VETERINARY MICROBIOLOGY
Identification of Clostridium chauvoei in clinical samples cultures from blackleg cases by means of PCR
Kod Clostridium chauvoei w materiały paszowe przypadkach klinicznych objawowe carbuncle za pomocą PCR
S. MiyashiroI,*; A. F. C. NassarI; M. C. A. M. SouzaI; J. B. CarvalhoI; J. E. B. AdegasII
IInstituto Biológico, São Paulo, SP, Brasil
iimato Grosso Do Sul, Brasil
streszczenie
obecność C. chauvoei wykryto za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) z supernatantu hodowli w pożywce z gotowanego mięsa w próbkach szpiku wątrobowego, mięśniowego i śródstopia siedmiu cieląt z objawami czarnej nóżki. Izolacja w warunkach beztlenowych jednej próbki mięśniowej ujawniła Clostridium perfringens w czystej hodowli.
słowa kluczowe: Clostridium chauvoei; blackleg; bovine; PCR.
podsumowanie
stwierdzono obecność Clostridium chauvoei poprzez reakcję PCR z hodowli w cooked meat medium próbek wątroby, mięśni i szpiku kostnego metatarsiana siedmiu cieląt; z objawowy karbunkuł. Izolacja próbki mięśni w warunkach beztlenowych wykazały Clostridium perfringens w czystej hodowli.
słowa kluczowe: Clostridium chauvoei, objawowy karbunculus, cielęcina, PCR.
Clostridium spp jest jednym z rodzajów, które obejmują grupę bakterii beztlenowych o znacznym znaczeniu medycznym i ekonomicznym. Clostridiosis jest ogólną nazwą nadaną różnym chorobom wywołanym przez bakterie tego rodzaju, które mogą wystąpić w dowolnej części ciała, która stwarza warunki do ich rozwoju, a w konsekwencji wytwarzanie toksyn podczas namnażania (1).
Clostridium chauvoei jest czynnikiem sprawczym czarnej i złośliwej obrzęku u bydła, owiec i innych przeżuwaczy (4). Blackleg u bydła jest nietraumatyczną infekcją endogenną, a znaczna część bydła może zawierać C. chauvoei w wątrobie. Dotknięte zwierzęta są anorektyczne, przygnębione, gorączkowe i kulawe (jedna kończyna boczna), prezentując gorący, bolesny obrzęk, który staje się zimny, obrzęk z krepitacją. Śmierć następuje w ciągu 12 do 48 godzin. Wydaje się, że ten agent preferuje duże mięśnie (udo, przeponę i serce), które podczas sekcji są ciemne, czerwone, suche i gąbczaste (11). Objawy przypominające czarnoziem mogą być również wywołane przez Clostridium septicum, C. novyi, C. perfringens lub C. sordellii. W ostatnich badaniach nad pozycją filogenetyczną C. chauvoei i C. septicum na sekwencjach genu 16S rRNA (rrs) określono podobieństwo 99,3% pomiędzy genami RRS C. chauvoei i C. septicum, które również znajduje odzwierciedlenie na poziomie fenotypowym (7,8).
chociaż wstępne rozpoznanie obrzęku czarnego i złośliwego zależy od wyników klinicznych i patologicznych, potwierdzenie choroby zwykle znajduje się poprzez izolację i identyfikację organizmu, takie jak wytwarzanie toksyn i metody immunologiczne (9,13). Jednak te metody diagnostyczne są czasochłonne i pracochłonne. Ponadto metody immunologiczne mogą dawać niejednoznaczne wyniki, ponieważ C. chauvoei i C. septicum mają wspólne różne antygeny (4).
amplifikacja kwasu nukleinowego specyficznego regionu docelowego genomu bakterii za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) jest szeroko stosowana do celów wykrywania i diagnostyki (15). Zdolność PCR do amplifikacji DNA specyficznie z małej liczby bakterii, jak również jego prostota, szybkość i odtwarzalność, oferuje przewagę nad konwencjonalnymi metodami identyfikacji i została faktycznie wykorzystana do identyfikacji wielu gatunków Clostridium, w tym C. chauvoei w czystych kulturach i próbkach klinicznych (5,7,12,14). Dokładna diagnoza blackleg jest więc często trudna. Standardowa diagnoza opiera się na teście immunofluorescencyjnym i kryteriach morfologicznych.
