chromatine Immunoprecipitation (ChIP) assay is een belangrijke methode voor transcriptionele Regulatie monitoring met ongedekte kennis van interacties tussen specifieke eiwitten en een genomisch DNA gebied. Gezien het feit dat DNA-bindende proteã nen (met inbegrip van transcriptiefactoren en histones) in levende cellen met DNA kunnen worden verbonden dat zij binden, wordt de Spaander gebruikt om eiwit-DNA complex uit cellulaire lysaten door een aangewezen antilichaam immunoprecipiteren. De immunoprecipitated complexen worden verzameld door centrifugatie, en de proteã nen worden geëlueerd voor verdere analyse zoals Westelijke vlek en LC/MS.Nucleic zure analyse wordt bereikt door PCR, RT-PCR, cDNA rangschikkend en microarray. Dit protocol verstrekt een gedetailleerde procedure om succesvolle Spaanderanalyse op een snelle en efficiënte manier te bereiken.
reagentia:
- 37% formaldehyde
- 1 m glycine
- Cell lysis buffer: 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EDTA, 0,5% NP-40, 1% Triton X-100, met 1× proteaseremmer cocktail.
- PBS: pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4.
- 10% Chelex 100
Equipments:
- Sonicator
- Ultrasonic bath
- Rocking or shaking device
- Eppendorf tube rotator
- Refrigerated microcentrifuge
- Gel electrophoresis apparatus
- PCR apparatus
Steps:
Cross-link and cell collection
1. Voeg 27 µL 37% formaldehyde per 1 mL kweekmedium toe om een eindconcentratie van 1% te verkrijgen, incubeer de cellen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur terwijl ze langzaam schudden met een schommel-of schudapparaat.
2. Blus cross-link door toevoeging van 141 µL 1 m glycine per 1 mL kweekmedium tot een uiteindelijke concentratie bij 125 mM, incubeer de cellen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
3. Voor drijvende cellen: spantangcellen in een conische buis van 15 mL, centrifugeer bij 2000 × g bij 4°C gedurende 5 minuten. Gooi het supernatant weg en was de cellen tweemaal met koude PBS.
Ga naar stap 5.
4. Voor zelfklevende cellen: verwijder het medium, was de cellen tweemaal met koude PBS. Schraap de cellen in PBS in een 15 mL conische buis, centrifugeer bij 2000 × g bij 4°C gedurende 5 minuten.
Lysis en sonication
5. Gooi het supernatant weg en voeg 1 mL koude – cellysisbuffer per 1 × 107 cellen toe. Resuspendeer de pellet door meerdere keren op en neer te pipetteren, en incubeer 10 minuten op ijs.
6. Sonicate om chromatin in 0.5~1 kb fragment te verscheuren. Vermijd schuim en houd het monster op ijs.
opmerkingen:
- de sonicatieomstandigheden moeten worden geoptimaliseerd, afhankelijk van het monster en het sonicatiemodel. Gewoonlijk bleken zes pulsen van 15 sec gevolgd door rustperioden van 45 sec bij output 6.0 te werken. Voor analyse de fragmentgrootte, extract een klein volume van totale DNA uit een aliquot van geschoren chromatine, en analyseer dan op een agarose gel (1~2%).
- de volumes zouden ≤ 1 mL moeten zijn om de sonicatieefficiëntie te handhaven.
7. Centrifugeer gedurende 10 min bij 12.000 × g bij 4°C en bewaar het supernatans.
8. Breng 0,5 mL supernatant over in een verse 1.5 mL tube voor DNA fragment analyse.
Immunoprecipitatie
9. Voeg relevante antilichamen of normale IgG toe aan het monster en incubeer gedurende 15 minuten in een ultrasoon waterbad bij kamertemperatuur.
opmerkingen:
- kies IgG uit dezelfde soort waar de antilichamen werden geproduceerd.
- de incubatietijd moet worden geoptimaliseerd, afhankelijk van het antilichaam en het antigeen. Voor antigenen met een laag expressieniveau, kan de incubatie bij 4°C ‘ s nachts op een roterend platform worden uitgevoerd .
10. Bereid proteïne a-agarose parels: was de parels driemaal met 1 mL lysis-buffer (zonder proteaseremmer), centrifugeer gedurende enkele seconden bij 2000 × g bij 4°C en gooi het supernatant weg.
11. Verdun parels 1: 1 met lysis-buffer en voeg 50 µL toe aan het monster.
12. Incubeer bij 4°C gedurende 30 ~ 45 min in een roterend platform.
13. Centrifugeer bij 2000 × g gedurende 1 min bij 4°C en gooi vervolgens het supernatans weg.
14. Was de parels vier keer met 1 mL lysis buffer (zonder proteaseremmer), gooi het supernatant weg.
DNA-zuivering en-analyse
15. Resuspendeer de gewassen kralen met 100 µL 10% Chelex 100.
16. Pipetteer enkele seconden op en neer en kook het monster vervolgens 10 minuten.
17. Centrifugeer bij 12.000 × g gedurende 1 min bij kamertemperatuur en breng het supernatans over in een verse 1,5 mL buis.
18. Zuiver DNA met behulp van een DNA-zuiveringskit of door standaard fenol: chloroform extractieprotocol.
19. Los DNA op met 50 µL ddH2O en gebruik 2 ~ 10 µL van het DNA-monster (25% van het reactievolume) in de PCR-reacties
leer meer over het principe van de ChIP
Reach to our ChIP servise
Als u vragen hebt, neem dan contact met ons op: