vereenvoudigde ChIP-exo assays

antilichamen

Konijn IgG (Sigma) geconjugeerd aan Dynabeads werd gebruikt tegen Tap-tagged stammen waarbij het tap-tag met eiwit A het doelwit was. Het antilichaam van Millipore 07-729 werd gebruikt tegen k562 steekproeven die CTCF richten.

Tn5 zuivering

een aangepaste constructie van Tn5 E54K E110K P242A L372P14 in een pET-45b( + ) vector werd besteld (GenScript) om hyperactief Tn5 uit te drukken met een N-terminal His6-tag. Het plasmide is verkrijgbaar bij Addgene (Addgene ID: 112112). BL21 (DE3) bevoegde E. coli cellen (New England Biolabs) werden getransformeerd en een enkele kolonie werd gekweekt bij 37 °C tot een OD600 van 0,4 in 500 ml LB + 50 µg/ml ampicilline + 30 µg/ml chlooramfenicol. Cellen werden overgebracht naar een 25 °C incubator en geïnduceerd met 0,5 mM isopropyl-β-D-galactopyranoside gedurende 4 uur. de cellen werden verzameld door middel van centrifugeren, eenmaal gewassen met ST Buffer, en de cel pellet werd flash bevroren in vloeibare stikstof.

Tn5 werd gezuiverd zoals eerder beschreven 10, met enkele wijzigingen. Kort werden de cellen geresuspendeerd in 10 volumes (ml/g) TEGX100-Buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glycerol, 0,1% Triton-X 100) die CPI en 100 µM fenylmethylsulfonylfluoride bevatten en gedurende 30 minuten lyseerd door incubatie met lysozym (Sigma; 1 mg / 1 g celpellet) bij kamertemperatuur. Het lysaat werd gecentrifugeerd bij 20.000 × g gedurende 20 min bij 4 °C, en het supernatant werd neergeslagen met 0,25% polyethyleenimine (Sigma) en gecentrifugeerd bij 10.000 × g gedurende 15 min. Het supernatans werd vervolgens neergeslagen met 47% verzadiging ammoniumsulfaat (0.28 g / ml) gedurende een incubatietijd van 30 minuten en vervolgens gedurende 15 minuten bij 20.000 × g gecentrifugeerd.

de pellet werd vervolgens geresuspendeerd in 50 ml Nikkelaffiniteit Belastingbuffer (50 mM kaliumfosfaat, pH 7,4, 50 mM KCl, 20% glycerol) en geladen op een HisTrap HP kolom (GE Healthcare; 5 ml) bij 1,5 ml/min in evenwicht gebracht met dezelfde buffer. De kolom werd achtereenvolgens gewassen met wasbuffer I (50 mm kaliumfosfaat, pH 7,4, 1 M KCl, 50 mM imidazol, 20% glycerol), Wasbuffer II (50 mM kaliumfosfaat, pH 7.4, 500 mM KCl, 50 mM imidazol, 20% glycerol), en vervolgens werd Tn5 geëlueerd met Nikkelaffiniteit Elution Buffer (50 mM kaliumfosfaat, pH 7,4, 500 mM KCL, 500 mM imidazol, 20% glycerol) bij 2 ml/min. Het eluaat werd verdund tot 300 mM KCl met Verdunningsbuffer (50 mM kaliumfosfaat, pH 7,4, 20% glycerol) en het uiteindelijke volume werd aangepast tot 50 ml met TEGX300 Buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glycerol, 0,1% Triton-X 100).

vervolgens werd het monster geladen op een HiTrap heparine HP-kolom (GE Healthcare; 1 ml) in evenwicht gebracht met TEGX300 bij 1 ml/min. Na het wassen met 5 kolomvolumes buffer werd een lineaire NaCl-gradiënt van 10 ml (300 mM tot 1,2 M) uitgevoerd om elute. Tn5 geëlueerd uit de kolom bij ongeveer 600 mM NaCl. Fracties die de belangrijkste elutiepiek bevatten, werden gecombineerd (3,5 ml) en ‘ s nachts gedialyseerd tegen TEGX300-Buffer met 30% glycerol, en vervolgens bewaard bij -80 °C.

