verborgen in het volle zicht-zeer overvloedig en divers Plankton zoetwaterchloroflexi

overvloed en diversiteit van het phylum Chloroflexi in zoetwateromgevingen

op basis van 16S rRNA lees abundanties van 117 metagenomen uit meren, reservoirs en rivieren, vertegenwoordigden vertegenwoordigers van het phylum Chloroflexi tot 7% van de prokaryotische gemeenschap in het epilimnion (Fig. 1a, b) echter met grote schommelingen. Net als bij eerdere waarnemingen domineerde de CL500-11-lijn hypolimnionmonsters (die minstens 16% bereikten in alle monsters behalve één monster, en bijna 27% in één monster uit Lake Biwa) (Fig. 1c), afgezien van een minder bekende groep aangeduid als de tk10 cluster. De meerderheid van tk10-gerelateerde 16S rRNA sequenties in de SILVA database zijn afkomstig van de bodem, menselijke huid, of Onbekende metagenomische monsters, terwijl slechts vier (1,5%) zijn van freshwaters (aanvullend bestand 1: Figuur S1A).

verrassend genoeg werden de epilimnion-monsters gedomineerd door sequenties die gelieerd waren aan de “SL56 marine group”(tot ca. 5% van de totale prokaryotische gemeenschap). SL56-gerelateerde sequenties van SILVA zijn teruggevonden in een zoetwatermeer en de Global Ocean Series datasets (GOS) . Echter, de GOS monster van waaruit ze werden beschreven is eigenlijk een zoetwater dataset, Lake Gatun (Panama). Dat blijkt duidelijk uit onze resultaten (Fig. 1; aanvullend bestand 1: Figuur S2) dat deze cluster consequent alleen wordt gevonden in meren, reservoirs en rivieren, maar niet in de mariene habitat, wat suggereert dat het ten onrechte is aangeduid als een “mariene groep.”Een andere groep sequenties, aangeduid als JG30-KF-CM66, beschreven uit diverse omgevingen (uranium mijnbouw afval stapel, Bodem, Zoetwater, Zeewater kolom, en sediment), werd gevonden bij voorkeur worden verspreid in rivieren (met name de rivier Amazone) dan meren (Fig. 1a, b), zij het bij zeer lage abundanties (maximaal 1% van de totale prokaryoten). Soortgelijke abundanties werden gevonden in de Brakke Kaspische Zee (diepte 40 m en 150 m) (aanvullend bestand 1: Figuur S2).

we konden echter geen ondersteuning vinden voor de aanwezigheid van de SAR202-cluster of zijn zoetwaterzuster clade CL500-9 in alle onderzochte zoetwatermetagenomische datasets. In mariene en brak habitats, SAR202 zijn bijna uitsluitend te vinden in de donkere afotische lagen, waar ze goed voor 30% van de prokaryotische gemeenschap . Als er SAR202-gerelateerde clades in zoetwaterhabitats zijn, zijn ze zeker niet erg overvloedig of zijn ze misschien niet afkomstig uit de waterkolom in het oorspronkelijke rapport (aanvullend bestand 1: Figuur S1). Hoewel de relatieve abundantie van Chloroflexi in de zoetwater-epilimnie veel lager is dan in de diepere wateren, herbergt zij een rijke en wijdverbreide verzameling nieuwe groepen.Uit deze waarnemingen blijkt ook dat in de hier onderzochte aquatische milieus (zoetwater, brak en zeewater) de diversiteit van Chloroflexi-vertegenwoordigers wezenlijk verschillend is, waarbij het zoetwatermilieu een fylogenetisch meer gevarieerde groep groepen herbergt dan de brak of de zee. Bovendien zijn er duidelijke aanwijzingen voor de aanwezigheid van alleen zoetwatergroepen (bijv., SL56) en mariene en brakwatergroepen (SAR202), waarbij wordt herhaald dat zoutgehalte een barrière is voor microbiële habitatovergangen tussen zoetwater-en mariene ecosystemen . Het is geenszins een onoverkomelijke barrière als relatief recente overgangen van zoetwater naar zee (bijvoorbeeld het zoetwater ” Ca. Methylopumilus spp.”en marine om43 ) en omgekeerd (marine Pelagibacter en zoetwater ld12) zijn beide voorgesteld. Echter, het is waarschijnlijk dat de groepen gevonden in brakke omgevingen misschien gewoon beter “voorbereid” voor meer succesvolle uitstapjes. We vinden wel voorbeelden van groepen die aanwezig zijn in zoetwater en brakke metagenomen (JG30-KF-CM66 en CL500-11).

