Checkpoint kinase 1 (Chk1)-short este o variantă de îmbinare și un inhibitor endogen al Chk1 care reglează ciclul celular și deteriorarea ADN-ului puncte de control

rezultate și discuții

în timpul studiului nostru de semnalizare a daunelor ADN (32, 33), am observat două benzi proeminente în imunobloții Chk1: banda Chk1 la 56 kDa și o bandă de migrare mai rapidă de 43 kDa. Banda de migrare mai rapidă a fost detectată de anticorpii Chk1 care au fost reactivi la domeniul kinazei interne sau la secvența C-terminală, dar nu de anticorpii Chk1 care recunosc capătul N (Fig. 1A). Această bandă nu a fost recunoscută de anticorpul monoclonal G4 din biotehnologia Santa Cruz, care este utilizat în mod obișnuit pentru analiza imunoblot a Chk1 (24, 29). Eliminarea Chk1 prin siRNA a dus la dispariția atât a Chk1, cât și a benzii 43-kDa, confirmând în continuare relevanța acestora (Fig. 1B). Proteina 43-kDa nu a fost afectată de proteazom și inhibitori de protează (apendicele SI, Fig. 1), ridicând posibilitatea ca aceasta să fie o variantă alternativă de îmbinare a Chk1. Baza de date a Centrului Național pentru Biotehnologie listează în prezent trei ARNm-uri Chk1 umane, care au diferite regiuni netraduse, dar codifică aceeași proteină Chk1 de lungime completă de 476 aminoacizi (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1111). Cu toate acestea, analiza noastră utilizând o bază de date predictivă alternativă de îmbinare bazată pe est (http://genome.ewha.ac.kr/ECgene) a sugerat posibilitatea unei variante unice de îmbinare a Chk1 în care exonul 3 este alternativ îmbinat sau șters. Pentru a testa direct această posibilitate, am efectuat RT-PCR folosind primeri în cadrul secvenței de codare Chk1 (Fig. 1C). RT-PCR folosind setul de grunduri P1, în care primerul forward a fost proiectat în cadrul exonului 3, a generat un singur amplicon de dimensiunea așteptată, în timp ce RT-PCR cu setul de grunduri P2 sau P3 (ambele bazate pe secvențe care flancează exonul 3) a generat două ampliconi, unul cu dimensiunea așteptată de Chk1 și celălalt cu 200 BP mai scurt (Fig. 1C). Secvențierea a confirmat că ampliconul mai lung a fost într-adevăr Chk1 și, în special, ampliconul mai scurt a fost o variantă alternativă de îmbinare a Chk1 lipsită de exonul 3 (Fig. Apendicele 1D și SI, Fig. 2A). S-a prezis că această variantă de îmbinare se va traduce într-o formă trunchiată N-terminală a Chk1 constând din 382 aminoacizi pe care i-am numit Chk1-scurt sau Chk1-S (Fig. Apendicele 1D și SI, Fig. 2). În electroforeza în gel, chk1-S tradus in vitro a migrat în mod similar cu proteina 43-kDa din celulele HEK293 (Fig. 1E). Am imunoprecipitat în continuare proteina 43-kDa din lizatul celular HEK293 pentru spectrometrie de masă și i-am confirmat identitatea ca Chk1-S. Trunchierea N-terminală în Chk1-s este în concordanță cu rezultatele imunoblotului care arată că nu a fost recunoscută de anticorpii reactivi la secvența N-terminală a Chk1 (Fig. 1A). Analiza în timp Real și RT-PCR a detectat expresia ARNm Chk1-S în mai multe țesuturi umane, iar expresia este în general mai mare în țesuturile fetale (apendicele SI, Fig. 3 A și D). Analiza imunoblotului a detectat în continuare expresia proteinei Chk1-s în liniile celulare umane, șoarece și șobolan, precum și în țesuturile fetale umane (apendicele SI, Fig. 3B) și celule tubulare renale primare de șoarece (apendicele SI, Fig. 3C). ADNc de lungime completă a Chk1-S a fost, de asemenea, clonat din trei țesuturi umane normale (timus, colon, ficat fetal) și secvențiat pentru a confirma că codifică o variantă de îmbinare trunchiată N-terminală a Chk1. Împreună, aceste experimente au identificat o variantă unică de îmbinare a Chk1 care este trunchiată n-terminal și exprimată pe scară largă în celulele și țesuturile mamiferelor.