Gistchromatinepreparaat

Tap-tagged Saccharomyces cerevisiae-stammen (Open Biosystemen) werden in 500 ml gistpepton-dextrose-media gekweekt tot een OD600 = 0,8 bij 25 °C. De cellen werden Vernet met formaldehyde bij een eindconcentratie van 1% gedurende 15 min bij kamertemperatuur en gedoofd met een eindconcentratie van 125 mM glycine gedurende 5 min. De cellen werden verzameld door middel van centrifugering en gewassen in 1 ml ST-Buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl) bij 4 °C en verdeeld in twee aliquots. De cellen werden opnieuw gepelleteerd, het supernatant werd verwijderd en de pellet werd bevroren.

een 250 ml cultuur aliquot werd gelyseerd in 750 µl FA Lysis Buffer (50 mM Hepes-KOH, pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton, 0.1% natriumdeoxycholaat en CPI) en 1 ml volume van 0,5 mm zirconia / silica parels door kralen te slaan in een Mini-Beadbeater-96 machine (Biospec) gedurende drie cycli van 3 min Aan/5 min uit cycli (monsters werden op ijs gehouden tijdens de off-cyclus). Het lysaat werd overgebracht naar een nieuwe buis en microcentrifugeerd bij maximumsnelheid gedurende 3 min bij 4 °C om het chromatine te pellet. Het supernatant werd weggegooid en de pellet werd geresuspendeerd in 750 µl fa Lysis Buffer aangevuld met 0,1% SDS en overgebracht naar een 15 ml polystyreen conische buis. Het monster werd vervolgens gesoniceerd in een Bioruptor (Diagenode) gedurende 15 cycli met 30 s aan/uit intervallen om DNA-fragmenten 100 tot 500 bp in grootte te verkrijgen. Eén ChIP-exo-test verwerkte het equivalent van 50 ml celcultuur (~6 × 108 cellen). Dit is een handig bedrag in plaats van een minimumbedrag dat nodig is.

K562 chromatinepreparaat

Humane chronische myelogene leukemiecellen (K562, ATCC) werden gehandhaafd tussen 1 × 105 en 1 × 106 cel/ml in DMEM-media aangevuld met 10% foetaal runderserum bij 37 °C met 5% CO2. De cellen werden gewassen met PBS (8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, 150 mM NaCl en 2,7 mM KCl), vervolgens Vernet met formaldehyde bij een eindconcentratie van 1% gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, en gedoofd met een eindconcentratie van 125 mM glycine gedurende 5 minuten. Het supernatant werd verwijderd en de cellen werden geresuspendeerd in 1 ml PBS om te wassen. Cellen werden aliquoted om 100 miljoen cellen te bevatten, gecentrifugeerd, het supernatant werd verwijderd, en de pellet werd flash bevroren.

een 100 miljoen cel aliquot (voor gebruik in meerdere ChIPs) werd gelyseerd in 500 µl (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM NaCl, 0.5% NP40, en volledige proteaseremmer (CPI, Roche)) door 10 minuten op ijs te incuberen. Het lysaat werd microcentrifugeerd bij 2500 rpm gedurende 5 minuten bij 4 °C. Het supernatant werd verwijderd, de pellet resuspendeerde in 1 ml (50 mM Tris-pH 8,0, 10 mM EDTA, 0,32% SDS, en CPI), en geïncubeerd op ijs gedurende 10 minuten om de kernen lyse. Het monster werd verdund met 600 µl immunoprecipitatieverdunningsbuffer (IP-Verdunningsbuffer: 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100 en CPI) tot een eindconcentratie van (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 7 mM EDTA, 56 mM NaCl, 0,4% Triton-X 100, 0.2% SDS, en CPI), en sonicated met een Bioruptor (Diagenode) gedurende 10 cycli met 30 s aan/uit intervallen om DNA fragmenten 100 tot 500 bp in grootte te verkrijgen.

