Os EUA Food, Drug and Cosmetic Act de 1938 requerido fabricantes e empresas farmacêuticas para ser responsável pela segurança da droga aditivos / excipientes em seus produtos, em resposta a uma tragédia onde 100 crianças foram mortas da presença de dietileno glicol em um produto antibacteriano. Para ajudar a clarificar o que é necessário para estabelecer um novo excipiente, a FDA publicou, em 2005,um documento de orientação intitulado “estudos não clínicos para a avaliação da segurança dos excipientes farmacêuticos”, descrevendo os estudos de segurança necessários para ter um excipiente aprovado1, 2. Artigos recentes têm chamado a necessidade de mais excipientes alternativos para o uso em formulações1,3,4. Os formuladores geralmente preferem excipientes precedentes devido ao seu perfil de segurança bem estabelecido, bem como aos riscos e custos associados à aprovação de um novo excipiente 3. Quando se qualifica um novo excipiente, devem realizar-se estudos de segurança e, em caso de acontecimento adverso, deve duvidar-se se o acontecimento adverso foi devido ao excipiente ou ao produto. Quando utilizar um excipiente, enquanto experiência anterior com qualquer injetável via de administração é valioso na justificação da sua utilização, é de notar que nos termos da regulamentação atual de mudança de via de administração, ou o aumento da concentração, para além de sua atual dose mais elevada pode necessitar de segurança dados1,2. A necessidade de novos excipientes é bem reconhecida, mas alargar os nossos conhecimentos na utilização de excipientes menos utilizados é igualmente importante, oferecendo ao mesmo tempo um caminho regulamentar mais fácil.
determinar o pH e o sistema tampão correctos é, sem dúvida, o passo mais crítico na formulação de uma proteína para garantir a sua solubilidade e estabilidade (química e física)3,5-7. O artigo centrar-se-á na estabilização da bioterapêutica. Os tampões encontrados em moléculas pequenas e em formulações proteicas parentéricas aprovadas pela FDA serão referenciados como justificação para explorar os efeitos Estabilizadores destes tampões nas proteínas. A tabela 1 lista o número de formulações únicas encontradas pesquisando os rótulos dos produtos aprovados pela FDA. Foram excluídas formulações idênticas resultantes da formulação de produtos genéricos ou de diferentes dosagens posológicas. Sempre que se faça alusão à forma salina do tampão de Choque, deve considerar-se que o tampão de choque é titulado com hidróxido de sódio ou ácido clorídrico, uma vez que estas são as groselhas-título mais comuns.
os tampões de choque mais comuns utilizados nas formulações parentéricas foram o citrato, o fosfato e o acetato. Algumas das dosagens e fraquezas associadas a estes excipientes serão realçadas. O objetivo deste artigo é chamar a atenção para outros agentes tamponadores aprovados, mas menos usados, que requerem um uso mais extenso para se tornarem geralmente aceitos. Embora este artigo se centre exclusivamente em tampões, o mesmo argumento se estende a outros tipos de excipientes. À medida que a biotecnologia evolui como uma indústria e que se desenvolvem Andaimes proteicos mais únicos, tornar-se-á cada vez mais importante encontrar novas formas de estabilizar estas proteínas. Por vezes, os excipientes mais comuns não serão suficientes para proporcionar uma estabilidade adequada ou permitir tecnologias de fornecimento de droga.