de belangrijkste zoetwaterchloroflexi-vertegenwoordigers

het automatisch samenvoegen van Chloroflexi-gerelateerde contigs uit assemblages van elk 57 datasets die tot 14 verschillende omgevingen behoren (28 meren/reservoirs, 26 rivieren en 3 Brakke datasets) resulteerde in segregatie van 102 MAGs (metagenoom-geassembleerde genomen) in totaal (aanvullend dossier 2: Tabel S1). Fylogenomic analyse van MAGs met 30% of meer volledigheid (n = 53) toont aan dat een opmerkelijk hoge diversiteit van MAGs werd teruggevonden uit vrijwel alle bekende Chloroflexi klassen (Fig. 2). Vijfendertig MAGs vormden drie afzonderlijke nieuwe klassengroepen zonder beschikbare culturele vertegenwoordigers (SL56, TK10 en JG30-KF-CM66).

terwijl fluorescentie in situ hybridisatie gevolgd door gekatalyseerde reporter depositie (CARD-FISH) hoge aantallen CL500-11 cellen in Lake Zurich epilimnion detecteerde tijdens partiële mixis in de winter, werden piek abundantie niveaus altijd gevonden in diepere zones, in beide Lake Zurich (tot 11% van alle prokaryoten; Fig. 3a) en het Biwa-meer (tot 14%; Fig. 3d). CL500-11 abundantie gecorreleerd negatief met zowel temperatuur en chlorofyl a concentratie (aanvullend dossier 1: Figuur S3). In de monsters van het Řimov-Reservoir lag CL500-11 echter onder de detectiegrens (< 0,18%), wat erop wijst dat deze relatief ondiepe habitat (maximale diepte 43 m) geen voorkeursniche vormt voor deze groep bacteriën (aanvullend dossier 1: Figuur S4). CL500-11 cellen zijn eerder gevisualiseerd door Kaart-vissen en getoond om grote, gebogen cellen te zijn . Vergelijkbare vormen en maten werden waargenomen in VISMONSTERS uit het Meer van Zürich met gemiddelde lengtes van 0,92 µm (bereik 0,4–1,6 µm; n = 277) en breedtes van 0,28 µm (bereik 0,19–0,39 µm). Analyse van de celvolumes (mediaan 0.06 µm3) en biomassa voor deze cluster in vergelijking met alle prokaryoten (Fig. 3c) suggereert een extreem hoge bijdrage van de CL500-11 populatie aan de totale microbiële biomassa. Hun biomassa aan abundantie verhouding is bijna 2, dat wil zeggen, bij 10% abundantie vertegenwoordigen zij bijna 20% van de totale prokaryotische biomassa, die een opmerkelijke aanpassing aan de relatief oligotrofe diepe hypolimnion aangeeft, die hoge populaties zelfs met hun grote celgrootte bereiken.

we hebben 11 MAGs (10 freshwaters, 1 brakwater) teruggevonden voor CL500-11 in totaal. Alle vier de MAGs van Lake Biwa uit verschillende maanden vormen een enkele soort. De twee soorten uit het Meer van Zürich lijken echter het hele jaar door naast elkaar te bestaan (Maart, Mei en November) met één soort die samen met het eerder beschreven MAG uit Lake Michigan vertakt is (CL500-11-LM) en de andere soorten die ook nauw vertegenwoordigd zijn in de Brakke Kaspische Zee (> 95% ANI) en soortgelijke metagenomische fragmentrecryptiepatronen (Fig. 2 en 4c). Wij stellen het kandidaatgeslacht Profundisolitarius voor (Pro. fun. di. so. li. ta’ri.us. L. adj. profundus deep; L. adj. solitarius alleen; N. L. masc. n. Profundisolitarius een kluizenaar uit de diepte) binnen Candidatus Profundisolitariaceae fam. nov. voor de CL500-11 cluster (klasse Anaerolinea).

