Resultater Og Diskusjon
Under vår studie AV DNA-skadesignalering (32, 33) observert vi to fremtredende bånd I chk1 immunobloter: Chk1-båndet ved 56 kDa og et raskere migrerende bånd på 43 kDa. Det raskere migrerende båndet ble detektert Av Chk1-antistoffer som var reaktive mot det interne kinasedomenet eller C-terminalsekvensen, men ikke Av chk1-antistoffer som gjenkjente N-terminusen (Fig. 1A). Dette bandet ble ikke gjenkjent Av Det G4 monoklonale antistoffet Fra Santa Cruz Biotechnology som vanligvis brukes til immunoblotanalyse Av Chk1 (24, 29). Knockdown Av Chk1 via siRNA førte til at Både Chk1 og 43-kDa-bandet forsvant, noe som ytterligere bekreftet deres relevans (Fig. 1B). 43-kda-proteinet ble ikke påvirket av proteasom – og proteasehemmere (Si Vedlegg, Fig. 1), øker muligheten for at det kan være en alternativ spleisevariant Av Chk1. National Center For Biotechnology Information database viser for tiden tre alternativt spleiset human Chk1 mrna som har varierende uoversatte regioner, men koder for det samme Full lengde Chk1 protein av 476 aminosyrer (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1111). Imidlertid foreslo vår analyse ved HJELP AV EN EST-basert alternativ spleising prediktiv database (http://genome.ewha.ac.kr/ECgene) muligheten for en unik spleisevariant Av Chk1 der exon 3 alternativt spleises eller slettes. For å teste denne muligheten direkte, utførte VI RT-PCR ved hjelp av primere i Chk1-kodingssekvensen (Fig . 1C). RT-PCR ved hjelp av primersettet P1, der den fremre primeren ble designet innenfor exon 3, genererte en enkelt amplicon av forventet størrelse, mens RT-PCR med P2 eller P3 primersettet (begge basert på sekvenser flankert exon 3) genererte to amplicons, en med forventet Størrelse På Chk1 og den andre ∼200 bp kortere (Fig. 1C). Sekvensering bekreftet at lengre amplicon var Faktisk Chk1 og, spesielt, kortere amplicon var en alternativ skjøtevariant Av Chk1 mangler exon 3 (Fig. 1d Og SI Vedlegg, Fig. 2A). Denne spleisevarianten ble spådd å oversette til En n-terminalt avkortet form Av Chk1 bestående av 382 aminosyrer som vi kalte Chk1-kort eller Chk1-S (Fig. 1d Og SI Vedlegg, Fig. 2). I gelelektroforese migrerte in vitro oversatt Chk1-S på samme måte som 43-kda-proteinet fra HEK293-celler(Fig. 1E). Vi immunopresipiterte videre 43-kda-proteinet FRA HEK293-cellelysatet for massespektrometri og bekreftet dets identitet Som Chk1-S. N-terminal trunkering I Chk1-S er i samsvar med immunoblot-resultatene som viser at det ikke ble gjenkjent av antistoffene som reaktive Til Den N-terminale sekvensen Av Chk1 (Fig. 1A). Sanntids-OG RT-PCR-analyse oppdaget Chk1 – s mRNA-uttrykk i flere humane vev, og uttrykket er generelt høyere i føtalvev (Si Vedlegg, Fig. 3 A og D). Immunoblotanalyse oppdaget Videre Chk1 – s proteinuttrykk i humane, mus og rottecellelinjer, og også i humane føtalvev (Si Vedlegg, Fig. 3B) og mus primære renale tubulære celler (Si Vedlegg, Fig. 3C). CDNA I Full lengde Av Chk1-S ble også klonet fra tre normale humane vev (tymus, kolon, føtal lever) og sekvensert for å bekrefte at den koder For En n-terminalt avkortet spleisevariant Av Chk1. Sammen har disse forsøkene identifisert en unik spleisevariant Av Chk1 som Er n-terminalt avkortet og bredt uttrykt i pattedyrceller og vev.
