Plasmiden 101: de promotor Regio-laten we gaan!

tot nu toe hebben we in onze plasmiden 101-serie de plasmidekaart doorlopen: antibioticaresistentie, oorsprong van replicatie, enzovoort. Tot op dit punt kunnen we ons plasmide repliceren en ervoor zorgen dat cellen het behouden; de volgende stap is het plasmide ons gen van belang laten uitdrukken. Voer de promotor in, het element dat verantwoordelijk is voor het initiëren van de transcriptie van je insert in RNA.

in de praktijk beschrijft de term “promotor” de combinatie van de promotor (RNA-polymerase-bindingsplaats) en operatoren (responselementen). Promotors zijn ongeveer 100 tot 1000 basenparen lang en gevonden stroomopwaarts van hun doelgenen. De volgorde van het promotorgebied bepaalt de binding van de RNA-polymerase en transcriptiefactoren, daarom spelen promotors een grote rol bij het bepalen waar en wanneer uw gen van belang zal worden uitgedrukt.

de RNA-polymerase (s)

RNA wordt getranscribeerd uit DNA met behulp van een RNA-polymerase (RNAP). In bacteriën wordt dit gedaan door één enkel enzym; nochtans, hebben eukaryotes muliplepolymerases die elk verantwoordelijk zijn voor een specifieke subset van RNAs. Om deze specificiteit te bereiken, kan eukaryotic RNAP aan specifieke promotorelementen erkennen en binden. Dit betekent dat de promotor huidig in uw plasmide backbone met het type van RNA moet compatibel zijn dat moet worden gemaakt: als u mRNA (voor genuitdrukking) wilt moet u een promotor RNAP II gebruiken, terwijl kleine RNAs (zoals shRNA) van de promotors RNAP III worden getranscribeerd. Deze post kenmerkt promotors voor algemene transcriptie RNAP II en RNAP III; nochtans, gebruikend virale liter aangezien de promotors RNAP II algemeen in lentiviral en retroviral constructen worden aangewend en wij zullen deze in een toekomstige post op virale vectordelen bespreken.

Promotorspecificiteit

naast het kiezen van een promotor op basis van het type RNA-transcript, moet u er ook voor zorgen dat uw plasmide een promotor heeft die geschikt is om in uw gastorganisme te werken. Omdat de transcriptiemachines verschillen tussen celtypes of organismen, moeten de promotors eveneens variabel zijn. De bacteriële promotors werken slechts in prokaryotic cellen en typisch slechts in de zelfde of nauw verwante species waarvan zij werden afgeleid. Evenzo, vereisen de diverse eukaryotic celtypes (zoogdier, gist, installaties, enz.) unieke promotors en is er zeer weinig crossover. Over het algemeen, zijn de promotors in bacteriën minder divers en complex, die minder delen hebben dan die in eukaryotic cellen. Sommige promotors zijn constitutief actief en op de hele tijd, terwijl anderen worden zorgvuldiger gecontroleerd. Gereguleerde promotors kunnen alleen in bepaalde weefsels of op bepaalde momenten in ontwikkeling of er kunnen manieren zijn om ze aan of uit te schakelen naar believen met een chemische stof, warmte, of licht. In de cel, worden de promotors zelf gecontroleerd door nog andere regelgevende factoren: versterkers, grenselementen, isolatoren, en geluiddempers; nochtans, kan sommige “lekkage” van transcriptie voorkomen. Dit is normaal gesproken geen groot probleem voor cellen, maar het kan onderzoeksresultaten verwarren of zelfs uw cellen doden als uw gen van belang giftig is. Om dit te bestrijden, hebben de wetenschappers synthetische promotors gecreëerd, die typisch één of andere combinatie van andere promotorelementen omvatten, en neigen om strakker worden geregeld.

gemeenschappelijke promotoren voor eukaryoten en prokaryoten

hieronder zijn twee referentietabellen opgenomen met een lijst van enkele van de meest voorkomende bacteriële en zoogdierpromotoren. Deze lijsten is geenszins uitputtend, maar zou een goede plek moeten zijn om te beginnen wanneer het proberen om uw perfecte promotor te kiezen!