bereiding van het Muizenweefsel

volwassen volwassen mannelijke muizen hersenen, longen, lever en nieren werden royaal geleverd door Dr.Yanming Wang Muizenweefsel werd verwerkt bij 100 mg en chromatine werd gegenereerd, zoals eerder beschreven 21, met kleine wijzigingen. Kortom, 100 mg muizenweefsel werd gehakt in stukjes op ijs, gefixeerd met 1% formaldehyde gedurende 10 minuten, en vervolgens gedoofd met een uiteindelijke concentratie van 125 mM glycine gedurende 5 minuten. Cellen werden gesponnen, gewassen met PBS en vervolgens geresuspendeerd in 1 mL koude Farnham-cellysisbuffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 85 mM KCl, 0,5% NP-40, 0,5% Triton X-100 en CPI). Cellen werden vervolgens geïncubeerd op een rototorque gedurende 20 minuten bij 4 C. geïsoleerde kernen werden geà soleerd door gesponnen en geresuspendeerd in RIPA nucleaire lysis buffer (1 × PBS, 1% NP-40, 0,5% Nadeoxycholaat, 0,5% SDS en CPI). Kernen werden vervolgens gesoniceerd met een Bioruptor (Diagenode) gedurende 10 cycli met 30 s aan/uit-intervallen om DNA te genereren in het 100-500 bp-groottebereik. Levercelaantallen werden geschat zoals eerder beschreven 22, met behulp van een conversiefactor van 1 mg weefsel nat gewicht is gelijk aan ~250.000 cellen.

chromatine-immunoprecipitatie

een kweekequivalent van 50 ml gist of 10 miljoen celequivalent van K562 chromatine werd verdund tot 200 µl met IP-Verdunningsbuffer en ‘ s nachts geïncubeerd bij 4 °C met het geschikte antilichaam. Aan de gistmonsters werd een bedvolume van 10 µl IgG-Dynabeads toegevoegd.; en 3 µg anti-CTCF antilichaam met een 10 µl mengmest-equivalent van eiwit een Mag Sepharose (GE Healthcare) werd toegevoegd aan de k562 monsters.

ChIP-exo 1.1

ChIP-exo 1.1 werd uitgevoerd zoals eerder beschreven 7, 8, 23. In het kort werden de volgende enzymatische stappen uitgevoerd met immunoprecipitated chromatine nog steeds op de hars met meerdere zoutwassingen tussen elke stap: T4 het polymeraseeind van DNA oppoetsen, T4 polynucleotidekinase, Klenow fragment a-tailing, T4 ligase-bemiddelde Read_2 adapter ligation van DNA, phi29 de polymerasevulling van DNA, tweede T4 polynucleotidekinase, lambda exonuclease spijsvertering, en RecJf exonuclease spijsvertering. Na overnight omgekeerde cross-linking en Proteinase K behandeling, werden de volgende stappen uitgevoerd in oplossing: phi29 primer uitbreiding, tweede Klenow fragment a-tailing, T4 DNA ligase-bemiddelde read_1 adapter ligation, en PCR.

ChIP-exo 3.0 en 3.1 (tagmentation-based version)

na immunoprecipitatie werden de volgende stappen uitgevoerd op de hars. Om de Transposase te assembleren werd Tn5 geïncubeerd in een 10 × Transposasemix met de volgende componenten en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd: 12,5 µM Tn5, 50% glycerol en 7,5 µM adapter (NexA2/ME comp). Zie aanvullende tabel 1 voor oligonucleotidesequenties die in dit onderzoek worden gebruikt.

