Planten en de ziekteverwekker
De gemeenschappelijke ice plant (Mesembryanthemum crystallinum L.) werd geteeld in een kas zoals beschreven door Kuźniak et al. . Na het verschijnen van het 3e bladpaar werd één set planten geïrrigeerd met 0,4 M NaCl om Crassulacean acid Metabolism (CAM planten) op te wekken, terwijl een andere set verder werd geïrrigeerd met leidingwater (C3 planten). Na 12 dagen werd de inductie van CAM in de met NaCl behandelde planten bevestigd door het meten van de daglijke ∆ malaat in het bladcelsap. Daarna werden bladeren van de 2de bladparen van C3 – en CAMPLANTEN ingeënt met Botrytis cinerea volgens Kuźniak et al. .
chlorofyl een fluorescentie beeldvorming
de miniversie van een Imaging-PAM chlorofyl Fluorometer M-serie (Walz, Effeltrich, Duitsland) uitgerust met een bladhouder werd gebruikt voor het registreren van fluorescentie beeldvorming (Imaging-PAM M-serie chlorofyl Fluorometer) . De fluorometer is een bladclipmodel voor veldtoepassingen. De bladhouder zorgt ervoor dat het blad horizontaal op de lichtbron wordt gehouden om heterogene belichting over verschillende delen van het bladmonster te voorkomen. De bemonsteringsposities werden gekozen om gelijk verdeeld te zijn langs de hoofdnerf, maar ze verschilden voor elk blad vanwege zijn grootte en morfologie, en de techniek van het plaatsen van bladeren in de houder. Om de effecten van biotische stress alleen te identificeren, en om de introductie van artefacten in chlorofyl fluorescentie meetprocedure te voorkomen, werden geen referentiemarkeringen die bladbeeldverwijzing mogelijk maakten op de bladeren toegepast. Chlorofyl fluorescentie van gewone bladeren van ijsplanten werd verkregen door het definiëren van interessegebied (Aoi-tool) met behulp van de Imaging Win 2.41 a-software.
met de Imaging-PAM werd de huidige fluorescentieopbrengst (Ft) continu gemonitord. Planten waren donker aangepast voor 20 minuten. Bij toepassing van een verzadigingspuls werden de Dark-level fluorescentieopbrengst (Ft = F0) en de maximale fluorescentieopbrengst (Fm) bepaald. De maximale KWANTUMOPBRENGST van PSII, Fv/Fm, en de kwantumopbrengsten van gereguleerde en niet-gereguleerde energiedissipatie in PSII, Y(NPQ) en Y(NO) werden afgebeeld. Fv / Fm werd berekend volgens de vergelijking: Fv / Fm = (Fm − F0) Fm. Y (NPQ) werd berekend volgens Kramer et al. door de formule: 1-Y (II) − 1/(NPQ + 1 + qL (Fm/F0-1)). Y (NO) werd berekend volgens Kramer et al. met de vergelijking: Y (NO) = 1/. Het beeldvormingsproces levert pseudo-kleurenbeelden (geïndexeerde kleurmodus) op van biologisch materiaal met een resolutie van 640 × 480 pixels die overeenkomen met het gezichtsveld van de fysische Afmetingen 32 × 24 mm.
de geïnfecteerde bladeren van de C3-en CAM-planten werden genomen voor een fluorescentieanalyse van chl op het tijdstip van inoculatie en 3, 6, 9, 24, 32, 48, 54 en 72 uur na inenting. Chl a fluorescentie werd gemeten voor aangehechte bladeren van het 2de bladpaar van drie C3-en CAMPLANTEN afkomstig van twee onafhankelijke herhalingen van de plantenteelt. Elk voor analyse genomen blad werd op elk tijdstip afzonderlijk gescreend (Fig. 1). Representatieve reeksen van negen beelden (één voor elk tijdpunt) van Y(NO), Y(NPQ) en Fv/Fm voor C3-en CAM-ijsplanten zijn verwerkt om veranderingen van deze parameters te meten in een geselecteerd gebied van bladschijf dat in de loop van de tijd is gescreend. Ter vergelijking, y(NO), Y (NPQ) en Fv/Fm gemiddelde gegevens van de volledige bladgebieden afgebeeld in Fig. 2 werden verkregen. De resultaten van de beelduitlijning en de meting van de spatiotemporale pattering van biotische stressvermeerdering in bladeren met de voorgestelde methode werden geïllustreerd op Y(NO) beelden.
