microbiologie veterinară
identificarea Clostridium chauvoei în probele clinice de culturi din cazuri de picioare negre, prin intermediul PCR –
identificarea Clostridium chauvoei în zonele materialelor și cazurilor clinice până la turcoaz, este simptomatic de utilizare a PCR
St miyashiroi,* A. F. C. nassari; M. C. A., M. SOUZAI, J. B. CARVALHOI; J. E. B. AdegasII
Iinstituto Biol Inquiggico, s Inquigo Paulo, SP, Brasil
Iimato Grosso do Sul, Brasil
rezumat
C. Prezența chauvoei a fost detectată prin reacția în lanț a polimerazei (PCR) de la supernatantul de cultură în mediul de carne gătită din probe de ficat, mușchi și măduvă osoasă metatarsiană la șapte viței cu simptome de gambă neagră. Izolarea în condiții anaerobe a unei probe musculare a evidențiat Clostridium perfringens în cultura pură.
cuvinte cheie: Clostridium chauvoei; picior negru; bovin; PCR.
rezumat
prezența Clostridium chauvoei a fost detectată prin reacția PCR din cultura medie de carne gătită a probelor de ficat, mușchi și măduvă osoasă metatarsiană de la șapte viței afectați de carbuncle simptomatic. Izolarea unei probe musculare în condiții anaerobe a evidențiat Clostridium perfringens în cultura pură.
cuvinte cheie: Clostridium chauvoei, carbuncle simptomatic, bovin, PCR.
Clostridium spp este unul dintre genurile care cuprind grupul de bacterii anaerobe de importanță medicală și economică considerabilă. Clostridioza este denumirea generală dată unei varietăți de boli cauzate de bacteriile acestui gen, care pot apărea în orice parte a corpului care oferă condiții pentru dezvoltarea lor cu producerea de toxine în consecință în timpul multiplicării (1).
Clostridium chauvoei este agentul cauzal al edemului negru și malign la bovine, ovine și alte rumegătoare (4). Piciorul negru la bovine este o infecție endogenă netraumatică și o proporție considerabilă de bovine poate adăposti C. chauvoei în ficatul lor. Animalele afectate sunt anorectice, deprimate, febrile și lame (un membru lateral), prezentând o umflare fierbinte, dureroasă, care devine rece, edematoasă cu crepitație. Moartea este observată în decurs de 12 până la 48 de ore. Acest agent pare să aibă o preferință pentru mușchii mari (coapsă, diafragmă și inimă), care la necropsie sunt întunecați, roșii, uscați și spongioși (11). Simptomele asemănătoare cu piciorul negru pot fi,de asemenea,cauzate de Clostridium septicum, C. novyi, C. perfringens sau C. sordellii. Într-un studiu recent privind poziția filogenetică a C. chauvoei și C. septicum pe secvențele genei ARNr 16S (rrs), a fost determinată o similitudine de 99,3% între genele rrs ale C. chauvoei și C. septicum care se reflectă și la nivel fenotipic (7,8).
în timp ce diagnosticul prezuntiv al edemului negru și malign depinde de constatările clinice și patologice, confirmarea bolii se găsește de obicei prin izolarea și identificarea organismului, cum ar fi producerea de toxine și metodele imunologice (9,13). Cu toate acestea, aceste metode de diagnostic sunt consumatoare de timp și laborioase. În plus, metodele imunologice pot da rezultate echivoce, deoarece C. chauvoei și C. septicum au diferite antigene în comun (4).
amplificarea acidului Nucleic a unei regiuni țintă specifice a genomului bacterian prin reacția în lanț a polimerazei (PCR) a fost utilizată pe scară largă în scopuri de detectare și diagnosticare (15). Capacitatea PCR de a amplifica ADN-ul în mod specific din numărul redus de bacterii, precum și simplitatea, rapiditatea și reproductibilitatea acestuia, oferă avantaje față de metodele convenționale de identificare și a fost de fapt utilizată pentru identificarea multor specii de Clostridium, inclusiv C. chauvoei în culturi pure și în probe clinice (5,7,12,14). Un diagnostic precis al piciorului negru este, prin urmare, adesea dificil. Diagnosticul Standard se bazează pe un test imunofluorescent și pe criterii morfologice.