w niniejszym artykule opisujemy metodę opartą na PCR z wcześniejszego wzbogacenia gotowanego pożywki mięsnej próbek cieląt z czarną nogą w celu identyfikacji C. chauvoei. Analizowano próbki wątroby, mięśni i szpiku śródstopia cieląt, u których podczas brazylijskiej jesieni występowały objawy czarnej nóżki. Pobrane próbki pochodziły od sześciu cieląt ze stada ze stanu São Paulo i jednego cielęcia ze stanu Mato Grosso Do Sul (Tabela 1). Wszystkie te bydlęta nagle padły i pojawiły się krepitacje mięśni w tylnej kończynie.
macerowane próbki wątroby i mięśni oraz wymazy ze szpiku kostnego zaszczepiono do probówek z gotowanym pożywką mięsną (Difco ®), które tuż przed poddano szokowi termicznemu (100ºC przez 10 minut natychmiast ochłodzono w bieżącej wodzie), a następnie inkubowano w temperaturze 37ºC przez 48 godzin. Dziesięć mikrolitrów gotowanego pożywki mięsnej hodowano w 5% agarze krwi owczej i inkubowano w temperaturze 37ºC przez 48 godzin w warunkach beztlenowych. Kolonie o charakterystycznej formie, aspekcie, barwie i hemolizie poddano barwieniu grama w celu określenia morfologicznego i komórkowego muru. Podejrzane Izolaty poddano testom katalazy, lecytynazy, żelatynazy, glukozy, laktozy i krzepnięcia mleka w celu identyfikacji płci i gatunku bakterii.
uzyskano technikę opartą na Tyocjanianie guanidyny (2) do ekstrakcji DNA z supernatantu probówek z gotowanym pożywką mięsną. Jeden mL każdej probówki odwirowywano z prędkością 13000 X G przez 20 minut, a osad ponownie zawieszono w 200 µL buforu Tris-EDTA przed protokołem ekstrakcji. Multiplex PCR przeprowadzono z użyciem starterów zaprojektowanych dla genu flageliny (fliC), opisanych przez SASAKI i wsp. (10), specyficzne dla Clostridium chauvoei i Clostridium septicum, które wzmacniają odpowiednio 535 par zasad (bp) i 294 bp. Przednia klapa startowa jest wspólna dla obu gatunków, a FlachR i FlaseR są odpowiednio starterami odwrotnymi dla C. chauvoei i C. septicum. Amplifikację DNA przeprowadzono w całkowitej objętości 50 µL, z 200 µM każdego dNTP, 5 µL buforu reakcyjnego 10X, 2,5 mM MgCl2, 30 pmol każdego startera (FlaF – 5′ AGAATAAACAGAA GCTGGAGATG 3′ , FlachR – 5′ TACTAGCAGCATCAAAT GTACC 3′ i Flase R – 5′ TTTATTGAATTGTGTTTGTGAAG 3′), 1,25 u polimerazy Taq i 10 µl dna. Do wzmocnienia użyliśmy trzydziestu cykli podzielonych na trzy fazy w następujący sposób: denaturacja w temperaturze 94ºC przez 60 sekund, hybrydyzacja w temperaturze 56ºC przez 60 sekund i przedłużenie w temperaturze 72ºC przez 60 sekund. C. chauvoei IB 1559 i C. septicum 10518 (szczepy Instituto Biológico) zostały użyte jako kontrola dodatnia PCR, a próbka mięśni z normalnej krowy została użyta jako kontrola ujemna PCR.
PCR stosowano również bezpośrednio z próbek klinicznych (wątroba, mięśnie i szpik kostny) przy użyciu tych samych protokołów ekstrakcji i amplifikacji DNA, o których mowa powyżej. Amplifikacje przeprowadzono w cyklu termicznym Peltiera-100 (Badania MJ), a analizę amplifikowanych produktów przeprowadzono elektroforezą w żelu agarozowym 1,3% barwionym bromkiem etydyny.
