In deze video zult u zien hoe u de chroom release assay uitvoert en het cytotoxische potentieel van de effectorcellen bepaalt.
immuuncellen zijn verantwoordelijk voor het identificeren en verwijderen van potentieel schadelijke cellen, zoals met kanker of virus geïnfecteerde cellen, uit het lichaam, dat een integraal onderdeel is van de immuunrespons. Verscheidene immune cellen, zoals T-cellen en NK-cellen, bezitten een bezit als cytotoxisch potentieel wordt bekend, dat de capaciteit is om doelcellen te identificeren en proteã NEN af te scheiden die eiwitdegradatie, lysis, en dood van die doelcellen veroorzaken. Het kwantificeren van cytotoxisch potentieel is essentieel voor het meten van immune celactivering en potentie, en de Chromium release assay wordt algemeen gebruikt voor dit doel.
deze methode stelt gebruikers in staat de cytoxiciteit te vergelijken die wordt veroorzaakt door specifieke soorten immuuncellen onder verschillende omstandigheden, wat waardevol is voor het bestuderen van kankerimmunotherapie en immuniteitsgerelateerde ziekten. Om te beginnen worden de doelcellen, zoals kankercellen, geïncubeerd met een radioactieve isotoop, chroom 51, die door de cellen wordt opgenomen. Vervolgens worden deze radio geëtiketteerde cellen Geco-cultured met de geïsoleerde immune cellen van belang, ook wel de effectorcellen genoemd, in een ronde bodem, 96-well plaat om interactie tussen de twee celtypes te vergemakkelijken.
de algemene opzet van de test omvat incubatie van een specifiek aantal doelcellen met verschillende concentraties van de immuuncellen, samen met passende controles. De co-cultuur staat de effectorcellen toe om apoptosis en lysis in de doelcellen te veroorzaken, resulterend in de versie van intracellular chromium 51 in het supernatant. Vervolgens, op een vooraf geoptimaliseerd tijdstip, wordt het supernatant met het vrijgekomen chroom geoogst uit alle putten. Chroom 51, radioactief, ondergaat spontaan radioactief verval om gammastraling uit te zenden. De gammastraling in de supernatanten van alle putjes in de testplaat vertegenwoordigen een kwantificeerbare output van de lysis van de doelcellen. Dit wordt gemeten gebruikend een gamma teller, die dan wordt gebruikt om het cytotoxic potentieel van de immune cellen te bepalen.
om te beginnen worden de doelcellen, de humane melanoomcellijn WM793 in dit voorbeeld, bereid tot een eencellige suspensie. Om dit te doen, Verwijder eerst de media uit de weefselkweekkolf en was de cellen met vijf milliliter van 1X PBS. Decanteer de PBS en voeg vervolgens een milliliter trypsine toe aan de plaat gedurende ongeveer twee minuten. Tik zachtjes op de kolf om de cellen los te maken van het kolfoppervlak en voeg vervolgens vijf milliliter RPMI-media toe aan de kolf. Pipetteer de media op en neer om de cellen te verzamelen en voeg deze suspensie toe aan een 15 milliliter conische buis.
plaats de buis gedurende 5 minuten bij 1200 toeren per minuut in de centrifuge. Verwijder vervolgens de media uit de buis om ervoor te zorgen dat de celpellet niet wordt verstoord. Tik zachtjes tegen de onderkant van de buis om de celpellet te verstoren en voeg 10 milliliter media toe aan de buis. Pipetteer vervolgens voorzichtig de media op en neer om de cellen in suspensie te brengen. Bepaal vervolgens de celconcentratie met behulp van een hemocytometer en breng twee milliliter van de oorspronkelijke celsuspensie naar een nieuwe 15 milliliter conische buis. Plaats de buis in een centrifuge en pellet de cellen bij 1200 toeren per minuut gedurende vijf minuten. Giet na centrifugeren de overtollige media uit de buis in een afvalcontainer. Vortex de tube kort om de celpellet te resuspenderen in het kleine volume medium dat overblijft.
vervolgens, bereid u voor om Chroom 51 te gebruiken door te verhuizen naar een laboratoriumruimte speciaal voor deze specifieke radioactiviteit. Er moet voldoende lood afscherming voor veilige opslag en gebruik van de chroom 51 tijdens alle stappen, evenals de juiste bewegwijzering aan te geven waar monsters met chroom 51 worden bewaard. Een geigerteller uitgerust met een pancake sonde is ook nodig om te dienen in de ruimte voor mogelijke verontreiniging.
eenmaal ingesteld voor het juiste gebruik van radioactiviteit, voeg 100 microcuries chroom 51 rechtstreeks toe aan de doelcelsuspensie. Voeg vervolgens een klein stukje radioactief tape toe aan de buis om aan te geven dat het monster en de buis nu radioactief zijn. Plaats de buis in een 37 graden Celsius incubator met een loden schild en incubeer gedurende een uur, waarbij de buis elke 15 tot 20 minuten wordt geraakt.