het Chipmateriaal op de hars werd achtereenvolgens gewassen met FA Lysis Buffer, NaCl Buffer (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton-X 100, 0.1% natriumdeoxycholaat), LiCl-Buffer (100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 500 mM LiCl, 1% NP-40, 1% natriumdeoxycholaat) en 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 bij 4 °C.

de tagmentatiereactie (30 µl) bevat: 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 10% dimethylformamide en 1 × Tagmentatiemengsel uit Stap 1 (eindconcentratie: 1,25 µM Tn5, 5% glycerol na incubatie werd de hars tweemaal gewassen met guanidine-hydrochloride buffer (50 mm tris-hcl, pH 7,5, 500 mm guanidine-Hydrochloride, 2 mm EDTA, 1% Triton-X 100, 0.1% sodium deoxycholate) voor 5 min bij 37 °C, dan eens met LiCl Buffer en 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 bij 4 °C.

De fill-in-reactie (30 µl) met: 10 U phi29 polymerase (NEB), 1 × phi29 reactie buffer (NEB), 2 × (200 µg/ml BSA, en 165 µM dNTPs werd geïncubeerd gedurende 20 min bij 30 °C; vervolgens gewassen met 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 bij 4 °C. De kinase reactie (30 µl) met: 10 U T4 PNK (NEB), 1 x een T4-DNA-Ligase Buffer (NEB) en 2 × BSA werd geïncubeerd gedurende 15 min bij 37 °C; vervolgens gewassen met 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 bij 4 °C. De λ exonuclease spijsvertering (100 µl) met: 20 U λ exonuclease (NEB), 1 × λ exonuclease reactie buffer (NEB), 0.1% Triton-X-100, en 5% DMSO werd geïncubeerd gedurende 30 min bij 37 °C; vervolgens gewassen met 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 bij 4 °C. De RecJf exonuclease spijsvertering (100 µl) met: 75 U RecJf exonuclease (NEB), 2 × NEBuffer 2, 0.1% Triton-X-100, en 5% DMSO werd geïncubeerd gedurende 30 min bij 37 °C; vervolgens gewassen met 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 bij 4 °C.

DNA werd geëlueerd van de hars, en omgekeerd cross-linking en Proteïnase K behandeling uitgevoerd werden (40 µl) met daarin: 30 µg Proteïnase K, 25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 2 mM EDTA, 200 mM NaCl, en 0,5% SDS geïncubeerd gedurende 16 uur bij 65 °C. Het supernatant werd vervolgens overgebracht naar een nieuwe buis en gezuiverd met Agencourt AMPure magnetische parels (Beckman Coulter) volgens de instructies van de fabrikant en met behulp van 1,8 × volume AMPure slurry toegevoegd aan het DNA-volume (72 µl).Het monster werd geëlueerd uit de AMPure parels in 10 µl water,en de volgende enzymatische stappen werden uitgevoerd in oplossing.

adapter ligatie (Versie 3.0): voor de primer extensie reactie (totaal reactievolume 20 µl); aan het geresuspendeerde monster werd 1 × phi29 reactiebuffer, 2 × BSA, 100 µM dNTPs en 0,5 µM ME sequentie oligonucleotide (totaal 9 µl) toegevoegd en geïncubeerd gedurende 5 min bij 95 °C, vervolgens 10 min bij 45 °C om de oligo tijd te laten ontharden. Het monster werd verschoven naar 30 °C alvorens 10 u phi29-polymerase (1 µl) toe te voegen en gedurende 20 min bij 30 °C te incuberen; vervolgens gedurende 10 min bij 65 °C om te inactiveren, en verschoven naar 37 °C.

voor de A-tailing-reactie (totaal reactievolume 30 µl); de primer uitbreiding reactie is toegevoegd 10 U Klenow Fragment, -exo (NEB), 1 × NEBuffer 2, 100 µM dATP (totaal 10 µl) en geïncubeerd gedurende 30 min bij 37 °C en 20 minuten op 75 °C te inactiveren, en verschoven naar 25 °C. Voor de tweede adapter ligatie reactie (totale reactie volume 40 µl); aan de Een-tailing reactie is toegevoegd 2,000 U T4 DNA ligase (enzymatics), 1 × NEBNext Snelle Afbinding Buffer (NEB), 375 nM adapter (ExA1-58/13) en geïncubeerd gedurende 1 h bij 25 °C.

