- rezumat
- 1. Introducere
- 2. Materiale și metode
- 2.1. Produse chimice
- 2.2. Prepararea a 70% extracte de etanol din ierburi chinezești
- 2.3. Măsurarea producției de nitriți
- 2.4. Analiza viabilității celulare
- 2.5. Analiza statistică
- 3. Rezultate
- 3.1. Efectul extractelor din plante asupra producției și creșterii celulare
- 3.2. Corelația dintre potența antiinflamatorie și caracteristicile TCM ale plantelor
- 3.3. Corelația dintre efectul protector celular și caracteristicile TCM ale ierburilor
- 4. Discuție
- Conflict de interese
- mulțumiri
rezumat
inductibil oxid de azot sintaza (iNOS) este principalul contribuitor al supraproducției de oxid nitric și inhibitorii săi au fost căutați în mod activ ca agenți antiinflamatori eficienți. În acest studiu, am preparat 70% extracte de etanol din 81 de plante chinezești. Aceste extracte au fost evaluate ulterior pentru efectul lor asupra producției de oxid de azot (NO) și a creșterii celulare în celulele RAW264.7 macrofage murine costimulate și nestimulate LPS/IFN prin reacția Griess și testul MTT. Extracte de Daphne genkwa Sieb.et Zucc, Caesalpinia sappan L., Iles pubescens Hook.et Arn, Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl, Zingiber officinale Rosc, Inula japonica Thunb., și Ligusticum chuanxiong Hort a inhibat semnificativ producția de NO (inhibare > 90% la 100 g/mL). Dintre extractele active (inhibiție > 50% la 100 g/mL), Rubia cordifolia L., Glycyrrhiza glabra L., Iles pubescens Hook.et Arn, Nigella glandulifera Freyn et Sint, Pueraria lobata (Willd.) Ohwi și Scutellaria barbata D. Don nu au prezentat citotoxicitate la celulele raw246.7 nestimulate, crescând în același timp creșterea celulelor LPS/IFN-costimulate. Analizând corelația dintre activitățile lor și caracteristicile lor de Medicină Tradițională Chineză (TCM), ierburile cu aromă înțepătoare au prezentat o capacitate antiinflamatoare puternică. Studiul nostru oferă o serie de plante antiinflamatoare potențiale și sugerează că ierburile cu aromă înțepătoare sunt candidați la agenți antiinflamatori eficienți.
1. Introducere
inflamația este un mecanism de auto-protecție care vizează eliminarea stimulilor nocivi, inclusiv celulele deteriorate, iritanții sau agenții patogeni și începerea procesului de reparare a rănilor. Cu toate acestea, inflamația induce uneori inflamații suplimentare, ducând la auto-perpetuarea inflamației cronice care poate provoca leziuni celulare severe și leziuni tisulare . Inflamația cronică a fost legată de o mare varietate de boli , cum ar fi ateroscleroza , boala Alzheimer , diabetul și carcinogeneza .
oxidul Nitric (NO), care este generat în principal de sintaza de oxid nitric inductibil (iNOS) în condițiile inflamatorii , joacă un rol cheie în fiecare etapă a proceselor patologice în timpul inflamației . Inhibitorii selectivi ai iNOS s-au dovedit a fi atât antiinflamatori, cât și de protecție a țesuturilor în diferite modele animale inflamatorii și, prin urmare, sunt considerați agenți promițători pentru tratarea bolilor inflamatorii. Expresia ridicată a iNOS poate fi adesea detectată în tumorile umane, susținând ideea că inflamația cronică este implicată activ în progresia tumorii . De fapt, medicamentele antiinflamatoare nesteroidiene (AINS), inclusiv aspirina și acidul tolfenamic, sunt utilizate în prezent atât pentru prevenirea cancerului, cât și pentru tratament .
s-a raportat că o varietate de produse naturale au efecte antiinflamatorii și anticanceroase la modelele animale experimentale. De exemplu, curcumina s-a dovedit a inhiba expresia ciclooxigenazei 2 (COX2) și este de fapt utilizată clinic ca agent de chemoprevenție . Datorită promisiunilor din curcumină, s-au depus eforturi ample pentru a identifica compușii capabili să vizeze mediatorii inflamatori . Un studiu recent realizat de Liao și colab. a investigat asocierea potențială dintre capacitatea de antioxidare și Caracteristicile medicinei tradiționale chineze (TCM) în 45 de plante chinezești utilizate în mod obișnuit, în care capacitatea de antioxidare a plantelor chinezești sa dovedit a fi corelată cu caracteristicile lor de aromă . Descoperirile lor sunt foarte încurajatoare, deoarece indică faptul că agenții antiinflamatori eficienți pot fi identificați din plantele chinezești pe baza caracteristicilor lor TCM.
în efortul nostru de a identifica agenți antiinflamatori eficienți, am preparat 70% extracte de etanol din 81 de plante chinezești și ulterior le-am testat abilitățile de a suprima nicio producție în celulele macrofage murine RAW264.7 costimulate cu LPS și IFNy. Mai mult, am analizat și corelația dintre capacitatea antiinflamatorie și caracteristicile TCM dintre aceste plante medicinale. Concluzionăm că ierburile cu aromă înțepătoare sunt cele mai puternice în capacitatea lor antiinflamatoare.
2. Materiale și metode
2.1. Produse chimice
IFNy a fost achiziționat de la EMD Millpore Chemicals (Billerica, MA, SUA). Albumina serică bovină (BSA), lipopolizaharida (LPS, E. coli 0111: B4), diclorhidratul de N-(1-naftil)-etilendiamină (l-NIL), 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2, 5-difeniltetrazoliu (MTT), naftiletilendiamina, sulfanilamida și bicarbonatul de sodiu au fost obținute din Sigma-Aldrich Co (St.Louis, MO, Statele Unite ale Americii). RPMI 1640 și tripsin-EDTA au fost achiziționate de la Life Technologies (Grand Island, NY, SUA). Serul fetal bovin (FBS) a fost achiziționat de la Hyclone Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, SUA).
2.2. Prepararea a 70% extracte de etanol din ierburi chinezești
toate ierburile au fost obținute de la YANG He Tang și Kangqiao Co (Shanghai, China). Toate cele 81 de plante alese pentru studiul nostru au fost raportate sau sugerate să aibă potențiale activități antiinflamatorii fie prin literatura TCM, fie prin rapoartele farmacologice actuale. Identificarea botanică a acestor plante a fost efectuată de Institutul Shanghai pentru controlul alimentelor și drogurilor (SIFDC). Pentru a prepara extracte de etanol, 100 g din fiecare ierburi uscate au fost tăiate și extrase cu 1 L de etanol 70% la C de trei ori. Extractele de etanol obținute au fost evaporate sub presiune redusă la temperatura C și depozitate la C. extractele au fost dizolvate cu DMSO înainte de utilizare.
2.3. Măsurarea producției de nitriți
RAW264.celulele 7 au fost placate în plăci cu 96 de puțuri (5 103 celule pe godeu) pentru noapte și apoi reumplute cu mediu fără FBS timp de 10 ore, urmată de adăugarea a 100 de extracte de plante/ml în fiecare godeu. Celulele au fost costimulate cu 100 ng/mL LPS și 10 U / mL IFNy timp de 24 de ore, iar mediile au fost apoi colectate și analizate pentru cantitatea de nitrit, un metabolit oxidativ stabil și niciun indicator fidel, prin reacția Griess așa cum s-a descris anterior . Pentru a face acest lucru, s-au amestecat 100 unqql de reactiv Griess (0,1% naftil-etilendiamină și 1% sulfanilamidă în 5% acid fosforic) cu 100 unqql de mediu colectat într-o placă cu 96 de puțuri. Amestecul a fost incubat timp de 10 min la temperatura camerei și apoi citit la 540 nm. Cantitatea de nitrit a fost calculată pe baza unei curbe standard generate cu nitrit de sodiu. Inhibarea procentuală în nici o producție a fost calculată cu formula {/(nitrit fără extract de plante medicinale)} 100.