Eukaryotische Promoters

Promotor	Voornamelijk gebruikt voor	RNA-transcript	Beschrijving	Expressie	Aanvullende overwegingen
CMV	Algemene uitdrukking	mRNA	Sterke zoogdieren expressie promotor van het humaan cytomegalovirus	Constitutieve	bevat een versterker regio. Kan in sommige celtypes tot zwijgen worden gebracht.
EF1a	Algemene expressie	mRNA	sterke zoogdierexpressie uit humane elongatiefactor 1-Alfa	constitutief	geeft doorgaans een consistente expressie, ongeacht het celtype of de fysiologie.
SV40	Algemene expressie	mRNA	zoogdierexpressiepromotor van het Simian vacuolating virus 40	constitutief	kan een versterker bevatten.
PGK1 (mens of muis)	Algemene expressie	mRNA	Zoogdierpromotor uit het fosfoglyceraatkinasegen.	constitutieve	wijdverspreide expressie, maar kan per celtype variëren. Neigt zich tegen promotor neer regelgeving toe te schrijven aan methylation of deacetylation.
Ubc	algemene uitdrukking	mRNA	zoogdierpromotor van het humaan ubiquitine C-gen	constitutief	zoals de naam al aangeeft, is deze promotor alomtegenwoordig.
humaan bètaactine	Algemene expressie	mRNA	Zoogdierpromotor uit het bètaactinegen	constitutief	alomtegenwoordig. Kip versie wordt vaak gebruikt in promotor hybriden.
CAG	Algemene expressie	mRNA	sterke hybride zoogdierpromotor	constitutief	bevat CMV-versterker, chicken beta actin promotor en rabbit beta-globine splice acceptor.
TRE	Algemene expressie	mRNA	tetracyclineresponselement promotor	Induceerbaar met Tetracylijn of derivaten daarvan.	bevat doorgaans een minimale promotor met lage basale activiteit en verscheidene tetracycline operatoren. Transcriptie kan worden in-of uitgeschakeld, afhankelijk van welke Tet transactivator wordt gebruikt.
UAS	Algemene expressie	mRNA	Drosophila-promotor met gal4-bindingsplaatsen	specifiek	vereist de aanwezigheid van het gal4-gen om de promotor te activeren.
Ac5	Algemene expressie	mRNA	sterke insectenpromotor van Drosophila Actin 5C gen	constitutief	vaak gebruikt in expressiesystemen voor Drosophila.
Polyhedrine	Algemene expressie	mRNA	sterke insectenpromotor van baculovirus	constitutief	vaak gebruikt in expressiesystemen voor insectencellen.
CaMKIIa	genexpressie voor optogenetica	mRNA	Ca2 + /calmoduline-afhankelijke proteïne kinase II-promotor	specifieke	gebruikt voor neuronale/CZS-expressie. Gemoduleerd door calcium en calmoduline.
GAL1, 10	Algemene expressie	mRNA	aan gist grenzende, divers getranscribeerde promotors	Induceerbaar met galactose; onderdrukbaar met glucose	kan onafhankelijk of samen worden gebruikt. Gereguleerd door GAL4 en GAL 80.
Tef1	algemene uitdrukking	mRNA	elongatiefactor promotor	constitutief	analoog aan ef1a-promotor van zoogdieren.
GDS	Algemene expressie	mRNA	sterke gistexpressiepromotor uit glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase	constitutief	zeer sterk, ook TDH3 of GAPDH genoemd.
ADH1	Algemene expressie	mRNA	Gistpromotor voor alcoholdehydrogenase i	onderdrukt door ethanol	volledige versie is sterk met hoge expressie. Afgeknotte promotors zijn constitutief met een lagere expressie.
CaMV35S	algemene uitdrukking	mRNA	sterke plantenpromotor uit het Bloemkoolmozaïekvirus	constitutief	actief in dicots, minder actief in monocots, met enige activiteit in dierlijke cellen.
Ubi	algemene uitdrukking	mRNA	plantpromotor uit het ubiquitingen van maïs	constitutief	geeft een hoge expressie in planten.
H1	kleine RNA-expressie	shRNA	van de humane polymerase III RNA-promotor	constitutief	kan een iets lagere expressie hebben dan U6. Kan een betere expressie hebben in neuronale cellen.
U6	kleine RNA-expressie	shRNA	van de humane U6 kleine nucleaire promotor	constitutief	muriene U6 wordt ook gebruikt, maar kan minder efficiënt zijn.