Identifikasjon Av Chk1-S som en unik, n-terminalt avkortet spleisevariant Av Chk1. (A) HEK293-cellelysat ble analysert ved immunoblotting ved bruk av antistoffer som spesifikt gjenkjente N-endepunktet (α-chk1-NT), kinasedomene (α-chk1-KD) eller C-endepunktet For Chk1 (α-Chk1-CT). I tillegg til Chk1 ble et 43-kDa-protein avslørt av α-Chk1-KD og α-Chk1-CT, men ikke α-Chk1-NT. (B) HEK293-celler ble transfisert Med Chk1 siRNA (siChk1) eller en kryptert sekvens (siCon) i 48 timer for å samle helcellelysat for immunoblotanalyse ved bruk av α-Chk1-KD. siChk1 reduserte ekspresjonen av Både Chk1 og 43-kDa-proteinet. (C) RNA ble isolert fra HEK293-celler FOR RT-PCR ved hjelp av tre forskjellige sett med primere For Chk1: P1, P2 og P3 (relative sekvenssteder er vist i diagrammet). TO amplikoner ble detektert AV RT-PCR ved hjelp av primersettene flankerende ekson 3 (P2 Og P3), mens bare en amplikoner ble forsterket ved hjelp av primersettet P1, hvorav den fremre primeren var innenfor ekson 3 Av Chk1. (D) Skjematisk fremstilling av alternativ spleising Av Chk1 som resulterer I Et n-terminalt avkortet protein, Chk1-S. (E) Chk1-S ble klonet for in vitro oversettelse, og det oversatte proteinet sammen MED HEK293 cellelysat ble analysert ved immunoblotanalyse. In vitro oversatt chk1 migrert på samme måte som 43-kDa-båndet I HEK293-celler.
Hva er Funksjonen Til Chk1-S? Regulerer det cellesykluskontrollpunkter som Chk1? Med disse spørsmålene bestemte vi først tidsmessige og romlige uttrykksmønstre Av Chk1-S i cellesyklusen. HEK293-celler ble synkronisert ved G1 -, G1/S-eller G2/M-faser ved serum-sult, henholdsvis dobbel tymidinblokk eller nocodazol. Chk1-S var lav I g1-fase celler og høyere I g1/S og G2 / M celler (Si Vedlegg, Fig. 4 a og B). Videre, når cellene ble synkronisert Ved G1/s fase av dobbel thymidine blokk og deretter utgitt, både Chk1 Og Chk1-s uttrykk økt etter inn S fase (Fig. 2A). En tydelig forskjell Mellom Chk1 og Chk1-s uttrykk var at Mens Chk1 uttrykk toppet på midten av s fase, chk1-s uttrykk holdt økende fra s til m fase (Fig . 2A). Interessant nok ble høye Nivåer Av Chk1-s-uttrykk observert ved 7 h etter cellesyklusfrigivelse fra dobbel tymidinblokk, et tidspunkt da cellene ennå ikke var mitotiske (Si Vedlegg, Fig. 4C). Vi kvantifiserte Videre Chk1-S: Chk1-forholdet i asynkrone og s eller G2/M synkroniserte celler. Til tross for variasjonene Av Chk1 – s-ekspresjon i HEK293, U2OS Og primære renale tubulære celler, Var chk1-S:Chk1-forholdet over 1 i alle celler Ved g2 / m-fase (Si Vedlegg, Fig. 5). I asynkrone celler Var Chk1-S og Chk1 hovedsakelig lokalisert i kjernen (Si Vedlegg, Fig. 6A). Men i G2/m-fase celler, noen Chk1-S og Chk1 akkumulert i sentrosomer (Si Vedlegg, Fig. 6 B og C). Lokalisering Av Chk1 i sentrosomer er kritisk For sin g2 / M kontrollpunktfunksjon, der den forhindrer for tidlig aktivering Av Cdk1 og mitotisk oppføring (34, 35). Våre resultater indikerer At Chk1-S også kan lokalisere til sentrosomer, noe som gir en romlig og tidsmessig regulering Av Chk1 for å initiere mitotisk oppføring. Deretter bestemte vi effektene Av Chk1 eller Chk1-S overuttrykk I HEK293 og U2OS celler. Sammenlignet MED GFP-Chk1 induserte GFP-Chk1-S en