2.4. Analiza viabilității celulare
viabilitatea celulară a fost determinată prin testul MTT, așa cum s-a descris anterior . Pe scurt, celulele RAW264. 7 au fost incubate cu MTT (5 mg/mL în soluție salină tamponată cu fosfat, pH = 7,4) timp de 4 ore.FORMAZANUL MTT format a fost solubilizat cu 50 ecql de 0,01 m tampon HCl conținând 10% SDS și 5% izobutanol. Creșterea celulelor a fost determinată prin citirea plăcilor la 570 nm într-un cititor de microplăci. Viabilitatea celulară a grupului de control este considerată 100%.
2.5. Analiza statistică
direcția și magnitudinea corelației dintre variabile a fost realizată folosind analiza testului T. valorile mai mici de 0,05 au fost considerate semnificative statistic ().
3. Rezultate
3.1. Efectul extractelor din plante asupra producției și creșterii celulare
cu ajutorul testului Griess, am analizat extractele de etanol din 81 de plante medicinale pentru activitatea lor antiinflamatoare. Cu aceste extracte s-a observat o gamă largă de inhibiții în absența producției (Tabelul 1). Extractele de 7 plante au blocat peste 90% fără producție în RAW264 stimulat de LPS/IFNy.7 celule (Tabelul 1). Printre extractele care au determinat o inhibare de peste 50% în absența producției, Rubia cordifolia L., Glycyrrhiza glabra L., Iles pubescens Hook.et Arn, Nigella glandulifera Freyn et Sint, Pueraria lobata (Willd.) Ohwi și Scutellaria barbata D. Don nu au prezentat citotoxicitate la celulele raw264.7 nestimulate, în timp ce au crescut semnificativ viabilitatea celulelor stimulate de LPS/IFNy (Tabelul 1). Cu toate acestea, Daphne genkwa Sieb.et Zucc, care are cel mai puternic efect inhibitor asupra producției de NO, a fost moderat toxic pentru celulele RAW264.7 (Tabelul 1).
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
HR: herb; RT: rădăcină; ST: tulpină; LF: frunză; TW: crenguță; FL: floare; FR: fruct; SD: sămânță; SC: sclerotium; HW: inimă; SR: tulpină și rădăcină; pe: pericarp. inhibarea continuă a producției de NO: reacția Griess a fost efectuată pentru a măsura producția de nitriți în celulele RAW264.7 stimulate de LPS/IFNy în absența sau prezența a 100 g/mL extracte de plante medicinale. creșterea cCell: MTT a fost efectuat pentru a măsura creșterea celulară. Rata de creștere a controlului (fără tratament cu extract de plante medicinale) a fost considerată 100%. producția de dNO: reacția Griess a fost utilizată pentru a măsura cantitatea de nitriți în raw264 nestimulat.7 celule în absența și prezența a 100 g/ml extracte de plante medicinale. citotoxicitatea eCell: testul MTT a fost efectuat pentru a determina citotoxicitatea celulară a celulelor raw264.7 nestimulate tratate cu extracte din plante medicinale. Grupul netratat a fost considerat 100%. fproducție procentuală de extract obținut din extracția etanolului 70% din fiecare plantă uscată de 100 g. inhibarea gpercentă a activității iNOS la concentrația de testare de 50 M. |
3.2. Corelația dintre potența antiinflamatorie și caracteristicile TCM ale plantelor
analizând caracteristicile TCM ale 10 plante care prezintă cel mai puternic efect inhibitor asupra no production în celulele LPS/IFNy-stimulate RAW264.7, am constatat că cele mai multe dintre ele sunt în categoriile de aromă amară sau înțepătoare, natura caldă și distribuțiile meridianului pulmonar sau hepatic (Tabelul 2). Pentru a corela caracteristicile TCM cu efectul antiinflamator în aceste plante, am clasificat caracteristicile TCM ale acestor plante care au fost capabile să elimine 50% din nicio producție în celulele RAW264.7 stimulate de LPS/IFNy. Tabelul 3 a arătat că ierburile cu efect antiinflamator mai mare au fost distribuite într-un procent semnificativ mai mare la cele caracterizate ca arome amare/înțepătoare, natură caldă și distribuții meridiane hepatice/pulmonare. Aceste rezultate sugerează că ierburile antiinflamatorii pot avea caracteristici comune care sunt de aromă înțepătoare / amară, natură caldă și Meridian pulmonar/hepatic.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
