Y chromosoom microdeletie in een vader en zijn vier onvruchtbare zonen

Abstract

Microdeleties van Yq worden geassocieerd met azoöspermie en ernstige oligozoöspermie. In het algemeen zijn mannen met deleties onvruchtbaar en daarom worden deleties niet overgedragen aan zonen, tenzij in-vitrofertilisatie (IVF) en intracytoplasmatische sperma-injectie (ICSI) worden uitgevoerd. We melden een ongewone familie gekenmerkt door meerdere leden met onvruchtbaarheid en Yq microdeletion. De volledige reproductiegeschiedenis, sperma-analyses en bloedmonsters werden uitgelokt bij relevante familieleden. De voorbereiding en kwantificering van DNA werden uitgevoerd met behulp van commerciële kits. Een totaal van 27 paren van sequence tagged sites based primer sets specifiek voor de Y microdeletion regio loci werden gebruikt voor screening. Zuidelijke vlekken met behulp van verwijderd in azoöspermie (DAZ) en ribosomal binding motif (RBM) cDNAs werden vervolgens geanalyseerd voor bevestiging. De proband, zijn drie broers en vader werden allemaal verwijderd voor DAZ, maar niet voor RBM. Ten tijde van de analyse was de vader van de proband azoöspermisch, terwijl zijn vier zonen ofwel ernstig oligozoöspermisch of azoöspermisch waren. In tegenstelling tot hun vader, de vier zonen zijn onvruchtbaar en hebben geen nakomelingen, behalve voor een van hen die een dochter bereikt alleen na IVF/ICSI behandeling voor onvruchtbaarheid. Microdeletions van Yq waarbij het Daz-gen betrokken is, worden geassocieerd met een variabele fenotypische expressie die duidelijk normale vruchtbaarheid kan omvatten.

Inleiding

onvruchtbaarheid komt voor bij ~14% van de paren (Mosher, 1985) en afwijkingen bij de mannelijke partner worden geschat in Maximaal de helft van de gevallen (Swerdloff et al., 1985). Pogingen om de oorzaken van azoöspermie te evalueren hebben aangetoond dat na uitsluiting van traditioneel herkenbare oorzaken (dat wil zeggen abnormaal karyotype, obstructie, varicocoele, hormonaal defect, enz.), zijn de meeste gevallen (50-75%) onverklaard en worden idiopathisch genoemd (Pryor et al., 1997). Onlangs is gemeld dat tot 30% van de mannen met ‘idiopathische’ azoöspermie hebben microdeletions van het Y chromosoom (Henegariu et al., 1993; Ma et al., 1993; Nagafuchi et al., 1993; Kobayashi et al., 1994; Najmabadi et al., 1996; Reijo et al., 1996; Vogt et al., 1996; Pryor et al., 1997). Hoe en of deze microdeleties azoo/oligozoöspermie veroorzaken is het onderwerp van intensief onderzoek en debat.

essentieel voor het argument dat Y microdeleties onvruchtbaarheid veroorzaken is de observatie dat vruchtbare mannen zelden y microdeleties vertonen. Microdeleties bij vier van de 200 onderzochte vruchtbare mannen zijn gemeld (Pryor et al., 1997). Echter, de schrappingen bij deze mannen waren zeer klein en zeer waarschijnlijk vertegenwoordigde onbeduidend polymorfisme. Relatief grote verwijderingen van het soort geassocieerd met mannelijke onvruchtbaarheid zijn niet gemeld bij mannen met een normale vruchtbaarheid. Hoewel algemeen wordt aangenomen dat deze schrappingen ontstaan de novo en dat vader op zoon transmissie van Y microdeletion niet zou worden verwacht, een paar zeldzame gevallen van vader op één zoon transmissie van Y chromosoom microdeletion zijn gemeld (Kobayashi et al., 1994; Stuppia et al., 1996; Vogt et al., 1996; Pryor et al., 1997). In slechts drie gevallen (Kobayashi et al.) is echter melding gemaakt van verticale overdracht van een microdeletie waarbij de in azoöspermie (DAZ) locus verwijderde plaats van vader op zoon., 1994; Vogt et al., 1996; Pryor et al., 1997). We beschrijven nu een familie van vier generaties waarin een azoöspermische vader en zijn vier onvruchtbare zonen allemaal een schijnbaar identieke microdeletie delen die de Daz locus omvat. Deze familie vertegenwoordigt het eerste en enige rapport van spontane verticale overdracht van DAZ deletie op meerdere Nakomelingen. Het verstrekt bewijsmateriaal dat één enkele YQ microdeletion in variërende fenotypic uitdrukking in verschillende individuen kan resulteren. Het is klinisch significant, in die zin dat de aanwezigheid van een microdeletie is geen absolute marker voor onvruchtbaarheid en kan worden geassocieerd met schijnbaar normale vruchtbaarheid.

materialen en methoden

Screening op Yq-microdeletie werd uitgevoerd op een routinematige basis voor mannelijke onvruchtbaarheid met behulp van een protocol beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Review Board van College Of Physicians & Surgeons, Columbia University. Monsters werden genomen van patiënten na geïnformeerde toestemming.

semenanalyse

de resultaten werden geanalyseerd aan de hand van WHO-criteria met een Nikon-fase-contrastmicroscoop.

serumhormoonconcentraties

follikelstimulerend hormoon( FSH), luteïniserend hormoon (LH) en testosteron werden gemeten door middel van solid-phase, two site chemiluminescent enzyme immunometric assay (Immulite; Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, CA, USA). Normale waarden voor mannen zijn FSH <10 mIE/ml; LH <10 mIE/ml; en testosteron 270-1070 ng / dl.

genomisch DNA

de extractie van genomisch DNA uit volbloed werd uitgevoerd door lysis van rode bloedcellen, gevolgd door lysis van witte bloedcellen en hun kernen. Cellulaire eiwitten werden verwijderd door zoutprecipitatie, en genomisch DNA werd neergeslagen met isopropanol met behulp van Puregene DNA extractie kit (Gentra Systems, Inc. Minneapolis, MN, USA; catalogusnr. D-5004).

polymerasekettingreactie (PCR)

Primers werden geproduceerd als gedroogde oligonucleotiden op een geautomatiseerde DNA-synthesizer (Perkin-Elmer Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA). Een totaal van 27 Y chromosoom specifieke sequentie tagged sites (STS) (figuur 1) werden geselecteerd uit een STS kaart (Vollrath et al., 1992). Zij omvatten de drie voorgestelde spermatogenese loci AZFa, AZFb, en AZFc (volgens Vogt et al., 1996) met Yq-intervallen 5, 6 en 7. Als snel Screeningsprotocol werd een PCR-multiplex-systeem, bestaande uit twee tot zes verschillende primerparen, gebruikt bij in totaal zes multiplexreacties (tabel I). Bij elke PCR-run werden een vrouwelijke controle en een normale mannelijke controle opgenomen. Alle PCR reacties werden uitgevoerd in polycarbonaat (Techne®) platen in een MJ Research® machine. De PCR voorwaarden waren in wezen zoals eerder beschreven (Henegariu et al., 1993). In het kort werd in een 14 µl totaalvolume reactie 50 ng genomisch DNA gebruikt als template, 1 µl primer standaardoplossing (mix I of II of III of IV of V of VI bestaande uit 10 pmol per primer), 12 µl `PCR cold mix’ (1,5 mmol/l MgCl2, 0,2 mmol/L van elke dNTP, 5% DMSO, 1× Taq polymerase reactiebuffer zonder Mg2+), 1,25 IU Taq DNA polymerase (Promega) en 1 druppel olie. De complete mixen werden direct in een thermocycler geplaatst die tot 94°C was voorverwarmd.: 94°C, 30 s (smelten); 55°c, 45 s (gloeien); en 72°C, 60 s (verlenging). De laatste verlenging was 5 minuten. De PCR-reactieproducten werden vervolgens op 3% agarose gels (Bio-Rad, ultra-pure kwaliteit) gescheiden door elektroforese in TBE-buffer. PCR-producten werden gekleurd met ethidiumbromide en gevisualiseerd door blootstelling aan ultraviolet licht. ST ‘ s die geen versterking vertoonden in multiplexreacties werden bevestigd door PCR met een enkele reactie met de juiste positieve en negatieve controles. Een STS werd geacht afwezig te zijn na drie versterkingsfouten.

Southern hybridization

Southern blotting werd uitgevoerd volgens het vastgestelde protocol (Sambrook et al., 1989). Kort, werd 5 µg genomic DNA verteerd met HindIII of TaqI, in werking gesteld op een 0.7% agarose-gel in standaard TBE-buffer, overgebracht naar een nylon membraan, en gekruist met 32P-geëtiketteerde sondes. De Daz sonde was de gezuiverde insert van een plasmide (pDP1577) die de volledige lengte cDNA (Reijo et al., 1995). Evenzo was de RBM-sonde de plasmide-insert van een RBM cDNA-kloon (MK5) (Ma et al., 1993).

vaderschap bepaling

vaderschap van alle vier de zonen werd bevestigd door het aantonen van de verwachte segregatie van vier zeer polymorfe autosomale markers (Weber en mei 1989). Dit waren de d21s156, D21S270, D13S132 en D13S159 met heterozygogens van respectievelijk 0,83, 0,86, 0,84 en 0,90.

Fluorescerende in-situ hybridisatie (FISH)

FISH voor DAZ werd uitgevoerd met Cosmid 63C9 (Saxena et al., 1996), met behulp van gevestigde methoden (Yu et al., 1996).

resultaten

de proband (individu III 8 in Figuur 2) en zijn echtgenoot (III-9) presenteerden zich aan de Reproductive-Endocrinology-Infertility Clinic in Columbia-Presbyterian Medical Center met klachten van primaire onvruchtbaarheid gedurende 3 jaar. Het testen toonde normale karyotype en normale serum hormoonspiegels aan, terwijl sperma analyses ernstige oligozoöspermie toonden (tabel II). Microdeletion screening door STS gebaseerde PCR onthulde de aanwezigheid van een microdeletion in subinterval 6D–6F van de Y chromosoom lange arm (figuur 1). Tijdens de discussie meldde de proband dat zijn twee oudere broers (III-4 en III-6) bekend waren als azoospermisch en onvruchtbaar. Later bleek dat alle drie de broers een schijnbaar identieke microdeletie hadden. Testiculaire biopsie uitgevoerd op een van hen (III-6) aangetoond `Sertoli cell only’ syndroom.De ontdekking van microdeletie bij drie onvruchtbare broers suggereerde dat hun vader waarschijnlijk dezelfde deletie zou dragen. Er werd een gedetailleerd onderzoek uitgevoerd naar de rest van de familie die allen in een klein stadje in de Dominicaanse Republiek woonden. Een volledige reproductieve geschiedenis werd opgewekt uit de volwassen familieleden. De familierelaties in de stamboom (Figuur 2) werden bevestigd door het tonen van de verwachte segregatie van verschillende autosomale polymorfe markers (gegevens niet getoond) voor de relevante familieleden (I-1, I-2, II-1, II-8 en II-1, II-2, III-1, III-4, III-6, III-8, III-10). Er was geen bewijs van niet-vaderschap. Grondige cytogenetische studies op relevante familieleden (I-1, II-1, II-6, II-8, II-10, III-1, III-4, III-6, III-8, III-14, III-15, III-17, III-19 en IV-1) brachten normale karyotypen aan het licht. Bij zeven van de 16 mannetjes werd sperma geanalyseerd en bij de meeste familieleden werden bloedmonsters genomen.

tabel II geeft een samenvatting van de resultaten van sperma-analyse en endocriene onderzoeken bij relevante familieleden. De proband (III-8), zijn vader (II-1) en twee van zijn drie broers (III-4, III-6) bleken ofwel azoöspermisch of ernstig oligozoöspermisch te zijn. De oudste broer van de proband (III-1) weigerde zaadanalyse. Bovendien werd de oom van de proband (II-8) gevonden om azoöspermie en opgeheven FSH met laag testosteron te hebben. Zoals getoond in Figuur 1, werden de proband, zijn vader en drie broers allen gevonden om microdeletion van Yq door STS PCR analyse te hebben. Zuidelijke bevleking met de Daz (Figuur 3) en RBM (gegevens niet getoond) probes bevestigde dat de deletie de Daz locus maar niet de RNA binding motif (RBM) locus omvatte. VISANALYSE met de Daz Cosmid 63C9 (Saxena et al., 1996) van de vader van de proband (II-1) leukocyten vertoonde uniforme afwezigheid van de Daz locus (Figuur 4).

de bevinding dat individuele II-8 in de stamboom azoöspermisch was, maar geen microdeletie had, was een verrassing. De Daz-locus bij dit individu werd verder getest door Zuidelijke analyse met behulp van het Daz cDNA en een ander restrictie-enzym (TaqI). Er is geen afwijking van de Daz locus te zien. Bovendien vertoonden vissen met de Daz Cosmid 63C9 een normale intensiteit (gegevens niet weergegeven).

