- Abstrakt
- 1. Inledning
- 2. Material och metoder
- 2.1. Kemikalier
- 2.2. Framställning av 70% etanol extrakt av kinesiska örter
- 2.3. Mätning av Nitritproduktion
- 2.4. Analys av Cellviabilitet
- 2.5. Statistisk analys
- 3. Resultat
- 3.1. Effekt av örtextrakt på ingen produktion och celltillväxt
- 3.2. Korrelation mellan antiinflammatorisk styrka och TCM-egenskaper hos örter
- 3.3. Korrelation mellan cellskyddande effekt och TCM-egenskaper hos örter
- 4. Diskussion
- intressekonflikt
- bekräftelser
Abstrakt
inducerbart kväveoxidsyntas (iNOS) är den främsta bidragsgivaren till överproduktionen av kväveoxid och dess hämmare har aktivt sökts som effektiva antiinflammatoriska medel. I denna studie förberedde vi 70% etanolextrakt från 81 kinesiska örter. Dessa extrakt utvärderades därefter för deras effekt på kväveoxidproduktion (NO) och celltillväxt i LPS/IFN-costimulerade och ostimulerade murina makrofag RAW264.7-celler genom Griess-reaktion och MTT-analys. Extrakt av Daphne genkwa Sieb.et Zucc, Caesalpinia sappan L., Iles pubescens Hook.et Arn, Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl, Zingiber officinale Rosc, Inula japonica Thunb., och Ligusticum chuanxiong Hort hämmade markant ingen produktion (hämning > 90% vid 100 g/mL). Bland aktiva extrakt (hämning > 50% vid 100 g / mL), Rubia cordifolia L., Glycyrrhiza glabra L., Iles pubescens Hook.et Arn, Nigella glandulifera Freyn et Sint, Pueraria lobata (Willd.) Ohwi och Scutellaria barbata D. Don visade ingen cytotoxicitet för ostimulerade RAW246.7-celler samtidigt som tillväxten av LPS/IFN-costimulerade celler ökade. Genom att analysera korrelationen mellan deras aktiviteter och deras traditionella kinesiska medicin (TCM) egenskaper visade örter med skarp smak potent antiinflammatorisk förmåga. Vår studie ger en serie potentiella antiinflammatoriska örter och föreslår att örter med skarp smak är kandidater för effektiva antiinflammatoriska medel.
1. Inledning
Inflammation är en självskyddsmekanism som syftar till att ta bort skadliga stimuli, inklusive skadade celler, irriterande eller patogener, och börja sårreparationsprocessen. Emellertid inducerar inflammation ibland ytterligare inflammation, vilket leder till självförstärkande kronisk inflammation som kan orsaka allvarlig cellskada och vävnadsskada . Kronisk inflammation har kopplats till en mängd olika sjukdomar som ateroskleros , Alzheimers sjukdom , diabetes och karcinogenes .
kväveoxid (NO), som huvudsakligen genereras av inducerbart kväveoxidsyntas (iNOS) under inflammatoriska tillstånd , spelar en nyckelroll i varje steg i de patologiska processerna under inflammation . Selektiva inhibitorer av iNOS har visat sig vara både antiinflammatoriska och vävnadsskyddande i olika inflammatoriska djurmodeller och betraktas således som lovande medel för behandling av inflammatoriska sjukdomar. Högt uttryck av iNOS kan ofta detekteras i humana tumörer, vilket stöder uppfattningen att kronisk inflammation är aktivt involverad i Tumörprogression . Faktum är att icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel (NSAID), inklusive aspirin och tolfenaminsyra , för närvarande används för både cancerförebyggande och behandling .
en mängd olika naturliga produkter har rapporterats ha antiinflammatoriska och anticancereffekter i experimentella djurmodeller. Till exempel har curcumin visat sig hämma cyklooxygenas 2 (COX2) uttryck och är faktiskt i klinisk användning som ett kemopreventionsmedel . På grund av löften i curcumin har omfattande ansträngningar också utövats för att identifiera föreningar som kan rikta sig mot inflammatoriska mediatorer . En ny studie av Liao et al. undersökte den potentiella sambandet mellan antioxidationsförmåga och egenskaperna hos traditionell kinesisk medicin (TCM) i 45 vanliga kinesiska örter, där antioxidationsförmåga hos kinesiska örter visade sig vara korrelerad med deras smakegenskaper . Deras resultat är mycket uppmuntrande eftersom det indikerar att effektiva antiinflammatoriska medel potentiellt kan identifieras från kinesiska örter baserat på deras TCM-egenskaper.
i vårt försök att identifiera effektiva antiinflammatoriska medel beredde vi 70% etanolextrakt från 81 kinesiska örter och testade därefter deras förmåga att undertrycka ingen produktion i murina makrofager RAW264.7-celler som costimulerades med LPS och IFNy. Dessutom analyserade vi också korrelationen mellan antiinflammatorisk kapacitet och TCM-egenskaper bland dessa örter. Vi drar slutsatsen att örter med skarp smak är de starkaste i sin antiinflammatoriska förmåga.