terwijl de doelcellen labelen, bereid een eencellige suspensie van effectorcellen. In dit voorbeeld, werden menselijke perifere bloed mono nucleaire cellen, of Pdmc ‘ s, geïsoleerd uit volbloed door standaard dichtheid gradiënt centrifugatie tot een concentratie van 5 keer 10 tot de 6e. Breng deze effectorcelsuspensie over in een wegwerpreagensreservoir en voeg vervolgens 200 microliters van deze suspensie toe in elk putje van rij B in een 96-wells ronde bodemplaat. Voeg vervolgens 100 microliters RPMI toe aan elk putje in rij C tot en met G van de plaat.Begin nu met het uitvoeren van seriële verdunningen van de PBMC ‘ s om een reeks aantallen effectorcellen te verkrijgen door eerst 100 microliters van de cellen in de putjes in rij B te verwijderen en dit toe te voegen aan Rij C. vervolgens verdun de effectorcellen verder door 100 microliters cellen van rij C over te brengen naar Rij D. ga verder met de seriële verdunning. Zodra rij G is bereikt, verplaats 100 microliters uit de putten om een eindvolume van 100 microliters in elk putje in die rij te verlaten. Voeg vervolgens 100 microliters weefselkweekmedium toe aan de putten in Rij A om te dienen als controle voor de spontane afgifte van chroom 51 Uit de doelcellen, aangezien er geen effectorcellen aan deze rij moeten worden toegevoegd. Plaats dan een plaat in een incubator van 37 graden celsius totdat de doelcellen klaar zijn om te worden toegevoegd.
verwijder na de incubatieperiode de doelcellen uit de incubator en was met 5 milliliter FBS om eventuele overmaat chroom te verwijderen 51. Plaats vervolgens de buis in een daarvoor bestemde centrifuge en draai gedurende 5 minuten bij 1200 toeren per minuut. Verwijder de radioactieve FBS wash in een geschikte afvalcontainer en herhaal de wasstap door de pellet te resuspenderen in een verse 5 milliliter FBS. Plaats de buis in een daarvoor bestemde centrifuge en draai de cellen opnieuw bij 1200 toeren per minuut gedurende 5 minuten. Verwijder de tweede wasbeurt en controleer de pellet met behulp van een geigerteller op geïncorporeerde radioactiviteit. Resuspendeer tot slot de pellet in 10 milliliter volledig medium en giet de chroom 51 gelabeld, doelcel suspensie in een wegwerp reagensreservoir. Voeg dan 100 microliters van deze geëtiketteerde doelcellen toe aan elke put van de 96-well effectorcelplaat. Voeg vervolgens 100 microliters van 1% NP-40 in water toe aan de putten in rij H om alle doelcellen in elke rij te lyseren. Deze putten zullen worden gebruikt als een controle om de totale tellingen per minuut, of cpm te bepalen.
nu de plaat klaar is, zet u het deksel vast door een klein stukje tape aan elke kant van de plaat toe te voegen en plaats een stuk radioactief tape op het deksel om aan te geven dat het chroom 51 bevat. Plaats de plaat vervolgens in een centrifuge die is gemarkeerd om radioactieve monsters te behandelen. Als er slechts één experimentele plaat wordt gebruikt, voeg dan een balansplaat toe aan de centrifuge. Stel de centrifuge in op 1200 toeren per minuut en breng de plaat op snelheid. Eenmaal op de snelheid, stop de machine. Haal de plaat uit de centrifuge. Plaats de plaat vervolgens in een incubator van 37 graden celsius met een klein stukje loden afscherming over de plaat voor extra veiligheid. Incubeer 16 uur om de doelcellen te laten lyse.
Verwijder aan het einde van de incubatietijd voorzichtig het plakband rond de rand van de plaat en verwijder het deksel. Plaats vervolgens het oogstframe op de plaat om te bevestigen dat de kleine filterschijven op hun plaats zijn voor elk van de katoenen pluggen. Druk nu langzaam en voorzichtig de katoenen pluggen in de putten. Laat na ongeveer tien seconden de druk op de katoenen pluggen los en breng de katoenen pluggen over op buisstrips. Plaats elk van deze buizen in een secundaire FACS buis. Tot slot, laad de FACS buizen op een gamma teller en loop de monsters om de hoeveelheid chroom 51 vrijgegeven in elke voorwaarde te kwantificeren. Noteer zorgvuldig de volgorde waarin de buizen in de toonbank werden geladen.
hier werden niet-gestimuleerde PBMC ’s toegevoegd aan de eerste 3 rijstroken en CPG gestimuleerde Pmbc’ s werden toegevoegd aan rijstroken 4 tot en met 6. In dit voorbeeld werden de tellingen per minuut in de cellen van een spreadsheet ingevoerd op dezelfde manier als de monsters in de oorspronkelijke plaat werden gelegd en de gemiddelden van de drievoudsverhoudingen werden berekend. Voor de eerste voorwaarde werden cellen A1, A2 en A3 bijvoorbeeld gemiddeld in cel I3. Zodra de gemiddelden worden bepaald, kan het percentage van specifieke lysis voor elke voorwaarde worden berekend met behulp van deze formule. Bijvoorbeeld, om het percentagespecifieke lysis voor de niet-gepimuleerde cellen te berekenen die een verhouding van 50 tot 1 effectorcellen aan doelcellen hadden, werd de spontane CPM, die in dit voorbeeld 1164,67 is, afgetrokken van de experimentele CPM, 1129. 67. Dit getal kan dan worden gedeeld door het verschil tussen de maximale CPM en de spontane CPM, en vervolgens vermenigvuldigd met 100 om het percentage specifieke lysis te geven. Dit wordt vervolgens berekend voor elke aandoening. Deze gegevens kunnen dan worden grafisch weergegeven OM vergelijking van de verhouding E tot T met de percentagespecifieke lysis voor zowel de niet-gestimuleerde PBMC ’s als de CPG-gestimuleerde PBMC’ s te tonen. In dit voorbeeld, doodde effectorcellen die met CPG effectiever worden bevorderd doelcellen aangezien de verhouding van effectorcellen aan doelcellen toenam. Deze toename werd niet waargenomen bij de niet-gepimuleerde PBMC ‘ s, wat erop wijst dat CPG-stimulatie noodzakelijk is voor de waargenomen toename van de doelcellysis.