aan de andere kant is de SL56-groep de dominante afstamming in het Řimov-Reservoir (maximaal 1.1%), zowel door 16S rRNA en CARD-FISH analyses (Fig. 1 en 3). Maximale abundanties werden bijna altijd gevonden op ongeveer 5-20 m bij temperaturen van ca. 15 °C, wat suggereert dat deze groep voornamelijk epilimnetisch is (aanvullend dossier 1: figuren S3 en S4). Dit gebied van de waterkolom (thermocline) heeft, naast een temperatuurgradiënt, ook aanzienlijk lagere lichtintensiteit in vergelijking met oppervlaktelagen. In de gelaagde zomerprofielen van het Meer van Zürich vallen de maximale abundanties van de SL56 samen met de aan het licht aangepaste cyanobacterium Planktothrix rubescens op ongeveer 13 m diepte (aanvullend dossier 1: Figuur S3). SL56 cellen zijn staafvormig en langwerpig (gemiddelde lengte = 0,68 ± 0,25 µm; gemiddelde breedte = 0,35 ± 0,09 µm; n = 6; Fig. 3e). Voor zover wij weten, is dit het eerste rapport van een zoetwater-specifieke Chloroflexi groep die lijkt te gedijen in het epilimnion.

in totaal werden 14 Mag ‘ s teruggevonden voor sl56-cluster (1 met 16S rRNA) en vormen een klasse-lineage, die aanzienlijk afwijkt van alle bekende Chloroflexi (Fig. 2). Hun enige familielid is een enkel MAG (Chloroflexi CSP1-4) beschreven uit aquifer sediment . De 16S rRNA clade waaraan de CSP1-4 naar verluidt verbonden is Gitt-GS-136, en de meerderheid van de sequenties in deze clade zijn afkomstig van ofwel bodem of riviersedimenten (informatie van SILVA taxonomie). Nochtans, waren wij niet in staat om om het even welke 16S rRNA opeenvolging (gedeeltelijke of Volledige) in de beschikbare genoomopeenvolging van CSP1-4 te ontdekken. De dichtstbijzijnde clade (in de 16S rRNA taxonomie) naar Gitt-GS-136 en SL56 is KD4-96, waarvan de sequenties werden verkregen uit dezelfde habitats (zie aanvullend bestand 1: Figuur S1B). Bovendien komen alle bekende 16S rRNA-sequenties uit de SL56-groep alleen uit zoetwater (Lake Gatun, Lake Zurich, enz.). Bij elkaar genomen blijkt dat de dichtste fylogenetische verwanten van de zoetwaterlijn SL56 bodem-of sedimenthabitats bewonen.

SL56 MAGs werden gereconstrueerd vanuit geografisch afgelegen locaties (Europa, Noord-en Zuid-Amerika, Fig. 2), en ten minste negen verschillende soorten konden worden gedetecteerd (Ani, Fig. 1). Er werden geen MAGs verkregen uit Lake Biwa monsters, maar drie 16S rRNA sequentie werden teruggevonden in unbinned contigs. De gereconstrueerde MAGs worden wereldwijd verspreid langs zoetwater datasets van epilimnion (geen gedetecteerd in de diepe hypolimnion) (Fig. 4 en aanvullend bestand 1: Figuur S6). Er werden geen SL56 MAGs gereconstrueerd uit de Kaspische Zee, en geen van de teruggevonden genomen werd gerekruteerd uit Brakke metagenomen. Wij stellen het kandidaatgeslacht Limnocylindrus voor (Lim. no. cy. lin’drus.Gr. fem. n. limne a lake; L. masc. n. cylindrus a cilinder; N. L. masc. n. Limnocylindrus een cilinder uit een meer) binnen Limnocylindraceae fam. nov., Limnocylindrales ord.nov., en Limnocylindria classis. nov. voor de Chloroflexi SL56 cluster.