w większości próbek (wątroba 1, mięśnie 1,2 i 7 oraz kości 3,4 i 5) wykryto małe pręciki gram-dodatnie z subterminalnymi zarodnikami (wątroba 1, mięśnie 1,2 i 7 oraz kości 3,4 i 5). Jednak tylko w próbce mięśni 7 wyizolowano Clostridium perfringens w czystej hodowli, a w innych próbkach nie zaobserwowano wzrostu płytek inkubowanych w warunkach beztlenowych. Multiplex PCR z próbek klinicznych nie wykazał pozytywnego wyniku ani dla C. chauvoei ani C. septicum. Jednakże w reakcji supernatantu z gotowanego pożywki mięsnej zaszczepionej tymi samymi próbkami, siedem z nich było dodatnich dla C. chauvoei i ujemnych dla C. septicum (wątroba 1, mięśnie 1,2 i 7, Kości 3,4 i 5), Jak pokazano w tabeli 1.
bliskie pokrewieństwo filogenetyczne C. chauvoei i C. septicum jest molekularnym odzwierciedleniem fenotypowego podobieństwa tych organizmów. C. chauvoei jest stosunkowo trudny do odróżnienia od C. septicum, a poza tym C. septicum może powodować objawy bardzo podobne do objawów blackleg (6,9).
(3) zgłosiło występowanie i leczenie bydła czarną nogą wysokimi dawkami penicyliny. Rozpoznanie uzyskano poprzez izolację C. chauvoei z wymazu z obszaru martwicy mięśni i szczepienie świnek morskich w celu jego identyfikacji.
KUHNERT i in. (7) zgłoszono system rozróżniania C. chauvoei i C. septicum, jednak wymaga on ograniczenia trawienia enzymatycznego produktów PCR w celu ostatecznej identyfikacji organizmu ze względu na niewielką różnicę w genie 16S rRNA obu bakterii.
nasze wyniki pokazują, że reakcja Multiplex PCR oparta na Genie fliC (10) była skuteczna w identyfikacji C. chauvoei z naturalnie zainfekowanych próbek hodowanych w gotowanym pożywce mięsnej, uzyskując tiocyjanian guanidyny do ekstrakcji DNA i odróżniając ten gatunek od C. septicum. Jednak wyniki PCR bezpośrednio z próbek tkanek były negatywne, prawdopodobnie ze względu na małą liczbę mikroorganizmów clostridial lub nieefektywny protokół ekstrakcji DNA.
izolacja C. chauvoei jest bardzo trudna, ponieważ wymaga trudnych warunków beztlenowych, a próbki kliniczne są często zanieczyszczone innymi bakteriami beztlenowymi, w tym clostridia w glebie, które rosną szybciej niż C. chauvoei w pożywce hodowlanej (9). Hodowla mikrobiologiczna mięśnia 7 ujawniła Clostridium perfringens wyizolowane w czystej hodowli w warunkach beztlenowych. Gatunek ten może być również zaangażowany w przypadki czarnoziemów, a w obecnym badaniu może być związany z C. chauvoei. W każdym razie, gdyby w tym przypadku zastosowano tylko Metody mikrobiologiczne, diagnoza blacklega byłaby błędna lub niekompletna. Szczepionki Clostridial zapewniają wysoki stopień odporności przeciwko chorobom clostridial, a gdy diagnoza jest prawidłowa, choroba może być łatwo kontrolowana. W tym celu próbki kliniczne muszą być odpowiednio pobrane i poddane badaniom laboratoryjnym. Gdy wszystkie choroby spowodowane clostridia można zapobiec przez szczepienie, jeśli problem nadal pomimo szczepienia, diagnoza musi być błędna. Ponadto opis przypadku ma fundamentalne znaczenie dla przeprowadzenia analizy laboratoryjnej (1).
Zakażenia wywołane przez mikroorganizmy clostridia powodują znaczne straty w produkcji, gdy leczenie jest na ogół niewykonalne. Kontrola i zapobieganie muszą obejmować odpowiednie środki postępowania ze stadem i szczepienia siostrzane, ponieważ zwierzęta są w stałym kontakcie z czynnikami i czynnikami, które będą w stanie usunąć choroby.
wykrycie kwasu nukleinowego C. chauvoei z wcześniejszego wzbogacenia naturalnie zakażonych próbek w gotowanym pożywce mięsnej wyjaśniło diagnozę w tych dwóch brazylijskich ogniskach blackleg, które zwykle pozostają niejednoznaczne z powodu ograniczenia hodowli mikrobiologicznej. Ponadto, ze względu na wysoką specyficzność techniki PCR, unika się stosowania świnek morskich do identyfikacji czynnika.