2. Material och metoder
2.1. Kemikalier
IFNy köptes från EMD Millpore Chemicals (Billerica, MA, USA). Bovint serumalbumin (BSA), lipopolysackarid (LPS, E. coli 0111: B4), N-(1-naftyl)-etylendiamindihydroklorid (L-NIL), 3-(4, 5-dimetyltiazol-2-yl)-2, 5-difenyltetrazolium (MTT), naftyletylendiamin, sulfanilamidoch natriumbikarbonat erhölls alla från Sigma-Aldrich Co (St.Louis, MO, USA). RPMI 1640 och trypsin-EDTA köptes från Life Technologies (Grand Island, NY, USA). Fetalt bovint serum (FBS) köptes från Hyclone Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA).
2.2. Framställning av 70% etanol extrakt av kinesiska örter
alla örter erhölls från YANG He Tang och Kangqiao Co (Shanghai, Kina). Alla 81 örter som valts för vår studie har rapporterats eller föreslagits ha potentiella antiinflammatoriska aktiviteter av antingen TCM-litteratur eller aktuella farmakologiska rapporter. Botanisk identifiering av dessa örter utfördes av Shanghai Institute for Food and Drug Control (SIFDC). För att förbereda etanolextrakt skiv 100 g av varje torkad örter och extraherades med 1 liter 70% etanol vid C i tre gånger. Erhållna etanolextrakt indunstades under reducerat tryck vid temperatur C och lagrades vid C. extrakt löstes med DMSO före användning.
2.3. Mätning av Nitritproduktion
RAW264.7-celler pläterades i 96-brunnsplattor (5 msk 103 celler per brunn) för över natten och fylldes sedan på med FBS-fritt medium för 10 h följt av tillsats av 100 kg/mL örttextrakt i varje brunn. Celler costimulerades med 100 ng/mL LPS och 10 U/mL IFNy för 24 h, och media uppsamlades sedan och analyserades för mängden nitrit, en stabil oxidativ metabolit och trogen ingen indikator, genom Griess-reaktionen som tidigare beskrivits . För att göra det blandades 100 oktyl Griess-reagens (0,1% naftyletylendiamin och 1% sulfanilamid i 5% fosforsyra) med 100 oktyl uppsamlat medium i en 96-brunnsplatta. Blandningen inkuberades i 10 minuter vid rumstemperatur och avlästes sedan vid 540 nm. Mängden nitrit beräknades baserat på en standardkurva genererad med natriumnitrit. Procent hämning i ingen produktion beräknades med formeln {/(nitrit utan örtextrakt)} 100.
2.4. Analys av Cellviabilitet
cellviabilitet bestämdes genom MTT-analys som tidigare beskrivits . I korthet inkuberades raw264. 7-celler med MTT (5 mg/mL i fosfatbuffrad saltlösning, pH = 7, 4) under 4 h. formad MTT formazan solubiliserades med 50 occl av 0, 01 M HCl-buffert innehållande 10% SDS och 5% isobutanol. Celltillväxt bestämdes genom att läsa plattor vid 570 nm i en mikroplattläsare. Cellens livskraft i kontrollgruppen anses vara 100%.
2.5. Statistisk analys
riktningen och storleken på korrelationen mellan variabler gjordes med hjälp av analys av t-test. värden mindre än 0,05 ansågs statistiskt signifikanta ().
3. Resultat
3.1. Effekt av örtextrakt på ingen produktion och celltillväxt
med hjälp av Griess-analys analyserade vi etanolextrakt av 81 örter för deras antiinflammatoriska aktivitet. Ett brett spektrum av hämning i ingen produktion observerades med dessa extrakt (Tabell 1). Extrakt av 7 örter blockerade över 90% ingen produktion i LPS / IFNy-stimulerad RAW264.7 celler (Tabell 1). Bland de extrakt som framkallade över 50% hämning i ingen produktion, Rubia cordifolia L., Glycyrrhiza glabra L., Iles pubescens Hook.et Arn, Nigella glandulifera Freyn et Sint, Pueraria lobata (Willd.) Ohwi och Scutellaria barbata D. Don visade ingen cytotoxicitet mot ostimulerade RAW264.7-celler medan signifikant ökade livskraften hos LPS/IFNy-stimulerade celler (Tabell 1). I alla fall, Daphne genkwa Sieb.et Zucc, som har den starkaste hämmande effekten på NO-produktion, var måttligt giftigt för RAW264.7-celler (Tabell 1).