în această lucrare descriem o metodă PCR bazată pe îmbogățirea prealabilă în mediu de carne gătită a probelor de la viței cu picior negru pentru identificarea C. chauvoei. Au fost analizate probe de ficat, mușchi și măduvă osoasă metatarsiană de la viței care au prezentat simptome ale picioarelor negre în toamna braziliană. Probele prelevate au fost de la șase viței dintr-un efectiv de animale din statul S. Paulo și un vițel din statul Mato Grosso do Sul (Tabelul 1). Toate aceste bovine au murit brusc și au prezentat crepitație musculară în membrul posterior.
macerat de probe de ficat și mușchi și tampoane de măduvă osoasă s-au inoculat în tuburi cu mediu de carne gătită (Difco XV) care chiar înainte a fost supus șocului termic (100 XTCC timp de 10 minute imediat răcit în apă curentă), apoi au fost incubate la 37 XTCC timp de 48 de ore. Zece microlitri de mediu de carne gătită au fost cultivați în agar de sânge de oaie 5% și incubați la 37 de ore de la 38 de ore în condiții anaerobe. Coloniile cu formă caracteristică, aspect, culoare și hemoliză au fost supuse colorării Gram pentru determinarea morfologică și a peretelui celular. Izolatele suspecte au fost supuse testelor de coagulare a catalazei, lecitinazei, gelatinazei, glucozei, lactozei și laptelui tumultuos pentru identificarea genului și speciilor bacteriene.
tehnica pe bază de tiocianat de guanidină (2) a fost realizată pentru extragerea ADN-ului din supernatant a tuburilor cu mediu de carne gătită. Un mL din fiecare tub a fost centrifugat la 13000 x g timp de 20 de minute, iar peleta a fost omogenizată în 200 de ect de tampon Tris-EDTA înainte de Protocolul de extracție. PCR Multiplex a fost realizat cu primeri proiectați pentru gena flagelin (fliC), descrisă de SASAKI și colab. (10), specific pentru Clostridium chauvoei și Clostridium septicum, care amplifică 535 de perechi de baze (bp) și, respectiv, 294 bp. Grundul înainte FlaF este comun atât pentru specii, cât și pentru FlachR și FlaseR sunt grundurile inverse pentru C. chauvoei și, respectiv, C. septicum. Amplificarea ADN-ului a fost efectuată într – un volum total de 50 oktql, cu 200 oktqm din fiecare dNTP, 5 oktql 10x tampon de reacție, 2,5 mM MgCl2, 30 pmol din fiecare primer (FlaF – 5′ AGAATAAACAGAA GCTGGAGATG 3′ , FlachR – 5′ TACTAGCAGCATCAAAT GTACC 3′ și Flase R-5′ TTTATTGAATTGTGTTTGTGAAG 3′), 1,25 u Taq polimerază și 10 ilqq de ADN. Pentru amplificare, s-au folosit treizeci de cicluri împărțite în trei faze, după cum urmează: denaturare la 94 CENTICC timp de 60 de secunde, hibridizare la 56 CENTICC timp de 60 de secunde și extensie la 72 CENTICC timp de 60 de secunde. C. chauvoei IB 1559 și C. septicum 10518 (tulpinile Instituto Biol Ecquxgico) au fost utilizate ca martor pozitiv PCR, iar proba musculară de la o vacă normală a fost utilizată ca martor negativ PCR.
PCR a fost, de asemenea, aplicat direct din probe clinice (ficat, mușchi și măduvă osoasă) folosind aceleași protocoale de extracție și amplificare a ADN-ului citate mai sus. Amplificările au fost efectuate într-un Cicler termic Peltier-100 (cercetare MJ), iar analiza produselor amplificate a fost efectuată prin electroforeză în gel de agaroză 1,3% colorat cu bromură de etidiu.
