317A) mutanten blev imidlertid ikke forstyrret under DNA-skade, hvilket antyder, at phosphorylering af Chk1 ved S345 og S317 kan være nødvendig for dissociation af Chk1-s fra Chk1. (F) HEK293 celler blev cotransfected med enten Chk1-Myc + tom vektor eller Chk1-Myc + dn-ATR efterfulgt af behandling med 100 nM camptothecin i 2 timer. Det cellulære lysat blev opsamlet til immunudfældning med anti-Myc-antistoffer efterfulgt af immunoblotanalyse af de angivne proteiner. Resultaterne viser, at camptothecin-induceret forstyrrelse af chk1–Chk1-s dissociation afhænger af ATR og chk1 phosphorylering.
i DNA-skadesrespons (DDR) aktiveres Chk1 markant via phosphorylering ved s345-og S317-rester (7, 13, 38, 39). På trods af anerkendelse af vigtigheden af s345/s317 phosphorylering forbliver det uklart, hvordan denne phosphorylering aktiverer Chk1 (28-30). Vi viste, at chk1-s-udtryk ikke ændrede sig mærkbart i DDR (si-tillæg, Fig. 12). Imidlertid blev chk1-Chk1-s-interaktionen svækket i DDR induceret af camptothecin, en DNA-topoisomerase I-hæmmer og DNA-skadeligt middel (Fig. 3E). Især syntes dissociationen af Chk1 fra Chk1 – s i DDR afhængig af chk1-phosphorylering ved S345/S317, fordi chk1(S345A/S317A) mutanten ikke dissocierede fra Chk1-s under camptothecin-behandling (Fig. 3E). I DDR afhænger chk1-aktivering af ATR-medieret phosphorylering (7, 13, 14). Vi viste, at inhibering af ATR via en dominerende-negativ mutant (dn-ATR) ikke kun undertrykte camptothecin-induceret chk1-s phosphorylering, men forhindrede også chk1–Chk1-s dissociation (Fig. 3F). Tilsvarende dissocierede Chk1 fra Chk1 – s under cisplatin-induceret DDR, og dissociationen blev forhindret af dn-ATR (SI-tillæg, Fig. 13). Tilsammen antyder resultaterne, at phosphorylering af Chk1 kan forstyrre dets interaktion med den endogene hæmmer Chk1-s, hvilket fører til chk1-aktivering i DDR.
identifikationen af Chk1-s som en unik regulator for cellecyklusprogression og cellulær proliferation fik os til at undersøge dens ekspression i kræftvæv. På mRNA-niveau udtrykte de fleste kræftvæv højere niveauer af Chk1 og Chk1-s end normale væv (SI-Appendiks, Fig. 14). Interessant nok viste testikelcarcinomer en markant regulering af Chk1 – s, men ikke Chk1 (Fig. 4A). Specifik opregulering af Chk1 – s blev yderligere bekræftet ved immunoblotanalyse i testikelcarcinomvæv, især i kræftprøver i sent stadium (Fig. 4B). Som tidligere rapporteret (5) havde både normalt og malignt testikelvæv høje niveauer af chk1-ekspression. Øget ekspression af Chk1 – s blev også påvist under progressionen af ovariecancer (Fig. 4B). Det relativt høje niveau af chk1 og Chk1-s ekspression i begge føtale (SI Appendiks, Fig. 3) og kræft (Fig. 4) væv antyder, at Chk1-s kan fremskynde cellecyklusprogression og fremme celleproliferation under disse betingelser.
chk1-s regulering i kræft. (A) realtids PCR-analyse af chk1 og Chk1-s mRNA-ekspression i normale testikelvæv og testikelcarcinomprøver, der viser regulering af Chk1-s i testikelcarcinomer. (B) Immunoblotanalyse af Chk1 og Chk1-s i humant normalt testikel-og testikelkræftvæv, der viser øget chk1-s-ekspression i kræftvæv i sent stadium. (C) Nøgenmus blev injiceret med 10 liter 106 Tet-på MDA-MB-231 celler, der var doksycyclin-inducerbare til at udtrykke henholdsvis Chk1, Chk1-KD eller Chk1-s. Efter tumoretablering til 100 mm3 blev musene opretholdt på drikkevand med eller uden doksycyclin. Tumorvolumen blev målt ugentligt (vist for fjerde uges værdier, n = 8). Data angiver middelkr. Resultaterne viser, at induceret ekspression af Chk1-s, men ikke Chk1 eller Chk-KD, hæmmede tumorvækst. (D) densitometri af immunoblot-resultater af doksycyclin-induceret Chk1-Myc, Chk1-KD-Myc og Chk1-s-Myc-ekspression i udskårne tumorer (n = 3 for hver gruppe). Signalerne blev normaliseret med Chk1-Myc (vilkårligt indstillet som 100). Data angiver middelkr. Resultaterne viser, at doksycyclin inducerede lignende niveauer af ekspression af Chk1-Myc, Chk1-KD-Myc og Chk1-s-Myc i tumorerne. (E) nøgne mus blev injiceret med chk1-s-inducerbare celler for at etablere tumorer og derefter opretholdt på drikkevand med eller uden doksycyclin i 4 uger. Tumorvæv blev opsamlet til immunoblotanalyse. Resultaterne viser højere CDC25A-ekspression i tumorgenotransplantaterne med doksycyclin-induceret chk1-s-ekspression.