Voorbeeldbeelden van kwantumopbrengst van niet-gereguleerde energiedissipatie in gemeenschappelijke bladeren van de ijsplant. Is van toepassing op PSII Y(NO) van C3 (a–d) en CAM (e–h) fluorescentieparameters. Het blad fragment bevat de plaats van pathogeen inoculatie en symptomen van stress propagatie
voorbeeld afbeelding van C3 gemeenschappelijk ijs plant blad met geselecteerde gebieden van belang. Handmatig gemaakte selecties in firmware editor dekken de geïnfecteerde (1), symptomless (2) evenals de hoofdnerf gebieden (3)
Beelduitlijning
het mechanisme van het verzamelen van PAM-beeldgegevens in de tijdsequentie resulteert in het verplaatsen van het bladfragment in het gezichtsveld tussen individuele tijdpunten (Fig. 1). Door de verandering van bladpositie hebben kenmerken als de hoofdnerf en de inoculatieplaatsen zowel een andere locatie als een andere oriëntatie. Bovendien kan het effect van het herschalen worden waargenomen. Om de stressvoortplanting goed te kunnen beoordelen, moeten de weergavevelden onderling worden gesynchroniseerd, uitgaande van een van hen als referentie (vast) Beeld en de rest van de beelden die moeten worden uitgelijnd met de vaste. Deze benadering is gekend in medische weergave als beeldregistratie . De basisregistratietaak voor de fluorescentiebeelden is het vinden van de ‘gelijkenis’ transformatie bestaande uit passende rotatie, vertaling en schaling. Het buigen en vouwen van bladeren door stress komt alleen voor in lokale regio ‘ s met enkele afbeeldingen en zijn van ondergeschikt belang voor de Globale beelduitlijning. Ze kunnen worden gecompenseerd in het stadium van de registratie na verwerking door niet-lineaire transformaties zoals bijvoorbeeld dunne plaat, oppervlakte splines en demon mappings .
de fluorescentiebeelden worden genomen als een reeks opnamen in vooraf bepaalde tijdsintervallen van ongeveer hetzelfde bladgebied. De karakteristieke elementen van beschouwde stapel beelden vertegenwoordigen voornamelijk bladnerven. Ze zijn echter slecht te onderscheiden van de beeldinhoud als gevolg van beperkt contrast en kleur mode van PAM imaging. De gebieden van stress symptomen visueel domineren de inhoud kan veranderen tussen beelden in een enkele reeks. In een dergelijke situatie zou de automatische registratie mislukken.
de meest populaire, automatische state of art methoden zijn gebaseerd op de vergelijking van de beeldintensiteit met enkele correlatiemetingen (intensiteitsgebaseerde methoden) of vertrouwen op het zoeken in de vaste en bewegende beelden naar de overeenstemming tussen geselecteerde beeldfuncties zoals punten, lijnen en contouren (op functies gebaseerde methoden) . Geen van deze benaderingen staat voor correcte registratie van PAM fluorescentiebeelden van gemeenschappelijk ijs-plant toe, wat in de voorbeelden in aanvullende materialen (aanvullend dossier 1) is geverifieerd en getoond. De daar gepresenteerde resultaten bevestigen dat de reden voor mislukte automatische registraties is de sterke verduistering van beeldgebieden met behouden functies door dynamische veranderingen in de beeldinhoud veroorzaakt door infectie van het bladweefsel. Tests van de populaire methoden werden uitgevoerd door zowel de Registration Estimator in Matlab en in de Fiji-omgeving .
het algoritme van PAM-afbeeldingsregistratie is ontworpen in een Matlab-omgeving op basis van de set controlepunten die handmatig door een expert zijn geselecteerd. Om de overeenkomstige controlepunten in elke afbeelding in te stellen, werd de functie cpselect van het controlepunt selectiegereedschap van beeldverwerking Toolbox toegepast. Beelden werden bewerkt in paren, waaronder een vaste afbeelding en een bewegend beeld. Het eerste beeld verkregen net na pathogeen inenting werd aangenomen als een vast (referentie) beeld. Door middel van interactieve punt-mapping, kan de gebruiker niet alleen de zichtbare contouren van zenuwen wijzen, maar ook andere karakteristieke elementen zoals het injectiepunt, plaatsen langs de pathogeen propagatie evenals de meest zichtbare epidermale blaascellen (Fig. 3).