tk10 16S rRNA sequenties werden gevonden bij de hoogste abundanties in Lake Biwa hypolimnion monsters (maximaal ca. 2%) (Fig. 1 bis, c). Cellen waren eivormig met een geschatte lengte van 1,08 ± 0,1 µm en breedte van 0,84 ± 0,09 µm (n = 12; Fig. 3e). Een coherente cluster van negen MAGs (drie met 16S rRNA aanvullend bestand 1: Figuur S1) van geografisch afgelegen locaties (Europa, Azië en Noord-Amerika) werd teruggevonden. Deze Opmerkelijk kosmopolitische organismen die gedijen in diepere lagen van het meer zijn niet erg divers (ANI-waarden > 95%). Deze schijnbare lage diversiteit kan een gevolg zijn van een zeer gespecialiseerde niche of, wat waarschijnlijker is, een resultaat van een relatief recente overgang naar zoet water, vergelijkbaar met ” Ca. Fonsibacter ” (Ld12 Alphaproteobacteria). Geen 16S rRNA-vertegenwoordigers werden met vertrouwen gedetecteerd in mariene of Brakke metagenomen, hoewel sommige 16S rRNA-sequenties van SILVA-database zijn verkregen uit mariene sedimenten en waterkolom (aanvullend bestand 1: Figuur S1). Naaste verwanten van 16S rRNA lijken uit de bodem of uit sedimentmonsters te komen, wat suggereert dat dit hun oorspronkelijke habitat zou kunnen zijn. Interessant, is de tk10 cluster ook diepe vertakking, slechts na SL56 en CSP1-4 in de phylogenetic boom van Chloroflexi in het algemeen, en alle andere Chloroflexi vertegenwoordigers (MAGs of isolate genomen) schijnen om van een vertakking verschillend aan beide van deze af te stammen. Wij stellen het kandidaatgeslacht Umbricyclops voor (Um.bri.cy ” clops. L. fem. N. umbra shadow; L. masc. n.cyclops (uit Gr. Rond oog; Cyclops) een cyclops; N. L. masc. n. Umbricyclops a round-eye living in The Shadow) binnen Umbricyclopaceae fam. nov., Umbricyclopales ord.nov., en Umbricyclopia classis nov. voor deze groep organismen.

CARD-FISH resultaten tonen aan dat JG30-KF-CM66 cellen bolvormig zijn met een geschatte diameter van 0,56 µm (± 0,15 µm; n = 8; Fig. 3e); er werden echter zeer lage percentages (< 0,28%) waargenomen voor JG30-KF-CM66 in het meer van Zürich en het Diepteprofiel van het Řimovbekken (aanvullend dossier 1: figuren S3 en S4). We verkregen 12 MAGs, meestal uit de diepe waterkolom (acht brak, vier zoetwater), een met een bijna volledige 16S sequentie, die een nieuwe klasse-niveau Lijn in de fylogenomic analyse vormde (Fig. 1). De naaste verwanten van deze MAGs zijn marine SAR202 en Dehalococcoidea (Fig. 1 en aanvullend bestand 1: Figuur S1). Binnen deze cluster kunnen verschillende groepen brak-en zoetwaterblaadjes worden onderscheiden. Wij stellen het kandidaatgeslacht Bathosphaera voor (Ba.tho.sphae ‘ Ra. Gram. adj. bathos deep; L. fem. n. sphaera a sphere; N. L. fem. n. Bathosphaera een coccoïde bacterie die in de diepte leeft) binnen Bathosphaeraceae fam. nov., Bathosphaerales ord.nov. en Bathosphaeria classis. nov. voor de Chloroflexi jg30-KF-CM66 cluster.

we hebben ook MAGs teruggewonnen in de klassen Chloroflexie (vier MAGs) en Caldilineae (twee MAGs) (Fig. 1). Chloroflexia MAGs waren verwant aan mesophilic Oscillochloris trichoides DG-6 in suborde Chloroflexineae (een MAG) en drie andere MAGs aan Kouleothrix aurantiaca in de kouleotrichaceae fam. nov. het vormen van een nieuwe suborde waarvoor wij de naam Kouleothrichniae suborde voorstellen. nov. Geen van deze magazijnen toont enige significante fragment rekrutering behalve hun plaats van herkomst. Nog eens 14 MAGs uit het Kaspische deel van de SAR202 cluster die hier niet verder besproken zullen worden zoals ze al beschreven zijn .