Spalk ligatie (versie 3.1): voor adapter ligatie (40 µl); aan het geresuspendeerde DNA werd 1.200 u T4 DNA ligase toegevoegd, 1 × T4 DNA Ligase Buffer, 375 nM adapter (ExA1-58/ExA1-SSL_N5) en geïncubeerd gedurende 1 uur bij 25 °C.

zowel Versie 3.0 als 3.1: De ligatiereactie werd vervolgens gezuiverd met AMPure parels en geresuspendeerd in 15 µl water. De steekproef werd toen versterkt via PCR. Voor PCR-versterking (totaal reactievolume 40 µl); aan het geresuspendeerde DNA werd toegevoegd 2 U Phusion Hot Start polymerase (Thermo scientific), 1 × Phusion HF Buffer (Thermo scientific), 200 µM dNTPs, 500 nM elke primer (P1.3 en NexA2-iNN) en gedurende 18 cycli versterkt (20 s bij 98 ° C denatuur, 1 min bij 52 °C gloeien en 1 min bij 72 °C verlenging). Een kwart van de reactie werd versterkt voor een extra zes cycli (24 totaal) en de aanwezigheid van bibliotheken werd bepaald door elektroforese op een 2% agarose gel.

Grootteselectie: 200-500 bp PCR-producten werden met behulp van de Qiaquick Gel-Extractiekit (Qiagen) gezuiverd uit een 2% agarose-gel.

ChIP-exo 4.0 en 4.1 (single-strand DNA ligation versions)

na immunoprecipitatie werden de volgende stappen uitgevoerd op de hars. De ChIP materiaal kunststof gewassen werd achtereenvolgens met FA Lysis Buffer, NaCl Buffer, LiCl Buffer, en 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 bij 4 °C. Het eind reparatie reactie (50 µl) met: 7.5 U T4-DNA-polymerase (NEB), 2,5 U DNA-Polymerase I (NEB), 25 U T4 PNK, 1 x een T4-DNA-Ligase Buffer, en 390 µM dNTPs werd geïncubeerd gedurende 30 min bij 12 °C; vervolgens gewassen met 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 bij 4 °C. De λ exonuclease spijsvertering (100 µl)met: 20 U λ exonuclease, 1 × λ exonuclease reactie buffer, 0.1% Triton-X-100, en 5% DMSO werd geïncubeerd gedurende 30 min bij 37 °C; vervolgens gewassen met 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 bij 4 °C. De RecJf exonuclease spijsvertering (100 µl)met: 75 U RecJf exonuclease, 2 × NEBuffer 2, 0.1% Triton-X-100, en 5% DMSO swas geïncubeerd gedurende 30 min bij 37 °C; vervolgens gewassen met 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 bij 4 °C.

de Eerste adapter ligatie: ssDNA ligatie (versie 4.0, 40 µl): voor adapterion ligatie 1200 U T4 DNA ligase, 1 x een T4-DNA-Ligase Buffer, en 375 nM enkelstrengs-adapter (ExA1-58-N5) werd geïncubeerd gedurende 1 h bij 25 °C; vervolgens gewassen met 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 bij 4 °C.