fremtredende nukleær fenotype som ble preget av kjernekondensasjon og dannelse av mikronuklei og flere eller multiloberte kjerner (Fig. 2B). På tidligere tidspunkt viste de transfiserte cellene nukleær / kromatinkondensasjon preget av svak og punktat histon-H3 fosforylering (Fig. 2B), indikativ for tidlig mitotisk oppføring. Senere utviklet disse cellene mikronuclei eller multilobed kjerner, kjennetegn ved mitotisk katastrofe (Fig. 2B). Celletelling viste AT GFP-Chk1-S induserte kjernefenotypen i ∼20% AV u2os-cellene(Fig. 2C). Lignende effekter ble vist VED YFP-Chk1-S og Chk1-S-Myc (Fig. 2C), som indikerer at den observerte nukleare fenotypen ble indusert Av Chk1-S og ikke av fusjonsproteinetikettene. I kontrast ble for tidlig mitotisk oppføring ikke indusert Av Chk1 eller dens kinase-døde mutant Chk1-KD(Fig. 2C). Chk1-S induserte også den slående nukleare fenotypen i andre celletyper (Si Vedlegg, Fig. 7). Spesielt ble en lignende nukleær fenotype rapportert i celler og murine modeller som manglet en Eller begge Chk1 alleler (7, 36, 37), noe som tyder på At Chk1-S kan fungere som en endogen inhibitor Av Chk1. For ytterligere å teste denne muligheten genererte Vi tet-on U2OS cellelinjer som kan induseres til å uttrykke Chk1, Chk1-KD eller Chk1-S. cellene ble synkronisert Ved G1 / s-fase ved dobbel tymidinblokk, indusert av doxycyklin, og deretter frigjort i nocodazolholdig medium. Omtrent 80% Av Chk1-S-ekspresjonsceller gikk inn i mitose, mens ∼60% Av chk1 – ELLER Chk1-KD-ekspresjonsceller gjorde (Fig. 2D). Det er viktig at mens de fleste mitotiske celler i Chk1 – og Chk1-KD-ekspresjonsgruppene hadde 4n DNA, hadde ∼25% av mitotiske celler fra Chk1-S-ekspresjonsgruppen mindre ENN 4N DNA-innhold (Fig. 2D), indikativ for avvikende mitotisk oppføring i disse cellene uten fullføring AV DNA-replikasjon. I Tillegg resulterte Chk1-s overuttrykk i tidligere inntreden i mitose, som indikert ved utseendet av pH3-positive celler(Si Vedlegg, Fig. 8). Chk1 er en nøkkelregulator for mitotisk oppføring eller S-Til-G2 / M-overgangen i cellesyklusen. Ved å fosforylere CDC25A (indusere nedbrytning) og Wee1, Forhindrer Chk1 CDK1-aktivering og mitotisk oppføring (5, 15-20). Vi viste at induksjon Av Chk1-S av doxycyklin i tet-on U2OS-cellene resulterte i høyere NIVÅER AV CDC25A og lavere nivåer av fosfo-CDK1, noe som tyder på At Chk1-S antagoniserte Chk1 for å indusere mitotisk oppføring (Fig . 2E). Spesifikk knockdown Av Chk1-S via RNAi var ikke vellykket fordi Chk1 – s sekvensen er inneholdt I Chk1 mRNA. Imidlertid kan et antisensoligonukleotid komplementært til det unike ekson2-ekson4-krysset I Chk1-S spesifikt redusere Chk1 – s-uttrykket (Si Vedlegg, Fig. 9A). Chk1-S nedregulering markert redusert celleproliferasjon (Si Vedlegg, Fig. 9B). Interessant, Chk1-S nedregulering endret ikke signifikant cellesyklusprofilen (Si Vedlegg, Fig. 9C). Fordi Chk1 fungerer ved flere cellesykluskontrollpunkter (F.eks. G2/M, spindel, intra-S), Kan Chk1-S motvirke Chk1 for å lette cellesyklusprogresjon på flere steder. Som et resultat kan hemming Av Chk1-S bremse cellesyklusen i ulike faser og resultere i undertrykkelse av proliferasjon uten store endringer i cellesyklusfordelingen.