door de deskundige geselecteerde controlepunten. Voorbeeld Y (NO) afbeeldingen van een bladfragment van een kam gemeenschappelijke ijsplant: een vast (referentie) beeld, B bewegend beeld dat moet worden uitgelijnd met de vaste
meerdere paren van controlepunt locaties, zo breed mogelijk verspreid over het blad beeldoppervlak, zijn voldoende om de beelden van hetzelfde blad ruwweg beschouwd als een stijf lichaam goed uit te lijnen. Bredere verdeling van controlepunten verbetert de gevoeligheid van beeld matching, maar wordt beperkt door het beeld weergave veld bijgesneden na de uitlijning transformeren en door de mogelijkheid van nauwkeurige locatie van het geselecteerde punt op het bladblad. Met een dergelijke beelduitlijning werd de affiene transformatie uitgevoerd met behulp van de functie fitgeotrans opgenomen in beeldverwerking Toolbox. Deze transformatie is beperkt tot de ‘similarity’ versie (die alleen bestaat uit vertaling, rotatie en gelijkenis) omdat de scène in de PAM fluorometer niet gekanteld leek. Bewegende beelden werden afgestemd op de vaste afbeelding met behulp van de functie imwarp. Grafische illustratie van het registratiealgoritme is opgenomen in Fig. 4.
het blokdiagram van affine en optionele B-spline registratie toegepast op fluorescentie PAM beelden. \(\left\) – de vector van controlepunten in de vaste afbeelding, \(\left^{\left( k \right)}\)—de vector van controlepunten in K-th bewegende afbeelding, \(\left^{{\left( {k^{\prime } } \right)}}\)—de vector van controlepunten in K-th bewegende afbeelding na B-spline registratie
bladeren in verschillende stadia van infectie kunnen een oppervlak lokaal golvend of gerimpeld zoals in het gebied gemarkeerd in geanalyseerde PAM-fluorometer beelden (Fig. 5a, b), welke vorm kan mogelijk invloed hebben op de juiste analyse van de pathogeen propagatie fenomeen. Het betekent dat de affiene registratie methode die op geometrische transformatie wordt gebaseerd niet voldoende kan zijn om fluorescentie PAM beelden in sommige gevallen van bladeren met schijnbaar zichtbare niet-lineaire vervorming aan te passen. Daarom stellen de auteurs een tweetraps registratiemethode voor waarbij affiene rigide registratie wordt gevolgd door B-spline registratie die niet-lineaire vervormingen vermindert.
voorbeeld van affiene en B-spline registraties voor C3 gemeenschappelijke ijs plant blad afbeelding. a Het Y (NO) beeld na PAM acquiring, b het beeld na rigide affiene transformatie met de pijlen die interactief ingestelde verplaatsingsvectoren voorstellen gebruikt in de tweede fase van registratie en c uiteindelijke vorm na de controlepunt-gebaseerde B-spline registratie
de selectie van niet-rigide registratie type maakt gebruik van het feit dat gemeenschappelijke ijs plant bladeren vertegenwoordigen een beetje flexibel materiaal en kleine buigkrachten houden soepele veranderingen in een bladoppervlak profiel. De specificiteit van deze registratiewijziging is dat de vectoren van het beeldvervormingsveld interactief moeten worden opgelegd. Voor dit doel, een speciale Vector veld editor werd gekoppeld aan het algoritme. Slechts enkele verplaatsingsvectoren in het bewegende beeld moeten worden gespecificeerd om lokale en gladde vervormingen van een bladoppervlak te registreren zoals in Fig. 5b.
het B-spline Rueckert-algoritme werd geselecteerd voor de tweede fase van de registratie. De implementatie is beschikbaar in Matlab Central File Exchange als de Dirk-Jan Kroon Spline registratie Toolbox .
de B-spline registratieprocedure bestaat uit twee basisstappen:
-
initialisatie van een raster G van beeldpunten gelijkmatig verdeeld over het beeldoppervlak met alle vervormingsvectoren ingesteld op nul, en vervolgens berekenen van een dichte Vector veld T van vervormingen in het raster G door kubieke B-spline interpolatie van handmatig ingestelde controlepunt verplaatsingsvectoren \(\left^{\left (k \ right)}\). Zowel het raster als het bijbehorende transformatieveld T worden vervolgens iteratief verfijnd in 4 stappen om de afstand tussen netknooppunten te verminderen. De transformatie T wordt voorbereid door de functie point_registration van Spline registratie Toolbox.