pata Gram de carne gătită mediu inoculat cu probele suspecte au prezentat tije gram-pozitive mici cu spori subterminali în majoritatea probelor (ficat 1, mușchi 1,2 și 7 și măduvă osoasă 3,4 și 5), dincolo de altele. Cu toate acestea, numai în proba muscle 7 a fost izolat Clostridium perfringens în cultură pură, și, nici o creștere a fost observată în celelalte plăci probe incubate în condiții anaerobe. PCR Multiplex din probele clinice nu a arătat nici un rezultat pozitiv nici pentru C. chauvoei sau C. septicum. Cu toate acestea, în reacția de la supernatant a mediului de carne gătită inoculat cu aceleași probe, șapte dintre ele au fost pozitive la C. chauvoei și negative la C. septicum (ficat 1, mușchi 1,2 și 7, măduvă osoasă 3,4 și 5), așa cum se vede în tabelul 1.
relația filogenetică strânsă dintre C. chauvoei și C. septicum este o reflectare moleculară a asemănării fenotipice a acestor organisme. C. chauvoei este relativ dificil de distins de C. septicum și, în plus, C. septicum poate provoca simptome foarte asemănătoare cu simptomele picioarelor negre (6,9).
GREGORY și colab. (3) a raportat apariția și tratamentul unui bovin cu picior negru cu doze mari de penicilină. Diagnosticul a fost realizat prin izolarea C. chauvoei dintr-un tampon din zona mionecrozei și inocularea cobaiilor pentru identificarea acesteia.
KUHNERT și colab. (7) a raportat un sistem pentru a distinge C. chauvoei și C. septicum, cu toate acestea, necesită restricționarea digestiei enzimatice a produselor PCR pentru identificarea definitivă a organismului din cauza diferenței mici în gena ARNr 16S a ambelor bacterii.
rezultatele noastre arată că reacția multiplex PCR bazată pe gena fliC (10) a fost eficientă pentru identificarea C. chauvoei din probele infectate natural cultivate în mediu de carne gătită, realizând tiocianat de guanidină pentru extracția ADN-ului și diferențierea acestei specii de C. septicum. Cu toate acestea, rezultatele PCR direct din probele de țesut au fost negative, probabil datorită numărului redus de microrganisme clostridiale sau a protocolului ineficient de extracție a ADN-ului.
izolarea C. chauvoei este foarte dificilă, deoarece necesită condiții anaerobe dure, iar exemplarele clinice sunt adesea contaminate cu alte bacterii anaerobe, inclusiv clostridia în sol, care cresc mai repede decât C. chauvoei într-un mediu de cultură (9). Cultura microbiologică a mușchiului 7 a evidențiat Clostridium perfringens izolat în cultură pură în condiții anaerobe. Această specie poate fi implicată și în cazurile de picioare negre și, în studiul de față, ar putea fi asociată cu C. chauvoei. Oricum, dacă s-ar fi aplicat doar Metode microbiologice în acest caz, diagnosticul picioarelor negre ar fi greșit sau incomplet. Vaccinurile clostridiale oferă un grad ridicat de imunitate împotriva bolilor clostridiale, iar atunci când diagnosticul este corect, boala poate fi ușor controlată. Pentru aceasta, probele clinice trebuie colectate corespunzător și supuse examinării de laborator. Odată ce toate bolile datorate clostridiei pot fi prevenite prin vaccinare, dacă problema continuă în ciuda vaccinării, diagnosticul trebuie să fie greșit. Mai mult, o descriere a cazului este de o importanță fundamentală pentru efectuarea analizei laboratoriale (1).
infecțiile cauzate de Clostridia microrganismele provoacă pierderi considerabile în producție, odată ce tratamentul este, în general, impracticabil. Controlul și prevenirea trebuie să cuprindă măsuri adecvate de manipulare și vaccinare sistematică a efectivului, deoarece animalele sunt în contact permanent cu agenții și factorii care vor putea dezlega bolile.
detectarea acidului nucleic al C. chauvoei din îmbogățirea prealabilă a probelor infectate natural în mediul de carne gătită a elucidat diagnosticul în aceste două focare braziliene de picior negru, care de obicei rămâne neconcludent din cauza limitării culturii microbiologice. În plus, datorită specificității ridicate a tehnicii PCR, a fost evitată angajarea cobaiilor pentru identificarea agentului.