Regulering av cellesyklusen Ved Chk1-S. (A) HEK293-celler ble synkronisert med dobbel tymidinblokk og deretter frigjort i nocodazolholdig medium. (Venstre) Cellesyklusprofil analysert ved propidiumjodid (PI) farging og FACS analyse. (Høyre) Immunoblotanalyse Av Chk1 Og Chk1-S i cellelysatet samlet ved angitte tidspunkter etter frigjøring fra tymidinblokken. SOM asynkrone celler (B) u2os celler ble transfisert MED GFP-Chk1 ELLER GFP-Chk1-S (grønn), og deretter fast for immunfluorescens av fosfohiston H3 (rød) og nukleær farging Med Hoechst33342 (blå). (Øvre) Chk1-S, men Ikke Chk1, induserte for tidlig kromatinkondensasjon og svak pH3-farging (piler). (Lavere) på sent stadium viste Chk1-s-transfiserte celler egenskapene til mitotisk katastrofe, inkludert mikronuklei og multilobed kjerner (piler). (C) u2os-celler ble transfisert med de angitte gener, og celler med nukleær fenotype av for tidlig kromatinkondensasjon og mitotisk katastrofe ble talt. Data indikerer gjennomsnittlig ± SD; * P < 0,05 versus vektorgruppe. Resultatene viser at Chk1-S overuttrykk spesielt førte til atomfenotypen. (D) u2os-celler ble transfisert med de angitte gener, synkronisert med dobbel tymidinblokk, og frigjort i 7 h. cellene ble deretter løst for pH3 immunfluorescens og PI-farging og analysert AV FACS. Data indikerer gjennomsnittlig ± SD; * P < 0,05 versus vektorgruppe. Resultatene viser at Chk1-S spesifikt induserte prematur mitotisk oppføring uten fullføring AV DNA-replikasjon (celler med <4N DNA). (E) tet-on U2OS-celler ble indusert med eller uten doksycyklin. Cellene ble deretter synkronisert Ved s-fase ved dobbel tymidinblokk og frigjort i 7 timer. Helcellelysat ble samlet for immunoblotanalyse av de indikerte proteinene. Resultatene viser at indusert Chk1-s-uttrykk førte til en økning AV CDC25A og reduksjon av fosfo-CDK1, noe som bidro til tidlig mitotisk oppføring.
Hvordan motvirker Chk1-S Chk1? Vi antydet At Chk1-S kan samhandle Med Chk1 for å blokkere kinaseaktiviteten. Konsekvent, FLAGG-Chk1-S uttrykt I HEK293 celler coimmunoprecipitated med endogen Chk1 (Fig . 3A). Videre in vitro oversatt Myc-Chk1 Og Chk1-S coimmunoprecipitated (Fig. 3B), noe som tyder på en direkte chk1-Chk1-s interaksjon. Vi demonstrerte videre coimmunoprecipitation Av Chk1 Med N-terminal domenet, men Ikke C-terminal domenet, Av Chk1-S (Fig. 3C), noe som tyder på kravet Til Den n-terminale sekvensen I Chk1-S for samspillet med Chk1. Funksjonelt bestemte vi effekten Av Chk1-S på Chk1 kinase aktivitet. Chk1-Myc ble uttrykt og immunoprecipitert for in vitro kinase assay i fravær eller nærvær av renset Chk1-S. som vist I Fig. 3d, Chk1 kinase aktivitet ble delvis ennå signifikant undertrykt Av Chk1-S, men ikke av varme-denaturert Chk1-S. I kontrast, chk1-S ikke redusere Chk2 aktivitet, som har lignende substrat preferanser Som Chk1. Sammenlignet Med Chk1 mangler Chk1-s en del av kinase-domenet, inkludert ATP-bindingsstedet (Fig. 1D) og, som forventet, viste ikke signifikant proteinkinaseaktivitet(Fig. 3D). Chk1-S kan også undertrykke kinaseaktiviteten Til n-terminalt merket Chk1 (FLAG-CHK1) i en in vitro kinase-analyse (Si Vedlegg, Fig. 10). Disse resultatene antyder At Chk1-S kan hemme Chk1 via molekylær interaksjon. En nylig studie viste at vasking Av Chk1 immunoprecipitates med en strengere Radio Immuno-Precipitation Assay (RIPA) buffer kan øke Chk1 kinaseaktiviteten markant, noe som tyder på At Chk1 normalt hemmes av undertrykkende faktorer (29); identiteten til de undertrykkende faktorene er imidlertid ukjent. Vi bekreftet effekten AV RIPA buffervask, og spesielt viste vi videre at tilsetning av eksogen Chk1-S kunne reversere effekten AV RIPA buffervask på Chk1 kinaseaktivitet (Si Vedlegg, Fig. 11), noe som tyder På At Chk1-S kan være en av de viktigste endogene undertrykkende faktorene For Chk1.