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
HR: herb; RT: rot; ST: stam; LF: blad; TW: kvist; FL: blomma; FR: frukt; SD: frö; SC: sclerotium; HW: kärnved; SR: stam och rot; PE: pericarp. bPercent hämning av ingen produktion: Griess-reaktion utfördes för att mäta produktionen av nitrit i LPS/IFNy-stimulerad RAW264.7-celler i frånvaro eller närvaro av 100 g/mL örttextrakt. ccell-tillväxt: MTT utfördes för att mäta celltillväxt. Tillväxttakten för kontroll (ingen ört extraktbehandling) ansågs vara 100%. Dno produktion: Griess reaktion användes för att mäta mängden nitrit i ostimulerad RAW264.7 celler i frånvaro och närvaro av 100 g/mL ört extrakt. ecell cytotoxicitet: MTT-analys utfördes för att bestämma cellcytotoxicitet hos ostimulerade RAW264.7-celler behandlade med örttextrakt. Obehandlad grupp betraktades som 100%. fPercent utbyte av extrakt erhållet från 70% etanolutvinning av varje 100 g torr ört. gPercent hämning av iNOS-aktivitet vid testkoncentrationen på 50 M. |
3.2. Korrelation mellan antiinflammatorisk styrka och TCM-egenskaper hos örter
analysera TCM-egenskaperna hos 10 örter som visar den starkaste hämmande effekten på ingen produktion i LPS/IFNy-stimulerad RAW264.7-celler, fann vi att de flesta av dem är i kategorierna bitter eller skarp smak, varm natur och lung-eller levermeridianfördelningar (Tabell 2). För att korrelera TCM-egenskaperna med antiinflammatorisk effekt i dessa örter kategoriserade vi TCM-egenskaper hos dessa örter som kunde avskaffa 50% av ingen produktion i LPS/IFNy-stimulerad RAW264.7-celler. Tabell 3 visade att örter med större antiinflammatorisk effekt fördelades i en signifikant högre procentandel hos de som karakteriserades som bittra/skarpa smaker, varm natur och lever/lungmeridianfördelningar. Dessa resultat tyder på att antiinflammatoriska örter kan ha gemensamma egenskaper som är av skarp/bitter smak, varm natur och lung/lever meridian.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
baserat på kinesisk Farmakopoeia (2010). bbaserat på kinesiska Materia Medica (1998). |
|
3.3. Korrelation mellan cellskyddande effekt och TCM-egenskaper hos örter
kronisk inflammation leder ofta till cellskador och sålunda söks medel som kan avskräcka denna process aktivt. Genom att undersöka 21 örter med TCM-karaktäristiken för skarp smak observerade vi att, under costimulering av LPS och IFNy, RAW264.7 celler behandlade med dessa örtextrakt visade 90% ökning av cellens livskraft (Tabell 4). Dessutom gav örter med skarp smak också den högsta graden av cellskydd i LPS/IFNy-stimulerade celler i jämförelse med örter med andra smaker (Figur 1).
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
örter med över 90% cellskyddande förmåga i stimulerade RAW264.7-celler. bHerbs med förmåga att öka över 90% cellproliferation i vilande RAW264.7-celler. |
jämförelse av örter med cellviabilitet i olika smaker. Genomsnitt av cellviabilitet av LPS / IFNy-stimulerad RAW264.7 celler behandlade med örter som tillhör olika smak. .
4. Diskussion
överproduktion av NO på grund av det förhöjda iNOS-uttrycket har övertygande kopplats till patogenesen av kronisk inflammation och cancer . Därför bör medel som selektivt kan undertrycka iNOS-genererad NO-produktion vara effektiva för att behandla kronisk inflammation och för att förebygga cancer. Faktum är att nya studier visar att selektiva iNOS-hämmare L-NIL och 1400 W är terapeutiskt effektiva som antiinflammation och cancer mot cancer .