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Comumente utilizados buffers
fosfato de Sódio
fosfato de Sódio (pKa 2.1, 7.2, e 12.3) é o mais comumente usado buffer encontrado no parenteral formulações (Tabela 1). A limitação mais notável na utilização do fosfato como tampão é o efeito da congelação nas alterações de pH. a mudança de pH durante a congelação foi estudada extensivamente. O desvio do pH é atribuído à cristalização selectiva do sal dibásico. A cristalização pode ser afectada pela velocidade de congelação, pelo pH inicial e pela presença de outros cosolutos. Uma mudança no pH de aproximadamente duas unidades é bastante típica durante a congelação, mas mudanças no pH até 3,6 unidades foram relatadas8-10. A alteração do ambiente de pH tem o potencial de desestabilizar as proteínas durante o processamento da substância a granel do medicamento ou a liofilização das soluções do medicamento 11-17. Esta situação é mais preocupante em condições em que são utilizadas concentrações elevadas de fosfato ou em que estão presentes outros excipientes cristalizantes, uma vez que estas condições ajudam a induzir a cristalização de fosfato. As soluções que contenham elevadas concentrações de proteínas ou solutos não cristalizáveis (por exemplo, sacarose) inibirão a cristalização de fosfatos e minimizarão as alterações do pH.
ácido cítrico
o ácido cítrico é um dos tampões de choque mais utilizados (Quadro 1). É um tampão trivalente contendo três ácidos carboxílicos com pKa de 3,1, 4,8 e 6,4 (Quadro 2), oferecendo uma ampla gama de tampões5. De acordo com a base de dados de ingredientes inativos da FDA, o citrato é encontrado em mais de 100 produtos injetáveis aprovados, dando-lhe uma grande história de uso e provando a sua segurança.
no Entanto, estudos comparando injecções subcutâneas de citrato-buffered formulações contra a parábola com formulações tamponada com fosfato ou histidina ter estabelecido que citratebuffered soluções induzida por mais dor ao subcutâneo injection18-20. Embora esta dor tenha sido relativamente curta (menos de dois minutos), suscita preocupações quanto à Conformidade dos doentes com injecções auto-administradas contendo citrato 18. Ao formular com ácido cítrico, deve ter-se em consideração o perfil do produto-alvo e a via de administração pretendida. Quando se pretende administrar injecções subcutâneas frequentes, pode ser mais apropriado utilizar outro agente tampão.
ácido acético
ácido acético tem um pKa de cerca de 4,8, oferecendo uma gama de tampões de 3,7-5,6 (Quadro 2). O uso de ácido acético é ideal para a formulação de proteínas estáveis no estado líquido em condições ácidas. A liofilização das soluções de ácido acético é acompanhada por um aumento do pH devido à sublimação da forma volátil do tampão, deixando para trás o sal de base. Esta situação é potencialmente desestabilizadora para a proteína e dificulta o controlo do pH dos medicamentos liofilizados.
tampões adicionais aprovados
trometamina
trometamina (Tris) (pKa 8.1) tem propriedades semelhantes às do fosfato (pKa 7.2) e pode ser usado como um substituto próximo de condições neutras de pH. Ambos os buffers exibem uma mudança de pH durante o congelamento. Em condições idênticas, o deslocamento do pH para a trometamina (+2.1) foi aproximadamente igual ao do fosfato ( 1.8), mas na direção oposta (Tabela 2)8.
escolher um buffer em vez de outro seria provavelmente dependente da sensibilidade da proteína individual à direção do deslocamento do pH e de quaisquer interações proteína-tampão específicas. A trometamina e a histidina demonstraram ser melhores estabilizadores do que o fosfato quando a eritropoetina foi submetida a stress a alta temperatura, impedindo a agregação auxiliando a reversibilidade da desdobra21. O Ure2p demonstrou ser mais estável contra a formação de fibril quando formulado em trometamina versus fosfate22.
histidina
histidina, um aminoácido essencial, está a tornar-se cada vez mais comum nas formulações de proteínas terapêuticas. Tendo um pKa de 6.1, é ideal para as formulações proteicas em condições neutras (Tabela 2).Foi demonstrado que a histidina protege um anticorpo monoclonal no estado líquido e liofilizado contra o stress térmico 23-25. Os estudos que examinaram a estabilidade do interferão-tau mostraram que as formulações contendo histidina (seguidas de Tris e fosfato) eram as mais estáveis contra a agregação induzida pelo calor. Esta estabilização foi atribuída à ligação directa da histidina ao protein26. Durante a liofilização, foi demonstrado que a histidina e o ácido aspártico protegem anticorpos actuando como dadores de ligação ao hidrogénio para preservar o β-sheets24-25 intramolecular. Adicionalmente,verificou-se que a histidina tem as propriedades de um antioxidante devido à sua capacidade de ligar iões de ferro e oxigen24, 27 singlet. A desvantagem do uso de histidina é que as soluções de histidina têm sido observadas para mudar a cor sob temperaturas aceleradas e pH ácido, bem como extrair Ferro de aço inoxidável 24.