bazat pe Farmacopeea Chineză (2010). bbazat pe Materia Medica Chineză (1998). |
|
3.3. Corelația dintre efectul protector celular și caracteristicile TCM ale ierburilor
inflamația cronică duce adesea la deteriorarea celulelor și, prin urmare, sunt căutați în mod activ agenți capabili să descurajeze acest proces. Examinând 21 de plante cu TCM caracteristic aromei înțepătoare, am observat că, sub costimularea LPS și IFNy, RAW264.7 celule tratate cu aceste extracte din plante au prezentat o creștere cu 90% a viabilității celulare (Tabelul 4). Mai mult, ierburile cu aromă înțepătoare au conferit, de asemenea, cel mai înalt grad de protecție celulară în celulele stimulate de LPS/IFNy în comparație cu ierburile cu alte arome (Figura 1).
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ierburi cu capacitate de protecție celulară de peste 90% în celulele raw264.7 stimulate. bHerbs cu capacitatea de a crește peste 90% proliferarea celulelor în repaus RAW264.7 celule. |
Compararea ierburilor cu viabilitatea celulară în diferite arome. Media viabilității celulare a celulelor raw264.7 stimulate de LPS / IFNy tratate cu ierburi aparținând aromelor diferite. .
4. Discuție
supraproducția NO datorată expresiei inos crescute a fost legată în mod convingător de patogeneza inflamației cronice și a cancerului . Prin urmare, agenții care pot suprima selectiv producția no generată de iNOS ar trebui să fie eficienți pentru a trata inflamația cronică și pentru a preveni cancerul. De fapt, studii recente demonstrează că inhibitorii selectivi iNOS L-NIL și 1400 W sunt eficienți terapeutic ca medicamente antiinflamatoare și anticanceroase .
macrofagele joacă un rol critic în reglarea inflamației. Macrofagele sunt activate de stimuli externi, iar macrofagele activate produc diferiți mediatori inflamatori, cum ar fi No și speciile reactive de oxigen. Ierburile chinezești sunt sursele bogate de agenți antiinflamatori și s-au făcut eforturi pentru a identifica componentele eficiente din aceste plante . Profitând de modelul de celule RAW264.7 bine stabilit, am evaluat 81 de extracte din plante pentru efectul lor inhibitor asupra producției de NO induse de LPS/IFNy. Printre acestea, extractul de Daphne genkwa Sieb.et Zucc a arătat cel mai puternic efect inhibitor asupra NO production. Constituenții izolați de Daphne genkwa Sieb.et Zucc au fost raportate anterior pentru a provoca un efect citotoxic la diferite linii de celule tumorale și pentru a suprima excrescență de sarcom de șoarece transplantat S180 la șoareci . Speculăm că efectul anticanceros al lui Daphne genkwa Sieb.et Zucc poate fi asociat funcțional cu capacitatea sa antiinflamatoare. În studiul nostru, am constatat că Rubia cordifolia L. și alte câteva scad producția de NO indusă de LPS/IFNy fără a provoca citotoxicitate semnificativă celulelor RAW264.7. Aceste plante pot fi astfel candidați promițători ca medicamente eficiente pentru controlul inflamației și cancerului. Deși în prezent nu este clar modul în care aceste extracte blochează producția de NO indusă de LPS/IFN în celulele RAW264.7, constatarea că Mollugin suprimă răspunsul inflamator prin blocarea traductorilor de semnal Janus kinază și a activatorilor căii de semnalizare a transcripției implică faptul că ierburile pot viza diferitele etape ale cascadei de semnalizare care mediază producția de NO indusă de LPS/IFN pentru a-și exercita rolurile antiinflamatorii.