Prokaryotische promoters

Promotor	Voornamelijk gebruikt voor	Beschrijving	Expressie	Aanvullende overwegingen
T7	in vitro transcriptie/ algemene uitdrukking	Promotor van bacteriofaag T7	Constitutieve, maar vereist T7 RNA-polymerase.	bij gebruik voor in vitro transcriptie stuurt de promotor de sense-of antisense-transcript aan, afhankelijk van de oriëntatie op uw gen.
T7lac	hoge niveaus van genexpressie	promotor van T7 bacteriofaag plus Lac operators	verwaarloosbare basale expressie wanneer niet geïnduceerd. Vereist de polymerase van T7 RNA, die ook door Lac-exploitant wordt gecontroleerd. Kan worden geïnduceerd door IPTG.	vaak gevonden in pET-vectoren. Zeer strak geregeld door de Lac operators. Goed voor het moduleren van genexpressie door gevarieerde inductorconcentraties.
Sp6	in vitro transcriptie / algemene expressie	promotor van SP6 bacteriofaag	constitutief, maar vereist SP6 RNA-polymerase.	SP6-polymerase heeft een hoge processiviteit. Wanneer gebruikt voor in vitro transcriptie, de promotor drijft ofwel de sense of antisense transcript afhankelijk van de oriëntatie op uw gen.
araBAD	Algemene expressie	promotor van het arabinose metabole operon	Induceerbaar door arabinose en onderdrukte kataboliet onderdrukking in aanwezigheid van glucose of door competitieve binding van de anti-inductor fucose	zwakker. Vaak gevonden in pBAD-vectoren. Goed voor snelle regulatie en lage basale expressie; echter niet geschikt voor modulerende genexpressie door gevarieerde inductorconcentraties.
trp	hoge concentraties genexpressie	promotor van E. coli tryptofaan operon	Repressible	wordt uitgeschakeld bij hoge concentraties cellulaire tryptofaan.
lac	Algemene expressie	promotor van lac operon	constitutief bij afwezigheid van Lac-onderdrukker (lacI of lacIq). Kan worden geïnduceerd door IPTG of lactose.	lekkende promotor met enigszins zwakke expressie. laciq-mutatie verhoogt de expressie van de onderdrukker 10x, waardoor de regulatie van lac-promotor wordt verkort. Goed voor het moduleren van genexpressie door gevarieerde inductorconcentraties.
PTAC	Algemene expressie	hybride promotor van lac en trp	gereguleerd als de Lac-promotor	bevat -35 regio van trpB en -10 regio van lac. Zeer strenge regelgeving. Goed voor het moduleren van genexpressie door gevarieerde inductorconcentraties. Over het algemeen een betere uitdrukking dan lac alleen.
pL	hoge niveaus van genexpressie	promotor van bacteriofaag lambda	kunnen temperatuurregelbaar zijn	vaak gecombineerd met de temperatuurgevoelige ci857-repressor.
T3	in vitro transcriptie/algemene uitdrukking	Promotor van T3 bacteriofaag	Constitutieve, maar vereist T3 RNA-polymerase	Wanneer gebruikt voor in-vitro transcriptie, de promotor-stations over de zin OF antisense transcript afhankelijk van de oriëntatie van uw gen

Hoewel deze lijst is een geweldige plek om te beginnen, de bovenstaande tabellen niet dieper in het weefsel of de ontwikkeling van specifieke promoters die beschikbaar is voor wetenschappers. Plasmiden worden vaak gebruikt voor therapeutisch gebruik, en in die gevallen is het belangrijk om de juiste weefsel-specifieke promotors te identificeren zoals beschreven door onderzoekers bij de NIH hier.

opmerking: A. Max Juchheim heeft bijgedragen aan het schrijven van dit artikel.