ácido glucónico, láctico e tartárico
ácido glucónico, ácido láctico e ácido tartárico são excipientes que foram quase exclusivamente utilizados em pequenas formulações moleculares. O gluconato de cálcio foi licenciado para o tratamento de queimaduras por fluoreto de hidrogénio através de aplicação tópica. Em casos mais graves, foi utilizada uma perfusão de uma solução de gluconato de cálcio de 4% em solução salina para a prevenção de dâmage28 nos tecidos. Das 23 formulações injectáveis disponíveis comercialmente, contendo ácido láctico, encontradas na base de dados de ingredientes inativos da FDA, quatro formulações são usadas para biólogos – dois peptídeos e duas proteínas. Das 12 formulações que contêm ácido tartárico, apenas uma foi utilizada na formulação de uma proteína. Estes tampões podem ser substitutos adequados para acetato e citrato.
ácido glucónico é um composto formado naturalmente pela oxidação da glucose. É um composto interessante porque tem o potencial de agir como um tampão, estabilizador e agente quelante devido a ter uma estrutura contendo ácidos carboxílicos e grupos hidroxilo.Demonstrou-se que o tartarato
melhora a retenção do monómero sobre o citrato numa formulação de anticorpos a pH 4.0-4.5 quando armazenado como líquido a 25°C29. Foi colocada a hipótese de que os grupos hidroxilo em tartarato, citrato, malato e, por extensão, lactato e gluconato poderiam fornecer ligações de hidrogénio estabilizadoras na fase amorfa de uma cake30-31 liofilizada.Tanto o ácido aspártico como o ácido glutâmico são encontrados em perfusões administradas a lactentes e doentes pediátricos com concentrações plasmáticas insuficientes de aminoácidos. Em Tropoamina®, aspartato e glutamato são perfundidos em concentrações de 22 mM e 34 mM, respectivamente 32. Estas concentrações são suficientemente elevadas para proporcionar um amortecimento adequado das formulações proteicas.
ácido glutâmico quando formulado com quantidades iguais de arginina demonstrou melhorar a estabilidade e a solubilidade das proteinas23,33 bem como prevenir a agregação durante a reconstituição 23,34-35. Estudos com insulina e albumina sérica humana indicam que a adição de glutamato e aspartato foi capaz de inibir a formação de aggregates36-38. Os estudos com pegfilgrastim indicaram que a estabilidade do pegfilgrastim formulada em glutamato ou formato era comparável ao acetato 39.
ciclo do ácido Cítrico intermediários
Citrato, fumarato, α-cetoglutarato, malato e succinato são todos os intermediários do ciclo do ácido cítrico encontrado para ser seguro e eficaz como buffers ou contador de íons em formulações injetáveis. O fumarato, O α-cetoglutarato, o malato e o succinato foram utilizados num número limitado de produtos (Quadro 1). É lógico que os outros produtos intermédios do ciclo Krebs possam também ser adequados para utilização parentérica. Estes compostos incluem aconitato, isocitrato e oxaloacetato. Sendo ácidos carboxílicos divalentes e trivalentes, eles têm pKa variando de 2.0 a 6.4, tornando estes compostos adequados para uma ampla gama de formulações (Tabela 2).Devido à utilização limitada destes compostos como tampões, não é claro se a mesma dor na injecção associada a injecções subcutâneas de citrato estaria associada a estes compostos. No entanto, existem outras vantagens associadas ao seu uso. Demonstrou-se que o citrato induz a gelação de soluções de anticorpos quando a concentração proteica era superior a 100 mg/mL. Isto foi atribuído à natureza trivalente do tampão. Succinato, tendo apenas dois ácidos carboxílicos, não foi encontrado para ter o mesmo efeito no mesmo pH40.