1. Baldassi, L. (2005). Toksyny Clostridial silne trucizny, silne leki. J. Venom. Anim. Toksykologia. Trop. Dis., 11(4), 391-411.
2. Boom, R.; Sol, C. J. A.; Salimans, M. M. M.; Jansen, C. L.; Werthein-Van-Dilen, P. M. E.; Noordaa Van Der J. (1990). Szybka i prosta metoda oczyszczania kwasów nukleinowych. J. Clin. Microb., 28, 495-503.
3. Gregory, L.; Della Libera, A. M. M.; Birgel Junior, E. H.; Pogliani, F. C.; Birgel, D. B.; Benesi, F. J.; Miyashiro, S.; Baldassi, L. (2006). Carbunculus objawem: pojawienie się, ewolucja kliniki i monitorowanie odzysku i cielęciny zachorował „manqueira”. Arq. Inst. Biol., 73(2), 243-246.
4. Hamaoka, T.; Terakado, N. (1994). Demonstration of common antigens on cell surface of Clostridium chauvoei and Clostridium development by indirect immunofluorescence assay. J. Vet. Med. Sci., 56, 371-373.
5. Kojima, A.; Uchida, I.; Sekiaki, T.; Sasaki, Y.; Ogikubo, Y.; Tamura, Y. (2001). Szybkie wykrywanie i identyfikowanie Clostridium chauvoei metodą PCR na podstawie sekwencji genu flagellina. Weterynarz. Microb., 78, 363-371.
6. Kuhnert, P.; Capaul, S. E.; Nicolet, J.; Frey, J. (1996). Pozycje filogenetyczne Clostridium chauvoei i Clostridium septicum oparte na sekwencjach genu 16S rRNA. Int. J. Syst. Bact., 46(4), 1174-1176.
7. Kuhnert, P.; Krampe, M.; Capaul, S. E.; Frey, J.; Nicolet, J. (1997). Identyfikacja Clostridium chauvoei w kulturach i materiale klinicznym z blackleg przy użyciu PCR. Weterynarz. Microb., 51, 291-298.
8. Moussa, J. (1959). Wzory antygenowe dla Clostridium septicum i Clostridium chauvoei.J. Path. Bac., 7, 341-350.
9. Sasaki, Y.; Kojima, A.; Aoki, Hiroshi; Ogikubo, Y.; Takikawa, N.; Tamura, Y. (2002). Analiza filogenetyczna i wykrywanie PCR Clostridium chauvoei, Clostridium haemolyticum, Clostridium novyi typów a i B oraz Clostridium septicum w oparciu o Gen flagellin. Weterynarz. Microb., 86, 257-267.
10. Sasaki, Y.; Yamamoto, K.; Kojima, A.; Norimatsu, M.; Tamura, Y. (2000). Szybka identyfikacja i różnicowanie patogennych clostridia w gazowej gangrenie przez reakcję łańcuchową polimerazy w oparciu o Region dystansowy 16S – 23s rDNA. Res.Vet. Sci., 69, 289-294.
11. Sippel, W. L. (1982). Diagnostyka chorób Clostridialnych. J. Am. Weterynarz. Med. Assoc., 161, 1299-1305.
12. Uzal, F. A.; Plumb, J. J.; Blackall, L. L.; Kelly, W. R. (1997). Wykrywanie Clostridium perfringens wytwarzających różne toksyny w face kóz metodą PCR. Lett. App. Microb., 25, 339-344.
13. Vanelli, S. A.; Uzal, F. A. (1996). Clostridium septicum wykrywanie metodą peroksydazy-antyperoksydazy (PAP), w utrwalonych formalinie, osadzonych parafinowo tkankach owiec. Arch. Med. Weterynarz., 28, 125-127.
14. Warren, A. L.; Uzal, F. L.; Blackall, L. L.; Kelly, W. R. (1998). Wykrywanie metodą PCR Clostridium perfringens typu D w tkankach kóz i owiec osadzonych formaliną i parafiną. Lett. App. Microb., 29, 15-19.
15. Whelen, A. c.; persing, d. h. (1996). Rola amplifikacji i detekcji kwasów nukleinowych w klinicznym laboratorium mikrobiologicznym. Ann. Rev.Microb., 50, 349-373.