pe baza teoriei TCM, am clasificat aceste 81 de plante în funcție de arome distincte (înțepătoare, dulce, acră, amară, astringentă, sărată sau ușoară), naturi (reci, reci, moderate, calde sau fierbinți) și distribuții de meridiane (ficat, rinichi, inimă, splină etc.). Studiul nostru a arătat că caracteristica TCM a aromei s—a corelat foarte bine cu potența de a inhiba nicio producție-aroma înțepătoare este cea mai puternică, amară este puțin mai slabă decât aromele înțepătoare, dulci este intermediară, iar aroma astringentă, sărată, ușoară sau acră este slabă sau nu este eficientă. Caracteristicile TCM ale naturii și distribuția meridianului sunt, de asemenea, asociate cu potența de a inhiba producția de NO. De exemplu, procentul mai mare de plante cu capacitatea de a bloca nici o producție are caracteristicile naturii calde. Caracteristicile meridianelor hepatice și pulmonare sunt distribuțiile majore ale meridianelor găsite în ierburile ale căror extracte pot bloca 50% din nicio producție. Luate împreună, considerăm că caracteristicile TCM pot fi foarte utile pentru a ghida căutarea unor agenți antiinflamatori eficienți în ierburile chinezești.
caracteristica TCM este o expresie sistematică a proprietății distincte provocate de Materia Medica la om. Teoria aromelor în TCM constituie contextul de bază al orientărilor de utilizare a plantelor chinezești. În TCM, caracteristica aromei este combinația atât a gustului real, cât și a efectului curativ. Potrivit lui Shen Nong Ben Cao Jing (Shennong ‘ s Classic of Material Medica), o carte importantă TCM scrisă în primul rând pe aroma chineză pe bază de plante și teoria proprietății, aroma înțepătoare, care este legată de meridianul pulmonar, poate dispersa căldura internă cu sudorifice care, la rândul lor, promovează circulația Qi și a sângelui. Ierburile cu aromă înțepătoare au fost folosite de mii de ani în China pentru a revigora circulația sângelui și a sparge blocul de Qi. Faptul că bolile legate de inflamație sunt asociate cu simptomul qi și blocarea sângelui poate explica eficacitatea ierburilor cu aromă înțepătoare pentru a suprima inflamația.
studiul nostru s-a limitat la investigarea a 81 de extracte din plante cu privire la efectul lor asupra producției de NO induse de LPS/IFNy și a creșterii celulare în celulele RAW264.7 macrofage. Rezultatele generate de acest studiu susțin totuși o asociere strânsă între farmacologia modernă/știința biomedicală și teoria TCM. Teoria TCM a fost dezvoltată pe baza a mii de ani de experiență clinică, iar baza materială și farmacologică a TCM rămâne explicată de știința biomedicală modernă. Credem că acest studiu a contribuit la atingerea acestui obiectiv.
Conflict de interese
autorii declară că nu există niciun conflict de interese în ceea ce privește publicarea acestei lucrări.
mulțumiri
această lucrare a fost susținută de Proiectul Național de știință și Tehnologie Major al Ministerului științei și Tehnologiei din China (2009zx09311-003), Fondul tinerilor oameni de știință al Fundației Naționale de științe Naturale din China (81001666), programul de inovare al Comisiei Municipale de educație din Shanghai (13YZ048) și Fundația Comisiei de educație din Shanghai pentru profesori tineri remarcabili din Universitate (SZY07029).