makrofager spelar en avgörande roll för att reglera inflammation. Makrofager aktiveras av yttre stimuli och aktiverade makrofager producerar olika inflammatoriska mediatorer såsom NO och reaktiva syrearter. Kinesiska örter är de rika källorna för antiinflammatoriska medel och ansträngningar har gjorts för att identifiera effektiva komponenter i dessa örter . Genom att utnyttja den väletablerade RAW264.7-cellmodellen utvärderade vi 81 örttextrakt för deras hämmande effekt på LPS/IFNy-inducerad NO-produktion. Bland dem är extraktet av Daphne genkwa Sieb.et Zucc visade den starkaste hämmande effekten på NO-produktion. Beståndsdelarna isolerade från Daphne genkwa Sieb.et Zucc rapporterades tidigare för att provocera cytotoxisk effekt på olika tumörcellinjer och för att undertrycka utväxt av transplanterad mussarkom S180 hos möss . Vi spekulerar i att anticancereffekten av Daphne genkwa Sieb.et Zucc kan vara funktionellt associerad med dess antiinflammatoriska förmåga. I vår studie fann vi att Rubia cordifolia L. och flera andra minskar LPS / IFNy-inducerad ingen produktion utan att orsaka signifikant cytotoxicitet för RAW264.7-celler. Dessa örter kan således vara lovande kandidater som effektiva läkemedel för att kontrollera inflammation och cancer. Även om det för närvarande är oklart hur dessa extrakt blockerar LPS/IFN-inducerad ingen produktion i RAW264.7-celler, konstaterandet att Mollugin undertrycker det inflammatoriska svaret genom att blockera Janus Kinas-signalomvandlare och aktivatorer av transkriptionssignalväg implicerar att örter kan rikta sig mot de olika stegen i signalkaskaden som medierar LPS/IFN-inducerad ingen produktion för att utöva sina antiinflammatoriska Roller.
baserat på teorin om TCM klassificerade vi dessa 81 örter enligt olika smaker (skarp, söt, sur, bitter, astringent, salt eller mild), natur (kall, kall, måttlig, varm eller varm) och meridianfördelningar (lever, njure, hjärta, mjälte etc.). Vår studie visade att TCM—karaktäristiken för smak korrelerade mycket bra med styrkan att hämma ingen produktion-skarp smak är den starkaste, bitter är något svagare än skarp, söta smaker är mellanliggande och astringent, salt, mild eller sur smak är svag eller inte effektiv. TCM-egenskaper för natur och meridianfördelning är också förknippade med styrkan att hämma ingen produktion. Till exempel har högre andel örter med förmågan att blockera ingen produktion egenskaperna hos varm natur. Egenskaper hos lever-och lungmeridianer är de viktigaste meridianfördelningarna som finns i örter vars extrakt kan blockera 50% av ingen produktion. Sammantaget resonerar vi att TCM-egenskaper kan vara mycket användbara för att styra sökandet efter effektiva antiinflammatoriska medel i kinesiska örter.
TCM-karakteristik är ett systematiskt uttryck för den distinkta egenskapen som framkallas av Materia Medica hos människor. Teori om smaker i TCM utgör kärnkontexten för kinesisk örtanvändningsvägledning. I TCM är karaktäristiken för smak kombinationen av både verklig smak och botande effekt. Enligt Shen Nong Ben Cao Jing( Shennongs klassiker av Material Medica), en viktig TCM-bok som först skrivits om kinesisk växtbaserad smak och egendomsteori, kan skarp smak, som är relaterad till lungmeridian, sprida den inre värmen med sudorifics som i sin tur främjar cirkulationen av Qi och blod. Örter med skarp smak har faktiskt använts i tusen år i Kina för att stärka blodcirkulationen och bryta Qi-blocket. Det faktum att inflammationsrelaterade sjukdomar är förknippade med symptom på Qi och blodblockering kan förklara effektiviteten hos örter med skarp smak för att undertrycka inflammation.
vår studie var begränsad till undersökningen av 81 örtextrakt på deras effekt på LPS/IFNy-inducerad NO-produktion och celltillväxt i makrofag RAW264.7-celler. Resultaten från denna studie stöder ändå en nära koppling mellan modern farmakologi/biomedicinsk vetenskap och TCM-teori. TCM-teorin utvecklades baserat på tusen års klinisk erfarenhet, och den materiella och farmakologiska grunden för TCM återstår att förklaras av den moderna biomedicinska vetenskapen. Vi tror att denna studie har bidragit till detta mål.
intressekonflikt
författarna förklarar att det inte finns någon intressekonflikt när det gäller publiceringen av detta dokument.
bekräftelser
detta arbete stöddes av National Science and Technology Major Project från Ministeriet för vetenskap och teknik i Kina (2009zx09311-003), Young Scientists Fund of the National Natural Science Foundation of China (81001666), innovationsprogram för Shanghai Municipal Education Commission (13yz048) och Stiftelsen för Shanghai Education Commission för enastående unga lärare på universitetet (SZY07029).