1. Baldassi, L. (2005). Toxine clostridiale otrăvuri puternice, medicamente puternice. J. Venom. Anim. Toxicologic. Trop. Dis., 11(4), 391-411.
2. Boom, R.; Sol, C. J. A.; Salimans, M. M. M.; Jansen, C. L.; Werthein-Van-Dilen, P. M. E.; Noordaa Van Der J. (1990). Metodă rapidă și simplă pentru purificarea acizilor nucleici. J. Clin. Microbul., 28, 495-503.
3. Gregory, L.; Della Libera, A. M. M.; Birgel Junior, E. H.; Pogliani, F. C.; Birgel, D. B.; Benesi, F. J.; Miyashiro, S.; Baldassi, L. (2006). Carbuncle simptomatic: apariția, evoluția clinică și urmărirea recuperării bovinelor afectate de „manqueira”. Arq. Inst. Biol., 73(2), 243-246.
4. Hamaoka, T.; Terakado, N. (1994). Demonstrarea antigenelor comune pe suprafața celulară a Clostridium chauvoei și Clostridium septicum prin testul indirect de imunofluorescență. J. Vet. Med. Sci., 56, 371-373.
5. Kojima, a.; UIDA, i.; Sekiaki, t.; Sasaki, y.; Ogikubo, y.; Tamura, Y. (2001). Detectarea rapidă și identificarea Clostridium chauvoei prin PCR pe baza secvenței genei flagelinei. Veterinar. Microbul., 78, 363-371.
6. Kuhnert, P.; Capaul, S. E.; Nicolet, J.; Frey, J. (1996). Pozițiile filogenetice ale Clostridium chauvoei și Clostridium septicum pe baza secvențelor genei ARNr 16S. Int. J. Syst. Bact., 46(4), 1174-1176.
7. Kuhnert, P.; Krampe, m.; Capaul, S. E.; Frey, J.; Nicolet, J. (1997). Identificarea Clostridium chauvoei în culturi și material clinic din blackleg folosind PCR. Veterinar. Microbul., 51, 291-298.
8. Moussa, J. (1959). Formule antigenice pentru Clostridium septicum și Clostridium chauvoei.J. Path. Bac., 7, 341-350.
9. Sasaki, Y.; Kojima, A.; Aoki, Hiroshi; Ogikubo, Y.; Takikawa, N.; Tamura, Y. (2002). Analiza filogenetică și detectarea PCR a Clostridium chauvoei,Clostridium haemolyticum, Clostridium novyi tip A și B și Clostridium septicum pe baza genei flagelinei. Veterinar. Microbul., 86, 257-267.
10. Sasaki, Y.; Yamamoto, K.; Kojima, A.; Norimatsu, M.; Tamura, Y. (2000). Identificarea rapidă și diferențierea clostridiei patogene în gangrena gazoasă prin reacția în lanț a polimerazei pe baza regiunii distanțiere ADNR 16S-23S. Res. Vet. Sci., 69, 289-294.
11. Sippel, W. L. (1982). Diagnosticul bolilor Clostridiale. J. Am. Veterinar. Med. Conf., 161, 1299-1305.
12. Uzal, F. A.; Plumb, J. J.; Blackall, L. L.; Kelly, W. R. (1997). Detectarea Clostridium perfringens producând diferite toxine în faece de capre prin PCR. Let. Aplicație. Microbul., 25, 339-344.
13. Vanelli, S. A.; Uzal, F. A. (1996). Detectarea Clostridium septicum prin tehnica peroxidază-antiperoxidază (PAP), în țesuturi de ovine fixate cu formalină, parafină încorporată. Arch. Med. Veterinar., 28, 125-127.
14. Warren, A. L.; Uzal, F. L.; Blackall, L. L.; Kelly, W. R. (1998). Detectarea PCR a Clostridium perfringens tip D în țesuturi fixe de formalină, încorporate în parafină de capre și oi. Let. Aplicație. Microbul., 29, 15-19.
15. Whelen, a. c.; persing, d. h. (1996). Rolul amplificării și detectării acidului nucleic în laboratorul de Microbiologie Clinică. Ann. Rev. Microb., 50, 349-373.