Spalk ligatie (versie 4.1, 40 µl): 1200 u T4 DNA ligase, 1 × T4 DNA Ligase Buffer, en 375 nM adapter (ExA2.1-N5/ExA2.1-20) werd geïncubeerd gedurende 1 uur bij 25 °C; daarna gewassen met 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 bij 4 °C.

zowel Versie 4.0 als 4.1: DNA werd geëlueerd uit de hars, en reverse cross-linking en proteïnase K behandeling werd uitgevoerd (40 µl) met: 30 µg proteïnase K, 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mm EDTA, 200 mm NaCl en 0,5% SDS geïncubeerd gedurende 16 uur bij 65 °C.

het supernatant werd vervolgens overgebracht naar een nieuwe buis en gezuiverd met Agencourt AMPure magnetic beads (Beckman Coulter) volgens de instructies van de fabrikant (1,8 × volume). Het monster werd geëlueerd uit de AMPure parels in 20 µl water,en de volgende enzymatische stappen werden uitgevoerd in oplossing.

tweede adapter ligatie: ssdna ligatie (versie 4.0, totaal reactievolume 40 µl): aan het geresuspendeerde DNA werd 1200 u T4 DNA ligase toegevoegd, 1 × T4 DNA Ligase Buffer, 375 nM adapter (ExA2.1-N5/ExA2.1-20) en werd geïncubeerd gedurende 1 uur bij 25 °C.

splintadapter ligatie (versie 4.1, totaal reactievolume 40 µl): aan het geresuspendeerde DNA werd 1200 u T4 DNA ligase toegevoegd, 1 × T4 DNA Ligase Buffer, 375 nM adapter (ExA1-58/ExA1-SSL_N5) en werd geïncubeerd gedurende 1 uur bij 25 °C.

zowel Versie 4.0 als 4.1: De ligatiereactie werd vervolgens gezuiverd met AMPure parels (1,8 × volume) en geresuspendeerd in 15 µl water. De steekproef werd toen versterkt via PCR. Voor PCR-versterking (totaal reactievolume 40 µl); aan het geresuspendeerde DNA werd toegevoegd 2 U Phusion Hot Start polymerase( Thermo scientific), 1 × Phusion HF Buffer (Thermo scientific), 200 µM dNTPs, 500 nM elke primer (P1.3 en NexA2-iNN) en versterkt gedurende 18 cycli (20 s bij 98 °C denatuur, 1 min bij 52 °C gloeien, 1 min bij 72 °C verlenging). Een kwart van de reactie werd versterkt voor een extra zes cycli (24 totaal) en de aanwezigheid van bibliotheken werd bepaald door elektroforese op een 2% agarose gel. Grootte selectie: 200 tot 500 bp PCR producten werden gel-gezuiverd uit een 2% agarose gel met behulp van de QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen).

opmerking: ChIP-exo 4.0 / 4.1 bevat een universele Read_2-adapter, met de barcode later toegevoegd tijdens PCR met lange primers. Wanneer lange PCR-inleidingen in een bibliotheekconstructie werden gebruikt die lambda-exonuclease-spijsvertering impliceerden, leden de bibliotheken aan lage opbrengst en hoge adapterdimers. We gebruiken nu alleen full-length adapters en minimale lengte PCR primers.

ChIP-exo 5.0

na immunoprecipitatie werden de volgende stappen op de hars uitgevoerd. De ChIP materiaal kunststof gewassen werd achtereenvolgens met FA Lysis Buffer, NaCl Buffer, LiCl Buffer, en 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 bij 4 °C. Voor de A-tailing reactie (50 µl) met daarin: 15 U Klenow Fragment, -exo (NEB), 1 × NEBuffer 2, en 100 µM dATP werd geïncubeerd gedurende 30 min bij 37 °C; vervolgens gewassen met 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 bij 4 °C. De eerste adapter ligatie en kinase reacties (45 µl) met: 1200 U T4 DNA ligase, 10 U T4 PNK, 1 × NEBNext Snelle Afbinding Buffer, en 375 nM adapter (ExA2_iNN / ExA2B) werd geïncubeerd gedurende 1 h bij 25 °C; vervolgens gewassen met 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 op 4 °C. De fill-in-reactie (40 µl) met: 10 U phi29 polymerase, 1 × phi29 reactie buffer, 2 × BSA, en 180 µM dNTPs werd geïncubeerd gedurende 20 min bij 30 °C; vervolgens gewassen met 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 bij 4 °C. De λ exonuclease spijsvertering (50 µl) met: 10 U-λ exonuclease, 1 × λ exonuclease reactie buffer, 0.1% Triton-X-100, en 5% DMSO werd geïncubeerd gedurende 30 min bij 37 °C; vervolgens gewassen met 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 bij 4 °C.