-
B-spline transformatie van alle pixelposities en bi-kubieke interpolaties van kleurcomponenten in het bewegende (affine geregistreerde) beeld \(I_{m}\) volgens het spline gladgestreken vervormingsveld.
Beeldregistratienauwkeurigheid
de nauwkeurigheid van de voorgestelde beelduitlijning werd uitgevoerd met het root mean square (RMS) op afwijkingen van n = 15 controlepunten in Fig. 3. De verplaatsing van elk vast beeld controlepunt \(P_{i}\) geëvalueerd in een bewegend beeld voor de behuizing met en zonder de uitlijning werden geïllustreerd in Fig. 6 als de vectoren \(R_{i} P_{i} =\Delta r_{i}\) en \(Q_{i} P_{i} =\Delta q_{I}\) respectievelijk. De RMS-verplaatsingsfouten van alle controlepunten in één afbeelding voor de twee gevallen worden uitgedrukt in Eq. (1) als \(\Delta r_{\text{rms}}\) en \(\Delta q_{\text{rms}}\).
illustratie van de error assessment in affine registratie van PAM beelden. \(P_{i} ,\;i = 1, \ldots ,\N\)—controle punt in de vaste image \(I_{F}\), \(Q_{i}\)—het in kaart brengen van het controlepunt \(P_{i}\) in het bewegende beeld \(I_{M}\), \(R_{i}\)—het in kaart brengen van het controlepunt \(P_{\text{i}}\) na de registratie, \(R_{i} P_{i} =\Delta r_{i}\)—verplaatsing fout van het controlepunt \(P_{\text{i}}\) na registratie
Het percentage van de resterende verplaatsing \(\delta_{rms}\) na affiene type inschrijving, kan worden geëvalueerd per een beeld volgens Eq. (2).
de geëvalueerde affiene registratiefouten zijn vermeld in Tabel 1. De oorspronkelijke verplaatsingen \(\Delta q_ {\text{rms}}\) variërend van 3,01 tot 7,09 mm worden na de ‘similarity’ registratie gereduceerd tot het bereik van 0,45 tot 1,71 mm van \(\Delta r_{\text{rms}}\) voor de geteste C3 plant. Dezelfde parameters voor CAM plant zijn \(1.90 \ div 5.69\; {\text{mm}}\) voor \(\Delta q_{\text{rms}}\) en \(0.41 \div 1.53\;{\text{mm}}\) voor \(\Delta r_{\text{rms}}\). Wanneer \(\delta_{rms}\) zowel voor C3-als CAM-afbeeldingsreeksen gemiddeld is, is dit gelijk aan respectievelijk ongeveer 21% en 23%. De waarden van fluorescentieparameters Y (NO), Fv/Fm en NPQ verkregen uit foto ‘ s van ijsbladeren zonder registratie worden verkregen uit incompatibele delen van het blad en kunnen niet in aanmerking worden genomen (zie aanvullend dossier 2).
Voor extra B-spline registratie mapping wordt de transformatiefout gedefinieerd door twee componenten. De eerste is de postregistratie verplaatsing \(\Delta r_{i} = R_{i} P_{i}\) weergegeven in Fig. 7a, met \(R_{i}\) geëvalueerd in Eq. (3) als het middelpunt \(\bar{p}\) van het gebied \(A_{i}\).
waar \(I_{R} \left( p \right) \in \left\) geeft de intensiteit van de geregistreerde besturingselement punt beeld op de pixel p, \(\left| {A_{i} } \right|\)—de vervaging gebied regio. De fout tweede component wordt gedefinieerd door de standaardafwijking straal \(\rho_{I}\) van intensiteit verspreid rond elk controlepunt \(R_{i}\) zoals beschreven in Eq. (4).