bijdrage van zoetwaterchloroflexi in het functioneren van het ecosysteem

metabole inzichten in de gereconstrueerde Chloroflexi MAGs (volledigheid ≥ 30%) wijzen op een voornamelijk heterotrofe levensstijl die in sommige groepen wordt versterkt door lichtgestuurde energieopwekking via rhodopsinen (CL500-11, Chloroflexales, SL56 en TK10) of aërobe anoxygene fototrofie (Chloroflexales). De MAGs van elke cluster bevatten noodzakelijke genen voor centrale koolhydraatmetabolisme met inbegrip van glycolyse, gluconeogenese, en tricarbonzuurcyclus. De belangrijkste genen voor assimilatory sulfate reduction (3′-phosphoadenosine 5 ‘ – phosphosulfate (PAPS) synthase en sulfate adenylyltransferase) waren afwezig in de meeste MAGs die het gebruik van exogene verminderde zwavelverbindingen suggereren . Denitrificatie genen (nitraat reductase/nitriet oxidoreductase alfa en beta subeenheden en nitriet reductase) werden gevonden in Tk10 MAGs, maar de daaropvolgende enzymen verantwoordelijk voor de productie van moleculaire stikstof waren afwezig.

in aquatische milieus zijn Thaumarchaeota en cyanobacteriën de belangrijkste bron van cobalamine en zijn corrinoïde precursoren voor de grote gemeenschap van auxotrofen of die weinigen die in staat zijn tot berging . De novo synthese van cobalamin heeft een hoge metabolische kosten, en de zwarte koningin hypothese is naar voren gebracht als verklaring voor redenen waarom slechts een paar leden van de Gemeenschap zijn productie ondernemen . Geen van de gereconstrueerde Chloroflexi MAGs codeert vanaf nul noodzakelijke genen voor de biosynthese van de corrinering, en transporters met hoge affiniteit cobalamine (BtuBFCD) of andere vermoedelijke corrinoïde (DET1174-DET1176) ontbraken ook wat een gevolg kan zijn van onvolledigheid van het genoom of het gebruik van een onbeschreven transporter. Echter, niet al deze organismen lijken auxotrofen te zijn omdat de MAGs van de jg30-KF-CM66 cluster genen coderen voor cobinamide naar cobalamine bergingsroute die geïmporteerde corrinoïden gebruikt samen met tussenproducten uit de riboflavine biosynthese route om cobalamine te synthetiseren . ZH-chloor-G3 MAG bevat een bijna volledige cobalamine berging (alleen ontbrekende CobC) en riboflavine biosynthese route (aanvullend bestand 3: Tabel S2).

Flagellaire assemblagegenen waren aanwezig in verschillende MAGs van CL500-11-en TK10-clusters (Fig. 1 en aanvullend dossier 3: Tabel S2). Echter, de l-en P-ring componenten die flagella verankeren aan de buitenmembraan ontbraken in alle flagellated MAGs en referentie Chloroflexi genomen (bijvoorbeeld, Thermomicrobium, Sphaerobacter). Bovendien codeerden MAGs en referentiechloroflexi-genomen geen genen voor LPS-biosynthese en werden geen secretiesystemen, behalve Sec en Tat, gedetecteerd (type I-IV secretiesystemen die verankerd zijn in het buitenmembraan zijn afwezig) (aanvullend dossier 3: Tabel S2). Samen genomen, versterken de vergelijkende genomics van beschikbare Chloroflexi genomen gevolgtrekkingen dat terwijl elektronenmicrographs twee elektronendichte lagen in de meeste leden van dit phylum voorstellen, Chloroflexi waarschijnlijk één enkel lipidemembraan (monoderm) eerder dan twee (diderms) bezitten .