care este funcția Chk1-s? Reglează punctele de control ale ciclului celular precum Chk1? Cu aceste întrebări, am determinat mai întâi modelele de Expresie temporală și spațială ale Chk1-S în ciclul celular. Celulele HEK293 au fost sincronizate la fazele G1, G1/S sau G2/M prin înfometare serică, bloc dublu de timidină sau, respectiv, nocodazol. Chk1-S a fost scăzut în celulele de fază G1 și mai mare în celulele G1/S și G2/M (apendicele SI, Fig. 4 A și B). Mai mult, când celulele au fost sincronizate în faza G1 / S prin bloc dublu de timidină și apoi eliberate, atât expresia Chk1, cât și chk1-s au crescut după intrarea în faza s (Fig. 2A). O diferență distinctă între expresia Chk1 și chk1-s a fost că, în timp ce expresia Chk1 a atins apogeul la faza mijlocie S, expresia Chk1-s a continuat să crească de la faza S La m (Fig. 2A). Interesant, nivelurile ridicate de Expresie Chk1-s au fost observate la 7 ore după eliberarea ciclului celular din blocul dublu de timidină, un moment în care celulele nu erau încă mitotice (apendicele SI, Fig. 4C). Am cuantificat în continuare raportul Chk1-s:Chk1 în celule sincronizate asincrone și s sau G2/M. În ciuda variațiilor expresiei Chk1 – s în HEK293, U2OS și celulele tubulare renale primare, raportul Chk1-s:Chk1 a fost peste 1 în toate celulele în faza G2/M (apendicele SI, Fig. 5). În celulele asincrone, Chk1-S și Chk1 au fost localizate în principal în nucleu (apendicele SI, Fig. 6A). Cu toate acestea, în celulele de fază G2/M, unele Chk1-S și Chk1 s-au acumulat în centrosomi (apendicele SI, Fig. 6 B și C). Localizarea Chk1 în centrosomi este critică pentru funcția sa de punct de control G2/M, unde previne activarea prematură a Cdk1 și intrarea mitotică (34, 35). Rezultatele noastre indică faptul că Chk1-S se poate localiza și la centrosomi, oferind o reglare spațială și temporală a Chk1 pentru a iniția intrarea mitotică. Apoi, am determinat efectele supraexpresiei Chk1 sau Chk1-s în celulele HEK293 și U2OS. Comparativ cu GFP-Chk1, GFP-Chk1-s a indus un fenotip nuclear distins care s-a caracterizat prin condensarea nucleară și formarea de micronuclee și nuclee multiple sau multilobate (Fig. 2B). La momente anterioare, celulele transfectate au prezentat condensare nucleară / cromatină marcată de fosforilare histonă-H3 slabă și punctată (Fig. 2B), indicativ al intrării mitotice premature. Ulterior, aceste celule au dezvoltat nuclee micronucleare sau multilobate, caracteristici ale catastrofei mitotice (Fig. 2B). Numărarea celulelor a arătat că GFP-Chk1-s a indus fenotipul nuclear în 20% din celulele u2os (Fig. 2C). Efecte similare au fost demonstrate de YFP-Chk1-s și Chk1-s-Myc (Fig. 2C), indicând faptul că fenotipul nuclear observat a fost indus de Chk1-S și nu de etichetele proteinelor de fuziune. În schimb, intrarea mitotică prematură nu a fost indusă de Chk1 sau de mutantul său mort de kinază Chk1-KD (Fig. 2C). Chk1-S a indus, de asemenea, fenotipul nuclear izbitor în alte tipuri de celule (apendicele SI, Fig. 7). În special, un fenotip nuclear similar a fost raportat în celule și modele murine lipsite de una sau ambele alele Chk1 (7, 36, 37), sugerând că Chk1-S poate acționa ca un inhibitor endogen al Chk1. Pentru a testa în continuare această posibilitate, am generat linii celulare TET-on U2OS care pot fi induse să exprime Chk1, Chk1-KD sau Chk1-S. celulele au fost sincronizate în faza G1/S prin bloc dublu de timidină, indus de doxiciclină și apoi eliberat în mediu care conține nocodazol. Aproximativ 80% din celulele care exprimă Chk1-S au intrat în mitoză , în timp ce 60% din celulele care exprimă Chk1 sau Chk1-KD au intrat în mitoză (Fig. 2D). Important, în timp ce majoritatea celulelor mitotice din grupurile care exprimă Chk1 și Chk1 – KD au avut ADN 4N, 25% din celulele mitotice din grupul care exprimă Chk1-S au avut mai puțin de 4N conținut de ADN (Fig. 2D), indicativ al intrării mitotice aberante în aceste celule fără finalizarea replicării ADN-ului. În plus, supraexprimarea Chk1-S a dus la intrarea mai devreme în mitoză, așa cum este indicat de apariția celulelor pH3-pozitive (apendicele SI, Fig. 8). Chk1 este un regulator cheie al intrării mitotice sau al tranziției S-la-G2 / M în ciclul celular. Prin fosforilarea CDC25A (inducerea degradării sale) și Wee1, Chk1 previne activarea CDK1 și intrarea mitotică (5, 15-20). Am arătat că inducerea Chk1-s de către doxiciclină în celulele TET-on U2OS a dus la niveluri mai ridicate de CDC25A și niveluri mai scăzute de fosfo-CDK1, sugerând că Chk1-s a antagonizat Chk1 pentru a induce intrarea mitotică (Fig. 2E). Eliminarea specifică a Chk1-s prin RNAi nu a avut succes, deoarece secvența Chk1-s este conținută în ARNm Chk1. Cu toate acestea, o oligonucleotidă antisens complementară joncțiunii unice exon2–exon4 în Chk1-S ar putea reduce în mod specific expresia Chk1-s (apendicele SI, Fig. 9A). Reglarea descendentă a Chk1-S a redus semnificativ proliferarea celulelor (apendicele SI, Fig. 9B). Interesant este că reglarea descendentă a Chk1-S nu a modificat semnificativ profilul ciclului celular (apendicele SI, Fig. 9C). Deoarece chk1 funcționează la mai multe puncte de control ale ciclului celular (de exemplu, G2/M, fus, intra-s), Chk1-S poate antagoniza Chk1 pentru a facilita progresia ciclului celular la mai multe site-uri. Ca urmare, inhibarea Chk1-S poate încetini ciclul celular în diferite faze și poate duce la suprimarea proliferării fără modificări majore ale distribuției ciclului celular.

cum antagonizează Chk1-S Chk1? Am emis ipoteza că Chk1-S ar putea interacționa cu Chk1 pentru a-i bloca activitatea kinazei. În mod consecvent, FLAG-Chk1-s exprimat în celule HEK293 coimmunoprecipitate cu chk1 endogen (Fig. 3A). Mai mult decât atât, in vitro tradus Myc-Chk1 și Chk1-s coimmunoprecipitat (Fig. 3B), sugerând o interacțiune directă Chk1–Chk1-s. Am demonstrat în continuare coimunoprecipitarea Chk1 cu domeniul n-terminal, dar nu domeniul C-terminal, al Chk1-S (Fig. 3C), sugerând cerința secvenței n-terminale în Chk1-s pentru interacțiunea sa cu Chk1. Funcțional, am determinat efectele Chk1 – S asupra activității kinazei Chk1. Chk1-Myc a fost exprimat și imunoprecipitat pentru testul kinazei in vitro în absența sau prezența Chk1-s purificat.așa cum se arată în Fig. 3D, activitatea kinazei Chk1 a fost parțial, dar semnificativ suprimată de Chk1-s, dar nu de chk1-s denaturat de căldură.în schimb, Chk1-s nu a diminuat activitatea Chk2, care are preferințe de substrat similare cu Chk1. Comparativ cu Chk1, Chk1-S nu are o parte din domeniul kinazei, inclusiv situsul de legare ATP (Fig. 1D) și, așa cum era de așteptat, nu a prezentat o activitate semnificativă a protein kinazei (Fig. 3D). Chk1-S poate suprima, de asemenea, activitatea kinazei Chk1 marcat n-terminal (FLAG-Chk1) într-un test de kinază in vitro (apendicele SI, Fig. 10). Aceste rezultate sugerează că Chk1-S poate inhiba Chk1 prin interacțiune moleculară. Un studiu recent a arătat că spălarea imunoprecipitatelor Chk1 cu un tampon de testare a imuno-precipitațiilor Radio mai stricte (RIPA) poate crește semnificativ activitatea kinazei Chk1, sugerând că Chk1 este în mod normal inhibat de factorii de reprimare (29); cu toate acestea, identitatea factorilor de reprimare este necunoscută. Am confirmat efectul spălării tampon RIPA și, în special, am arătat în continuare că adăugarea de chk1-s exogene ar putea inversa efectul spălării tampon RIPA asupra activității kinazei Chk1 (Anexa SI, Fig. 11), sugerând că Chk1-S poate fi unul dintre factorii cheie de reprimare endogenă pentru Chk1.

