o processo de aplicação de imagens de clareza começa com uma amostra de tecido pós-morte. Em seguida, uma série de tratamentos químicos devem ser aplicados para alcançar a transparência, em que o teor de lípidos da amostra é removido, enquanto quase todas as proteínas originais e ácidos nucleicos são deixados no lugar. O objetivo disto é tornar o tecido transparente e, portanto, acessível a investigação microscópica detalhada de suas partes funcionais constituintes (que são predominantemente proteínas e ácidos nucleicos). Para isso, a estrutura proteica pré-existente tem que ser colocada em um andaime transparente que a preserve, enquanto os componentes lipídicos são removidos. Este “andaime” é constituído por monómeros de hidrogel, como a acrilamida. A adição de moléculas como formaldeído, paraformaldeído ou glutaraldeído pode facilitar a ligação do andaime às proteínas e ácidos nucleicos que devem ser preservados, e a adição de calor é necessária para estabelecer as ligações reais entre os componentes celulares e a acrilamida.
uma vez concluída esta etapa, os componentes proteicos e ácidos nucleicos das células do tecido alvo são mantidos firmemente no lugar, enquanto os componentes lipídicos permanecem separados. Os lípidos são então removidos por 1-2 semanas de difusão passiva no detergente, ou acelerados por métodos electroforéticos para apenas horas a dias. À medida que passam, as propriedades lipofílicas do detergente permitem-lhe recolher e eliminar quaisquer lípidos encontrados ao longo do caminho. Corantes lipofílicos como DiI são removidos, no entanto, existem corantes lipofílicos compatíveis com clareza que podem ser fixados a proteínas vizinhas. A grande maioria das moléculas não lipídicas, tais como proteínas e ADN, não são afectadas por este procedimento, graças ao gel de acrilamida e às propriedades químicas das moléculas envolvidas.
como relatado no papel inicial, o tecido se expande durante este processo, mas conforme necessário pode ser restaurado para suas dimensões iniciais com um passo final de incubação em solução de correspondência índice refrativo.
nesta fase do processo, a amostra foi totalmente preparada para imagiologia. O contraste para imagiologia pode vir de moléculas fluorescentes endógenas, de rótulos de ácido nucleico (DNA ou RNA), ou de imunoformação, em que anticorpos que se ligam especificamente a uma determinada substância-alvo são usados. Além disso, estes anticorpos são rotulados com etiquetas fluorescentes que são a chave para o resultado final da imagem. Os métodos padrão de imagem confocal, de dois fotões ou de folha de luz são todos adequados para então detectar a fluorescência emitida até a escala de localização de proteínas, resultando assim nas imagens finais altamente detalhadas e tridimensionais que a CLARITY produz.
depois de uma amostra ter sido imunosantida para uma imagem, é possível remover os anticorpos e aplicar novos anticorpos, permitindo assim que uma amostra seja fotografada várias vezes e direccionada para múltiplos tipos de proteínas.