Chk1-S interagerer Med Chk1 for å undertrykke kinaseaktiviteten. (A) HEK293-celler ble transfisert MED FLAGG-Chk1-S eller tom vektor for å samle lysat for immunoprecipitasjon (IP) ved bruk av ANTI-flagg-antistoffer. Immunoprecipitatene ble analysert for Chk1 og FLAG-CHK1-S ved immunoblotting ved bruk av henholdsvis ANTI-FLAGG Og Anti-n terminus Chk1 antistoffer. Resultatene viser co-IP AV FLAG-Chk1-S med endogen Chk1. (B) Chk1-Myc og Chk1-S ble produsert ved Hjelp Av TnT in vitro transkripsjon / oversettelse kit (Promega). (Venstre) in vitro produsert Chk1-Myc og Chk1-S vist ved immunoblotting. (Høyre) Chk1-Myc ble immunoprecipitert ved bruk av anti-Myc antistoffer etter inkubasjon med Eller uten Chk1-S. immunoprecipitatene ble analysert For Chk1-S og Chk1-Myc ved immunoblotting. Resultatene indikerer en direkte interaksjon Mellom Chk1 Og Chk1-S. (C) HEK293-celler ble transfisert Med Myc-merket Chk1 – S eller Dets c-eller N-terminale delesjonsmutanter for å samle lysat for immunoprecipitasjon ved bruk av anti-Myc-antistoffer. Immunoprecipitatene ble undersøkt for Tilstedeværelse Av Chk1. Resultatene viser coimmunoprecipitation Av Chk1 Med Chk1-S og Dens C-terminal delesjon mutant, men ikke med Sin N-terminal delesjon mutant. (D) HEK293-celler ble transfisert Med Myc-merket Chk1-S, Chk1 eller Chk2 for å samle lysat for immunoprecipitasjon ved bruk av anti-Myc-antistoffer. Immunoprecipitatene, som inneholdt Chk1-S-Myc, Chk1-Myc eller Chk2-Myc, ble inkubert med Eller uten Chk1-S i 1 time og deretter tilsatt til kinaseaktivitetsanalysen ved Bruk Av Chktid som substrat. Denaturert Chk1-S ble tilberedt ved koking. Data indikerer gjennomsnittlig ± SD; * P < 0,05 versus Chk1-Myc group. Resultatene viser at native Chk1-S kan spesifikt hemme Chk1. (E) HEK293-celler ble transfisert Med chk1-Myc eller chk1-Myc (S317A/S345A) mutant. Cellene ble deretter ubehandlet eller behandlet med 100 nM camptothecin i 2 timer for å samle lysat for immunoprecipitasjon med anti-Myc-antistoffer. Immunoprecipitatene ble analysert For Myc-Chk1, fosforylert (serin 345) Chk1 og Chk1-S ved immunoblotting. Chk1-inngang ble også verifisert i prøvene. Resultatene viser At Chk1-S coimmunoprecipitated eller assosiert med Chk1 i normale celler, og at foreningen ble redusert under camptothecin-indusert DNA-skade. Forbindelsen Mellom Chk1-S og chk1 (S345A/S317A) mutanten ble imidlertid ikke forstyrret under DNA-skade, noe som tyder på at fosforylering Av Chk1 ved S345 og S317 kan være nødvendig for dissosiasjon Av Chk1-S fra Chk1. (F) HEK293-celler ble cotransfected med enten Chk1-Myc + tom vektor eller Chk1-Myc + dn-ATR, etterfulgt av behandling med 100 nM camptothecin i 2 timer. Det cellulære lysatet ble samlet for immunoprecipitasjon med anti-Myc-antistoffer, etterfulgt av immunoblotanalyse av de angitte proteinene. Resultatene viser at camptothecin-indusert forstyrrelse Av Chk1-Chk1-s dissosiasjon avhenger AV atr og chk1 fosforylering.