vi undersøgte yderligere effekten af ektopisk chk1-s-ekspression på ksenograft tumorvækst hos mus. Tumorgenotransplantater blev etableret i nøgne mus ved hjælp af Tet-on MDA-MB-231 brystkræftcellelinjer, der kan induceres af doksycyclin til at udtrykke Chk1, Chk1-s eller Chk1-KD. Induktion af Chk1 eller Chk1-KD af doksycyclin påvirkede ikke tumorvækst; imidlertid resulterede induktion af Chk1-s i en 40% reduktion i tumorvolumen (Fig. 4C). Chk1-s-induceret tumorvæv viste også cdc25a-akkumulering, hvilket indikerer inhiberingen af Chk1 (Fig. 4E). Selvom resultaterne kan antyde en unik kræftstrategi, forbliver den fysiologiske relevans af tvungen overekspression af ektopisk Chk1-s uklar. Disse resultater giver imidlertid et principbevis for, at vippe Chk1–Chk1-s-balancen kan føre til mitotisk katastrofe og reduktion af celleproliferation.
observationen af, at Chk1-s overekspression reducerede tumorvækst i fremmedhad (Fig. 4 C–E) syntes modstridende med observationen om, at tumorprøverne fra humane patienter udtrykte relativt høje niveauer af Chk1-s for celleproliferation (Fig. 4 tillæg A og B og Si, Fig. 14). For at forene disse data er det vigtigt at genkende forskellene mellem de eksperimentelle forhold. Relativt høj chk1-s-ekspression i humane tumorer kan tilskrives tilstedeværelsen af proliferative celler i disse væv. Konsekvent er Chk1-s også højt i føtalvæv, der er stærkt proliferative (SI-Appendiks, Fig. 3A). Det er vigtigt, at chk1-s-ekspression i disse proliferative væv midlertidigt er begrænset til den sene s til M-fase (Fig. 2 og Si tillæg, Fig. 4). Denne tidsmæssige regulering kan sikre, at Chk1-aktivitet hæmmes efter (og først efter) afslutningen af DNA-replikation i S-fase for cellecyklusprogression i G2/M-fase. Men når ektopisk Chk1 – S er tvunget til at overekspressere i dyrkede celler eller fremmedgjorte tumorer, forstyrres den tidsmæssige begrænsning af chk1-s-ekspression; med andre ord er Chk1-s høj gennem hele cellecyklussen inklusive S-fase, hvilket resulterer i konstant blokade af Chk-1 og for tidlig mitotisk indtræden, hvilket fører til mitotisk katastrofe og reduceret celleproliferation.
afslutningsvis har denne undersøgelse identificeret en splejsningsvariant af Chk1, Chk1-s, der er en nøgleregulator for Chk1 i den normale cellecyklus og under DDR (SI-tillæg, Fig. 15). I den uforstyrrede cellecyklus øges chk1-ekspression ved S-fase, og nogle Chk1-molekyler kan phosphoryleres ved ATR, der forhindrer chk1-s-binding, hvilket resulterer i høj chk1-aktivitet og S-fase vedligeholdelse indtil afslutningen af DNA-replikation. I G2-fase øges chk1-s-ekspression, og som rapporteret (29) falder Chk1–phosphorylering, hvilket fremmer en chk1-Chk1-s-interaktion for at undertrykke Chk1-aktivitet. Faldet i Chk1-aktivitet ved G2/M-fase er kritisk for mitotisk indtræden. Under betingelser med chk1-s induktion eller overekspression, for store mængder Chk1-s sekvestrer Chk1 og formindsker dens kinaseaktivitet under S-fase, hvilket resulterer i for tidlig mitotisk indtræden uden afslutning af DNA-replikation, hvilket fører til mitotisk katastrofe. Under DNA-beskadigelse phosphoryleres Chk1, hvilket resulterer i nedsat chk1-s-binding, øget Chk1-aktivitet og G2/M-anholdelse (SI-tillæg, Fig. 11). Vores resultater understøtter” de-undertrykkelse ” – mekanismen for chk1-aktivering (29). Det er vigtigt, at Chk1-s ser ud til at være en af de vigtigste undertrykkende faktorer for Chk1-aktivitet. Ved antagonisering af Chk1 kan Chk1 – s accelerere cellecyklussen, hvilket fører til øget proliferation i føtal og kræftvæv. Høje niveauer af Chk1 i prolifererende celler koordinerer s-fase og mitose, hvorimod høje niveauer af Chk1-s kan give en kraftig omskifter til S-til-G2/M-faseovergangen. I modsætning hertil inducerer tvungen overekspression af Chk1-s ved for høje niveauer, ubalanceret af Chk1, for tidlig mitotisk indtræden og celledød (Fig. 2) og undertrykker tumorvækst i tumorgenograft modeller (Fig. 4). Chk1 er blevet foreslået at være et effektivt terapeutisk mål i kræftbehandling, og Chk1-hæmmere evalueres i kliniske forsøg (40-43). Identifikationen af Chk1-s som en endogen hæmmer af Chk1 kan åbne nye forskningsområder inden for cellecyklusregulering, DNA-skadesrespons og kræftbehandling.