rhodopsine-achtige sequenties werden herkend in 18 MAGs van deze studie van vertegenwoordigers van CL500-11, Chloroflexie, SL56 en TK10 die fylogenetisch het dichtst bij xanthorhodopsinen staan (aanvullend dossier 1: Figuur S8A en B), en zijn afgestemd op groen licht te absorberen vergelijkbaar met andere zoetwater en kust rhodopsins (aanvullend bestand 1: Figuur S8C). Verschillende MAGs coderen genen voor carotenoïde biosynthese waardoor de mogelijkheid van een carotenoïde antenne die het kenmerk van xanthorhodopsinen . Van de residuen die betrokken zijn bij de binding van salinixanthine (de overheersende carotenoïde van Salinibacter ruber), vonden we een verrassend hoog aantal geconserveerd (10 identieke van de 12 in ten minste één rhodopsin-sequentie) (aanvullend dossier 1: Figuur S8D), wat suggereert dat een carotenoïde antenne kan worden gebonden, waardoor ten minste een aantal van deze sequenties bonafide xanthorhodopsinen.

zelfs vertegenwoordigers van CL500-11 en TK10 die voornamelijk worden gevonden in het hypolimnion tijdens de stratificatie zijn in staat tot fototrofie; zij kunnen echter mogelijk toegang krijgen tot de fotische zone tijdens wintermixis en vroege voorjaarsmixis. Naast rhodopsine-gebaseerde fotoheterotrofie, hebben we ook MAGs van de klasse Chloroflexie die coderen genen voor photosystem type II reactie centrum eiwitten L en M (pufL en pufM), bacteriochlorofyl, en carotenoïde biosynthese. De pufM-gensequenties cluster samen met andere Chloroflexi-gerelateerde pufM-sequenties (aanvullend dossier 1: Figuur S9). Echter, geen bewijs voor koolstof fixatie, via de 3-hydroxypropionaat route of de Calvin-Benson cyclus werd gevonden in een fotosysteem met MAG die een gevolg van MAG onvolledigheid zou kunnen zijn. Het kan ook zijn dat dit aërobe anoxygene fototrophs die geen koolstof, b .v. zoetwater Gemmatimonadetes en Acidobacteria (beide aërobe) fixeren.Evolutionaire geschiedenis van pelagische Chloroflexi

uit de fylogenomische analyses blijkt dat de verzameling van vertegenwoordigers van het in dit werk teruggevonden phylum Chloroflexi, samen met de bestaande genoomsequenties uit isolaten en MAGs, slechts een gedeeltelijke schets geeft van de complexe evolutionaire geschiedenis van het phylum in het algemeen. Bijvoorbeeld, de meest uiteenlopende takken “Ca. Limnocylindria “(sl56 cluster) en ” Ca. Umbricyclopia ” (tk10 cluster) hebben praktisch geen nauwe verwantschap, afgezien van een aquifer sediment MAG (verwant aan “Ca. Limnocylindria”). Echter, verwante 16S rRNA klonen zijn teruggevonden uit de bodem / sedimenten voor beide groepen, wat suggereert overgangen naar een pelagische levensstijl (aanvullend bestand 1: Figuur S1B).

rekening houdend met de afwezigheid van verwante mariene 16S rRNA-sequenties voor deze groepen, naast hun ondetecteerbaarheid in mariene metagenomische datasets suggereert ook een voorouder van bodem/sediment in plaats van de zoute omgeving. Hoewel de mogelijkheid van een mariene oorsprong niet formeel kan worden uitgesloten, lijkt de richting van een overgang van bodem/sediment naar zoetwaterkolommen het meest waarschijnlijk. Bovendien, gezien het feit dat “Ca. Limnocylindria ” en ” Ca. Umbricyclopia ” diverge voorafgaand aan de divergentie van de klassen Dehalococcoidea en marine SAR202 (klasse “Ca. Monstramaria”), de enige ecologisch relevante mariene Chloroflexi die tot nu toe bekend is (de eerste in mariene sedimenten en de laatste in diepe oceaanwaterkolom), is het waarschijnlijk dat voorouderlijke Chloroflexi is ontstaan in een bodem/sediment habitat. Het succes van marine SAR202 in de diepe oceanen is opmerkelijk; het is de meest verspreide, misschien numeriek meest voorkomende Chloroflexi-groep op de planeet. Echter, sommige 16S rRNA sequenties van zijn naaste verwanten, Dehalococcoidea, zijn ook teruggevonden uit zoetwatersedimenten, hoewel de overgrote meerderheid lijkt te zijn van diepe mariene sedimenten (beide anoxische habitats).