în răspunsul la deteriorarea ADN-ului (DDR), Chk1 este activat semnificativ prin fosforilare la reziduurile S345 și s317 (7, 13, 38, 39). În ciuda recunoașterii importanței fosforilării S345 / s317, rămâne neclar modul în care această fosforilare activează Chk1 (28-30). Am arătat că expresia Chk1-s nu s-a schimbat apreciabil în DDR (Anexa SI, Fig. 12). Cu toate acestea, interacțiunea Chk1–Chk1-s a fost atenuată în DDR indusă de camptotecină, un inhibitor de topoizomerază ADN I și agent dăunător ADN (Fig. 3E). În special, disocierea Chk1 de Chk1-S în DDR a apărut dependentă de fosforilarea Chk1 la S345/s317, deoarece mutantul Chk1(s345a/s317a) nu s-a disociat de Chk1-s în timpul tratamentului cu camptotecină (Fig. 3E). În DDR, activarea Chk1 depinde de fosforilarea mediată de ATR (7, 13, 14). Am arătat că inhibarea ATR printr-un mutant dominant-negativ (DN-ATR) nu numai că a suprimat fosforilarea chk1-s indusă de camptotecină, dar a împiedicat și disocierea Chk1–Chk1-s (Fig. 3F). În mod similar, Chk1 disociat de Chk1-S în timpul DDR indus de cisplatină, iar disocierea a fost prevenită de DN-ATR (apendicele SI, Fig. 13). Împreună, rezultatele sugerează că fosforilarea Chk1 poate perturba interacțiunea sa cu inhibitorul endogen Chk1-s, ducând la activarea Chk1 în DDR.

identificarea Chk1-S ca regulator unic al progresiei ciclului celular și a proliferării celulare ne-a determinat să examinăm expresia sa în țesuturile canceroase. La nivelul ARNm, majoritatea țesuturilor canceroase au exprimat niveluri mai ridicate de Chk1 și Chk1-S decât țesuturile normale (apendicele SI, Fig. 14). Interesant este că carcinoamele testiculare au arătat o reglare marcată a Chk1-S, dar nu Chk1 (Fig. 4A). Reglarea up specifică a Chk1-S a fost confirmată în continuare prin analiza imunoblotului în țesuturile carcinomului testicular, în special în probele de cancer în stadiu tardiv (Fig. 4B). Așa cum s-a raportat anterior (5), atât țesuturile testiculare normale, cât și cele maligne au prezentat niveluri ridicate de Expresie Chk1. Expresia crescută a Chk1-S a fost, de asemenea, detectată în timpul progresiei cancerului ovarian (Fig. 4B). Nivelul relativ ridicat al expresiei Chk1 și Chk1-s atât la făt (apendicele SI, Fig. 3) și cancer (Fig. 4) țesuturile sugerează că Chk1 – S poate accelera progresia ciclului celular, promovând proliferarea celulară în aceste condiții.

am examinat în continuare efectul expresiei ectopice Chk1-S asupra creșterii tumorii xenogrefe la șoareci. Xenogrefele tumorale au fost stabilite la șoareci nud folosind linii celulare de cancer mamar Tet-on MDA-MB-231 care pot fi induse de doxiciclină pentru a exprima Chk1, Chk1-s sau Chk1-KD. Inducerea Chk1 sau Chk1 – KD de către doxiciclină nu a afectat creșterea tumorii; cu toate acestea, inducerea Chk1-S a dus la o reducere cu 40% a volumului tumorii (Fig. 4C). Țesuturile tumorale induse de Chk1–S au prezentat, de asemenea, acumularea cdc25A, indicând inhibarea Chk1 (Fig. 4E). Deși rezultatele pot implica o strategie unică împotriva cancerului, relevanța fiziologică a supraexprimării forțate a chk1-s ectopice rămâne neclară. Cu toate acestea, aceste rezultate oferă o dovadă a principiului că înclinarea echilibrului Chk1–Chk1-s poate duce la catastrofă mitotică și la reducerea proliferării celulare.