de proband (III-8) en zijn oudere broer (III-6) zochten een behandeling van onvruchtbaarheid. Na uitgebreide begeleiding kozen ze voor in-vitrofertilisatie (IVF) en intracytoplasmatische sperma-injectie (ICSI). De proband (III-8) en zijn vrouw (III-9) ondergingen twee IVF-ICSI cycli die er niet in slaagden om een zwangerschap secundair aan slechte ovariale reactie te veroorzaken. De broer van de proband (III-6) en zijn vrouw (III-7) ondergingen één cyclus van gecontroleerde ovariële hyperstimulatie en negen eicellen werden teruggevonden. Elf volwassen spermatozoa werden gevonden in drie ejaculaten op de dag van het ophalen en gebruikt voor ICSI. Drie bevruchte oöcyten die vervolgens gespleten en werden overgebracht. Ze bracht een gezonde vrouwelijke baby ter wereld (IV-2).

discussie

we melden een uitzonderlijke familie waarin een azoöspermische vader en zijn vier onvruchtbare zonen een schijnbaar identieke Yq microdeletie met betrekking tot de Daz locus delen. De de-novo mutatie die tot de microdeletion van DAZ leidde schijnt te zijn ontstaan in de vader van de proband (II-1). Deze deletie zal naar verwachting azoo/oligozoöspermie en mannelijke onvruchtbaarheid veroorzaken, en toch kreeg hij spontaan vijf kinderen en was zich niet bewust van een vruchtbaarheidsprobleem. Interessant, echter, alle vier de zonen zijn onvruchtbaar en zijn ofwel azoöspermisch of ernstig oligozoöspermisch.

deze familie roept verschillende problemen op met betrekking tot het verband tussen Yq-microdeletie en onvruchtbaarheid. Ten eerste bevestigt het dat verticale transmissie van YQ microdeletion mogelijk is en kan leiden tot latere onvruchtbaarheid bij de mannelijke nakomelingen. Ten tweede is het duidelijk dat dezelfde deletie kan leiden tot verschillende fenotypen bij verschillende individuen. Hoewel de vader (II-1) van de vier jongens in dit gezin azoospermisch was op het moment van analyse, verwekte hij zijn eerste kind op de leeftijd van 25 en zijn laatste op de leeftijd van 38 jaar. Zo bezat hij een zekere mate van vruchtbaarheid over een grote periode van jaren. Evenzo, impliceert microdeletion van het chromosoom van Y, specifiek DAZ, niet noodzakelijk een levenslange geschiedenis van azoöspermie noch sluit het de vorming van een grote familie uit. Zijn vier zonen, aan de andere kant, zijn onvruchtbaar en ofwel azoöspermisch of ernstig oligozoöspermisch.

het Daz-gen wordt voorgesteld als de azoöspermiefactor op het Y-chromosoom. Deze familie toont duidelijk aan dat hoewel DAZ een cruciale rol kan hebben in spermatogenese, het niet essentieel is voor de vruchtbaarheid. Bovendien kan het totale verlies van de Daz-gencluster geassocieerd worden met een histologisch beeld van `alleen Sertoli-cellen’ en met een arrestatie van de rijping van sperma (Foresta et al., 1997; Pryor et al., 1997). Verschillende auteurs hebben een slechte correlatie gevonden tussen de locatie van Y microdeleties (inclusief Daz deleties) met het klinische en histologische fenotype van de patiënten (Reijo et al., 1995, 1996; Vogt et al.; 1996; Silber et al., 1998). De bevindingen in deze familie zijn het erover eens dat een dergelijke correlatie nogal problematisch kan blijken te zijn. Testiculaire biopsie van de broer van de proband (III-6) toonde een beeld van `alleen Sertoli-cel’, terwijl de proband (III-8 met sperma telling 0,5×106/ml) duidelijk zou worden verwacht dat een zekere mate van sperma rijping op biopsie. Bovendien kan testiculaire biopsie niet representatief zijn voor de gehele testikel omdat er geografische heterogeniteit kan zijn voor spermatogenese zoals in individuele III-6 wiens ejaculaten Rijpe spermatozoa bevatten.