waar \(\left\| \cdot \right\|\) geeft de Euclidische norm van de vector tussen de punten p en \(\bar{p}\) in het beeldvlak. Vervaging van het uitgelijnde controlepunt \(R_{i}\) lijkt te wijten aan het feit dat de niet-lineaire registratie bicubische interpolatie gebruikt in het eindige resolutieraster G. dit effect werd experimenteel gemeten door het uitvoeren van een bepaalde B-spline transformatie in het beeld opgebouwd uit witte controlepunten op een zwarte achtergrond. Tabel 2 bevat de magnitudes \(\Delta q_{i}\) van n = 9 voorbeeld verplaatsingsvectoren weergegeven in Fig. 5b. De magnitudes \(\Delta r_{I}\) van de vector mapping fouten na spline registratie worden gemeten tussen de gewenste vaste controlepunten \(P_{i}\) en de centroids van geregistreerde punten \(R_{i}\) geëvalueerd in het gebied \(A_{i}\). Alle geteste \(\Delta r_{i}\) waarden liggen onder de pixelresolutie gelijk aan\(50\;\upmu {\text{m}}\) en mogen worden verwaarloosd—afgerond op 0. Dit betekent nauwkeurige positionering van controlepunten door de spline-transformatie. De standaardafwijking \(\rho_{I}\) van vervaging in Tabel 2 na verdubbeling kan een maat zijn voor vervaging van controlepunten. Dan varieert het ongeveer van \(24\; {\text{to}}\; 63\; \ upmu {\text{m}}\) wat het equivalent is van een pixelvervaging. Aldus staat deze transformatie toe om lokaal de juiste vorm van Y(geen) veranderingen in een fluorescentiebeeld te herstellen.
verklaring van de fout in B-spline afbeelding registratie van PAM afbeeldingen. a de mismatch van controlepunt locatie mapping tijdens de registratie, B beeld intensiteit distributie van spline geregistreerd controlepunt, \(P_{i} ,\;i = 1, \ldots ,\N\)—controle punt in de vaste image \(I_{F}\), \(Q_{i}\)—het equivalent van control point \(P_{i}\) in het bewegende beeld \(I_{M}\), \(R_{i}\)—het in kaart brengen van het controlepunt \(P_{i}\) na de registratie, \(R_{i} P_{i} =\Delta r_{i}\)—verplaatsing fout maatregel van het in kaart brengen van de control point \(P_{i}\), \(A_{i}\)—wazig regio rond \(R_{i}\), wat neerkomt op het punt \(P_{i}\), \(\rho_{i}\) de standaarddeviatie straal van \(R_{i}\) vervagen
de meting van stressvoortplanting
de gegevensanalyse maakt gebruik van een speciaal editorprogramma voor het manipuleren van een stapel PAM-afbeeldingen na hun registratie. De hoofd editor functie maakt het tekenen van twee data acquisitie lijn secties \(L_{1} \;{\text{en}}\;L_{2}\) van gelijke lengte (Fig. 8), die kan worden waargenomen en beschikbaar zijn op elke afbeelding van de stack. In het overwogen experiment begint de eerste regel \(L_{1}\) op de plaats van inoculatie \(s_{1}\), waar de spanningsfactor wordt toegepast op het bladweefsel op tijdstip t, en moet ongeveer worden ingesteld in de richting van spanningsuitbreiding. De tweede lijn \(l_{2}\) wordt langs de hoofdnerf geplaatst waar de waargenomen stress-invloed in de tijd altijd beperkt was en fluorescentieparameters minimale veranderingen vertonen. De lijnen moeten volledig in de context van het beeld passen.
Meetgebieden in y (NO) afbeeldingen van gewone bladeren van ijsplanten na de computeruitlijning. De meetpunten geven aan: (1) mesofyl op de plaats van inoculatie, (2) mesofyl zonder letsel, (3) hoofdnerf in de buurt van de inoculatieplaats. De meetlijn (L1) is georiënteerd in de richting van spanningsvoortplanting binnen mesofyl en de lijn (L2) bevindt zich langs de hoofdnerf. Lijnen gestart op respectievelijk punten (S1) en (S2)
extra optie van punt-wise meting is mogelijk wanneer drie kleine verschillende cirkelvormige gebieden van de straal van 10 pixels interactief in het gezichtsveld worden geplaatst (Fig. 8). Ze moeten behoren tot de bladgebieden met verschillende fluorescentieparameter pattering in de tijd. Alle geregistreerde pixelwaarden worden binnen deze regio ‘ s gemiddeld.