DNA werd geëlueerd van de hars, en omgekeerd cross-linking en Proteïnase K behandeling uitgevoerd werden (40 µl) met: 30 µg proteïnase K, 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM EDTA, 200 mM NaCl, en 0,5% SDS geïncubeerd gedurende 16 uur bij 65 °C. Het supernatant werd vervolgens overgebracht naar een nieuwe buis en gezuiverd met Agencourt AMPure magnetische parels (Beckman Coulter) volgens de instructies van de fabrikant (1,8 × volume).Het monster werd geëlueerd uit de AMPure parels in 20 µl water,en de volgende enzymatische stappen werden uitgevoerd in oplossing. Voor tweede adapter ligatie (totaal reactievolume 40 µl): aan het geresuspendeerde DNA werd 1200 u T4 DNA ligase toegevoegd, 1 × T4 DNA Ligase Buffer, 375 nM adapter (ExA1-58/ExA1-SSL_N5) en werd geïncubeerd gedurende 1 uur bij 25 °C. De ligatiereactie werd dan gezuiverd met AMPure parels (1,8 × volume) en geresuspendeerd in 15 µl water.

het monster werd vervolgens versterkt via PCR. Voor PCR-versterking (totaal reactievolume 40 µl); aan het geresuspendeerde DNA werd 2 U Phusion Hot Start polymerase (Thermo scientific), 1 × Phusion HF Buffer (Thermo scientific), 200 µM dNTPs, 500 nM elke primer (P1.3 en P2 toegevoegd.1) en versterkt gedurende 18 cycli (20 s bij 98 °C denatuur, 1 min bij 52 °C gloeien, 1 min bij 72 °C verlenging). Een kwart van de reactie werd versterkt voor een extra zes cycli (24 totaal) en de aanwezigheid van bibliotheken werd bepaald door elektroforese op een 2% agarose gel. Grootte selectie: 200 tot 500 bp PCR producten werden gel-gezuiverd uit een 2% agarose gel met behulp van de QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen).

opmerking: We hebben vastgesteld dat het gebruik van een andere methode dan gelreiniging in dit stadium leidt tot een onaanvaardbaar hoog niveau van adapter dimeren in het eindmonster. De gelreiniging kan het adapterdimer (150 BP-fragment) en kleinere fragmenten van de Spaander-exo bibliotheek (200 BP-fragment = 150 BP-adapters + 50 BP-tussenvoegsel) effectief scheiden.

DNA-sequencing

DNA-sequencing met hoge doorvoer werd uitgevoerd met een NextSeq 500 in gepaarde eindmodus Die 2 × 40 BP-reads opleverde. Sequence reads werden vervolgens afgestemd op de gist (sacCer3) en menselijke (hg19) genomen met behulp van bwa-mem (v0.7.9 a)24. Uitgelijnde reads werden gefilterd om niet-unieke uitlijningen en PCR-duplicaten te verwijderen. De duplicaten van PCR werden gedefinieerd als opeenvolgingslezen die identieke read_1 en Read_2 opeenvolgingen bezitten.

beschikbaarheid van gegevens

alle sequentiebestanden en piekbestanden van deze studie zijn beschikbaar bij NCBI genexpressie omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) onder toetredingsnummers GSE110681 en GSE114606. Coördinaatbestanden, scriptparameters en aangepaste code die worden gebruikt om de cijfers voor dit papier te genereren, kunnen worden gedownload van: https://github.com/CEGRcode/2018-Rossi_NatureCommunications.

alle andere gegevens zijn op redelijk verzoek bij de auteurs beschikbaar.