we kunnen alleen speculeren over de basis voor fenotypische verschillen tussen familieleden met dezelfde deletie. Het is bekend dat identieke deleties binnen autosomen kunnen resulteren in verschillende fenotypen (Schinzel, 1994). Men kan postuleren dat dergelijke verschillen gevolgen zijn van de blootstelling van elk individu aan zijn omgeving of expressie van verschillende modificerende genen. Een vruchtbare vader is beschreven met een microdeletie die verbreed toen overgedragen aan zijn onvruchtbare zoon (Stuppia et al., 1996). Hoewel variabele extensies aan de grenzen van de deletie kunnen bestaan tussen onze verschillende familieleden, kunnen deze moleculaire extensies niet worden onderscheiden door interval mapping. Door PCR-analyse, slaagde dezelfde STSs er niet in om in onze vijf individuen te versterken en de Zuidelijke kruising met de sonde Daz bevestigde een volledige schrapping van deze gencluster. Hoewel het mogelijk is dat de waargenomen verwijderingen in feite niet identiek zijn en aangrenzende gebieden belangrijke genen kunnen bevatten die de mate van fenotypische expressie moduleren, wijzen deze resultaten nog steeds op een grote overlap van verwijderd Y-DNA (inclusief het verlies van DAZ-gencluster) in elk individu van deze unieke familie.

we waren gefascineerd door het feit dat de oom van de proband (II-8) onvruchtbaarheid en azoöspermie heeft, maar geen duidelijke microdeletie door STS-testen. Aangezien southern blot analyse met behulp van zowel de RBM en DAZ sondes evenals vis analyses met behulp van een Daz kosmide waren allemaal volkomen normaal, zijn we gedwongen om te concluderen dat hij een andere etiologie ten grondslag ligt aan zijn onvruchtbaarheid. Toegegeven, het is mogelijk dat hij een kleinere of punt mutatie/perturbatie of proximale/distale herschikking kan hebben die niet detecteerbaar is met de huidige methoden. Hij gaf geen voorgeschiedenis van blootstelling aan gonadotoxinen of andere definieerbare factoren die waarschijnlijk de spermatogenese zouden beïnvloeden.

tot voor kort had y microdeletie weinig klinische betekenis, aangezien een man met deletie zich in het algemeen niet zal voortplanten. Echter, met behulp van ICSI en testiculaire sperma aspiratie (TESA), gecombineerd met IVF, is het nu mogelijk voor oligo/azoöspermische mannen met Y microdeletion zwangerschappen te bereiken (Mulhall et al., 1997; Silber et al., 1998, en individuele III-6). Dit heeft geleid tot bezorgdheid dat dergelijke zwangerschappen mannelijke nakomelingen kunnen produceren met vergelijkbare microdeleties en daaropvolgende onvruchtbaarheid (Reijo et al., 1996; Girardi et al., 1997; Kremer et al., 1997). Yq microdeletion kan inderdaad via ICSI (Kent-First et al., 1996). De familie die we rapporteren suggereert dat mannen met Yq-microdeleties (zoals individuele II-1) die zwanger worden dezelfde microdeletie en het risico van onvruchtbaarheid overdragen aan hun zonen (individuen III-1, III-4, III-6, III-8). Daarom moeten patiënten voorafgaand aan ICSI een Y-microdeletie-screening krijgen en moeten zij worden geadviseerd over de zekerheid dat de YQ-microdeletie en mogelijk onvruchtbaarheid op hun zonen worden overgedragen. Aangezien meer onderzoek is gericht op genetische etiologieën van mannelijke onvruchtbaarheid, zou de identificatie van genen betrokken bij spermatogenese inzicht in de pathofysiologie van mannelijke onvruchtbaarheid en een meer rationele basis voor het initiëren van therapie moeten verstrekken.

Wij danken de gezinnen voor hun samenwerking in het onderzoek; Dr David C. Pagina voor het verstrekken van de DAZ gen-probe en zijn van onschatbare waarde helpen met dit manuscript; Dr Kun Ma voor het verstrekken van de MK5 (RBM1) gen-probe; Dr. Peter Vogt voor het DNA van YQ microdeleted individuen gebruikt om onze STS PCR methodologie te valideren; en C. C. Yu en Patricia Lanzano voor hun onschatbare technische bijstand.

deze studie werd gedeeltelijk gefinancierd door de Columbia Presbyterian Medical Center Office of Clinical Trials House Staff Awards.