observația că supraexpresia Chk1-S a redus creșterea tumorii xenogrefe (Fig. 4 C-E) părea contradictorie observației că probele tumorale de la pacienții umani au exprimat niveluri relativ ridicate de Chk1-S pentru proliferarea celulelor (Fig. 4 apendicele A și B și SI, Fig. 14). Pentru a reconcilia aceste date, este important să recunoaștem diferențele dintre condițiile experimentale. Expresia Chk1-s relativ ridicată în tumorile umane poate fi atribuită prezenței celulelor proliferative în aceste țesuturi. În mod constant, Chk1-s este, de asemenea, ridicat în țesuturile fetale care sunt foarte proliferative (apendicele SI, Fig. 3A). Important, expresia Chk1-S în aceste țesuturi proliferative este limitată temporar la faza târzie S până la M (Fig. 2 și anexa SI, Fig. 4). Această reglare temporală poate asigura că activitatea Chk1 este inhibată după (și numai după) finalizarea replicării ADN în faza S pentru progresia ciclului celular în faza G2/M. Cu toate acestea, atunci când chk1-s ectopic este forțat să supraexprimeze în celulele cultivate sau în tumorile xenogrefe, restricția temporală a expresiei Chk1-s este întreruptă; cu alte cuvinte, Chk1-s este ridicat pe tot parcursul ciclului celular, inclusiv faza s, rezultând blocarea constantă a Chk-1 și intrarea mitotică prematură, ducând la catastrofă mitotică și la proliferarea celulară redusă.

în concluzie, acest studiu a identificat o variantă de îmbinare a Chk1, Chk1-S, Care este un regulator cheie al Chk1 în ciclul celular normal și în timpul DDR (apendicele SI, Fig. 15). În ciclul celular neperturbat, expresia Chk1 crește în faza S și unele molecule Chk1 ar putea fi fosforilate prin ATR prevenind legarea Chk1-s, rezultând o activitate Chk1 ridicată și menținerea fazei S până la finalizarea replicării ADN-ului. În faza G2, expresia Chk1–s crește și, așa cum s-a raportat (29), fosforilarea Chk1 scade, promovând o interacțiune Chk1-Chk1-s pentru a suprima activitatea Chk1. Scăderea activității Chk1 la faza G2 / M este critică pentru intrarea mitotică. În condiții de inducție sau supraexpresie Chk1-s, cantități excesive de Chk1-s sechestrează Chk1 și diminuează activitatea kinazei în timpul fazei S, rezultând intrarea mitotică prematură fără finalizarea replicării ADN-ului, ducând la catastrofă mitotică. În timpul deteriorării ADN-ului, Chk1 este fosforilat, ducând la scăderea legării Chk1-s, creșterea activității Chk1 și arestarea G2/M (apendicele SI, Fig. 11). Constatările noastre susțin mecanismul de” de-represiune ” al activării Chk1 (29). Important, Chk1-S pare a fi unul dintre factorii cheie de reprimare a activității Chk1. Prin antagonizarea Chk1, Chk1 – S poate accelera ciclul celular, ducând la creșterea proliferării în țesuturile fetale și canceroase. Nivelurile ridicate de Chk1 în celulele proliferante coordonează faza S și mitoza, în timp ce nivelurile ridicate de Chk1-s pot oferi un comutator puternic pentru tranziția de fază S-la-G2/M. În schimb, supraexprimarea forțată a Chk1-S la niveluri excesive, dezechilibrată de Chk1, induce intrarea mitotică prematură și moartea celulară (Fig. 2) și suprimă creșterea tumorii în modelele de xenogrefă tumorală (Fig. 4). S-a sugerat că Chk1 este o țintă terapeutică eficientă în terapia cancerului, iar inhibitorii Chk1 sunt evaluați în studii clinice (40-43). Identificarea Chk1 – S ca inhibitor endogen al Chk1 poate deschide noi domenii de cercetare în reglarea ciclului celular, răspunsul la deteriorarea ADN-ului și terapia cancerului.