I DNA damage response (DDR) aktiveres Chk1 markant via fosforylering ved rester Av s345 og s317 (7, 13, 38, 39). Til tross for anerkjennelse av betydningen Av s345 / S317 fosforylering, er det fortsatt uklart hvordan denne fosforyleringen aktiverer Chk1 (28-30). Vi viste At Chk1-s-uttrykket ikke endret seg vesentlig I DDR(SI Vedlegg, Fig. 12). Chk1-Chk1 – s-interaksjonen ble imidlertid svekket i DDR indusert av camptothecin, EN DNA-topoisomerase I-hemmer og DNA-skadelig middel (Fig. 3E). Spesielt var dissosiasjonen Av Chk1 Fra Chk1-S i DDR avhengig Av chk1 fosforylering Ved S345 / S317, fordi chk1 (S345A/S317A) mutanten ikke dissosierte fra Chk1-S under camptothecinbehandling (Fig. 3E). I DDR er Chk1-aktivering avhengig AV ATR-mediert fosforylering (7, 13, 14). Vi viste at hemming av ATR via en dominant-negativ mutant (DN-ATR)ikke bare undertrykte camptotecinindusert chk1-s fosforylering, men også forhindret Chk1-Chk1-s dissosiasjon (Fig. 3F). Tilsvarende ble Chk1 dissosiert fra Chk1-S under CISPLATIN-indusert DDR, og dissosiasjonen ble forhindret av dn-ATR (SI Vedlegg, Fig. 13). Sammen antyder resultatene at fosforylering Av Chk1 kan forstyrre samspillet med den endogene inhibitoren Chk1-S, noe som fører Til Chk1-aktivering I DDR.
identifikasjonen Av Chk1-S som en unik regulator av cellesyklusprogresjon og celleproliferasjon fikk oss til å undersøke uttrykket i kreftvev. På mRNA-nivået uttrykte de fleste kreftvev høyere nivåer Av Chk1 og Chk1-S enn normalt vev (Si Vedlegg, Fig. 14). Interessant nok viste testikkelkarsinomer en markert oppregulering Av Chk1-S, men ikke Chk1 (Fig. 4A). Spesifikk oppregulering Av Chk1-S ble ytterligere bekreftet ved immunoblotanalyse i testikkelkarsinomvev, spesielt i sent stadium kreftprøver (Fig. 4B). Som rapportert tidligere (5) hadde både normalt og malignt testikkelvev høye Nivåer Av Chk1-uttrykk. Økt ekspresjon Av Chk1-S ble også påvist under utviklingen av eggstokkreft (Fig. 4B). Det relativt høye nivået Av Chk1 og Chk1-s uttrykk i begge foster (Si Vedlegg, Fig. 3) og kreft (Fig. 4) vev antyder At Chk1-S kan akselerere cellesyklusprogresjon, fremme celleproliferasjon under disse forholdene.