Conclusion
Determining the correct pH and buffer system is critical for bring bioterapeutics into the clinic and to the market. É altamente desejável a necessidade de novos excipientes, bem como uma melhor compreensão dos excipientes existentes. A histidina, a trometamina e uma série de outros tampões alternativos oferecem vantagens em relação aos excipientes convencionalmente utilizados. O uso destes tampões alternativos não pode fazer nada além de ajudar a aumentar as ferramentas que os formuladores têm e podem permitir o desenvolvimento de um terapêutico que de outra forma pode ter falhado. Para estabilizar o vasto número de terapeutas proteicas em desenvolvimento, Todas as abordagens devem ser abertas à consideração.
1. Osterberg, R. E., Demerlis, C. C., Hobson, D. W., Mcgovern, T. J. (2011) Trends in Excipient Safety Evaluation. T. J. Tox. 30, 600-610
2. FDA (2005) Guidance for Industry: Nonclinical Studies for the Safety Evaluation of Pharmaceutical excipientes
5. Stoll, V. S., Blanchard, J. S. (1990) Buffers: Principles and Practice. Methods in Enzymology. 182, 24-38
6. Trevino, S. R., Scholtz, J. M., Pace, C. N. (2008) Measuring and Increasing Protein Solubility. J. Pharm. Ciência. 97, 4155-4166
7. Wang, W., Nema, S., Teagarden, D. (2010) Protein Aggregation-Pathways and Influencing Factors. T. J. Pharmaceutics. 390, 89–99
8. Williams-Smith, D. (1977) Changes in Apparent pH on Freezing Aqueous Buffer Solutions and their Relevance to Biochemical Electron-Paramagnetic-Resonance Spectroscopy. Biochem. J. 167, 593-600.
27. Wade, A. M., Tucker, H.N. (1998) Antioxidant Characteristics of L-Histidine. J. Nutr. Biochem. 9, 308-315
32. B. Braun Medical Inc. TROPHAMINE – isoleucine, leucine, lysine acetate, methionine, phenylalanine, threonine, tryptophan, valine, cysteine hydrochloride, histidine, tyrosine, n-acetyl-tyrosine, alanine, arginine, proline, serine, glycine, aspartic acid, glutamic acid and taurine solution
34. Zhang M.Z., Wen J., Arakawa T., Prestrelski S.J. (1995) A New Strategy for Enhancing the Stability of Lyophilized Protein: The Effect of the Reconstitution Medium on Keratinocyte Growth Factor. Pharmacol. Res. 12, 1447–1452
36. Quinn, R., Andrade, J. D. (1983) Minimizing the Aggregation of Neutral insulina Solutions. J. Pharm. Ciência. 72, 1472-1473
39. Piedmonte, D. M., Treuheit, M. J. (2008) Formulation of Neulasta (pegfilgrastim). O Adv. Drug Delivery Reviews. 60, 50–58
41. Sundaramurthi, P., Suryanarayanan, R., (2011) Predicting the Crystallization Propensity of Carboxylic Acid Buffers in Frozen Systems—Relevance to Freeze – Drying. J. Pharm. Ciência. 100, 1288–1293
42. Sundaramurthi, P., Suryanarayanan, R., (2011) Thermophysical Properties of Carboxylic and Amino Acid Buffers at Subzero Temperatures: Relevância para a estabilização em estado congelado. J. Phys. Chem. B. 115, 7154-7164
David SEK earned his BS in Chemistry from Bates College and his MS in Chemistry and Chemical Biology from Northeastern University. Ele tem 10 anos de experiência como cientista de formulação e passou os últimos oito anos trabalhando na Pfizer estudando a estabilidade da nova bioterapêutica.