Chk1-s regulering i kreft. (A) SANNTIDS PCR-analyse Av Chk1 og Chk1-S mRNA-uttrykk i normalt testikkelvev og testikkelkarsinomprøver, som viser regulering Av Chk1-S i testikkelkarsinomer. (B) Immunoblotanalyse Av Chk1 og Chk1-S i humant normalt testikkel-og testikkelkreft vev, som viser økt chk1-s uttrykk i sent stadium kreftvev. (C) Nakne mus ble injisert med 10 × 106 Tet-on mda-MB-231-celler som var doksycyklininducerbare for å uttrykke Henholdsvis Chk1, Chk1-KD eller Chk1-S. Etter at tumor ble etablert til ∼100 mm3, ble musene opprettholdt på drikkevann med eller uten doksycyklin. Tumorvolum ble målt ukentlig (vist for fjerde ukesverdier, n = 8). Data indikerer gjennomsnittlig ± SD. Resultatene viser at indusert ekspresjon Av Chk1-S, men Ikke Chk1 eller Chk-KD, hemmet tumorvekst. (D) Densitometri av immunoblot resultater av doxycyklin-indusert Chk1-Myc, Chk1-KD-Myc, og Chk1-S-Myc uttrykk i utskårne svulster (n = 3 for hver gruppe). Signalene ble normalisert Med Chk1-Myc (vilkårlig satt som 100). Data indikerer gjennomsnittlig ± SD. Resultatene viser at doxycyklin induserte lignende nivåer av uttrykk For Chk1-Myc, Chk1-KD-Myc og Chk1-S-Myc i svulstene. (E) Nakne mus ble injisert Med Chk1-s-induserbare celler for å etablere svulster og deretter opprettholdt på drikkevann med eller uten doksycyklin i 4 uker. Tumorvev ble samlet for immunoblotanalyse. Resultatene viser høyere CDC25A-uttrykk i tumorgenograftene med doxycyklinindusert Chk1 – s-uttrykk.
Vi undersøkte videre effekten av ektopisk Chk1 – s-uttrykk på xenograft-tumorvekst hos mus. Tumor xenografter ble etablert i nakne mus ved Bruk AV tet-on mda-MB-231 brystkreftcellelinjer som kan induseres av doksycyklin for å uttrykke Chk1, Chk1-S eller Chk1-KD. Induksjon Av chk1 eller Chk1-KD med doksycyklin påvirket ikke tumorvekst, men induksjon Av Chk1-S resulterte i en 40% reduksjon i tumorvolum (Fig . 4C). Chk1-s-indusert tumorvev viste også cdc25a-akkumulering, noe som indikerer hemming Av Chk1 (Fig. 4E). Selv om resultatene kan innebære en unik kreftstrategi, er den fysiologiske relevansen av tvungen overekspresjon av ektopisk Chk1-S fortsatt uklar. Disse resultatene gir imidlertid et bevis på prinsippet om at vippe chk1-Chk1-s-balansen kan føre til mitotisk katastrofe og reduksjon av celleproliferasjon.
observasjonen at Chk1-S overuttrykk reduserte xenograft tumorvekst (Fig. 4 C-E) virket motstridende til observasjonen at tumorprøver fra humane pasienter uttrykte relativt høye Nivåer Av Chk1-S for celleproliferasjon (Fig. 4 A og B Og Si Vedlegg, Fig. 14). For å forene disse dataene er det viktig å gjenkjenne forskjellene mellom eksperimentelle forhold. Relativt høyt Chk1-s-uttrykk i humane svulster kan tilskrives tilstedeværelsen av proliferative celler i disse vevene. Konsekvent Er Chk1-S også høy i føtal vev som er svært proliferative (SI Vedlegg, Fig. 3A). Viktigere, Chk1-s uttrykk i disse proliferative vev er midlertidig begrenset til slutten Av S til m fase(Fig. 2 Og Vedlegg, Fig. 4). Denne tidsmessige reguleringen kan sikre At Chk1-aktivitet hemmes etter (og først etter) fullføring AV DNA-replikasjon i s-fase for cellesyklusprogresjon til g2 / M-fase. Men når ektopisk Chk1-S blir tvunget til å overuttrykke i dyrkede celler eller xenograftumorer, forstyrres den tidsmessige begrensningen Av Chk1-s-uttrykk; Med andre ord Er Chk1-S høy gjennom hele cellesyklusen, inkludert s-fase, noe som resulterer i konstant blokkering Av Chk-1 og for tidlig mitotisk oppføring, noe som fører til mitotisk katastrofe og redusert celleproliferasjon.
til slutt har denne studien identifisert en spleisevariant Av Chk1, Chk1-S, som er en nøkkelregulator For Chk1 i normal cellesyklus og UNDER DDR (SI Vedlegg, Fig. 15). I den ikke-forstyrrede cellesyklusen øker Chk1-ekspresjonen ved s-fase, og noen Chk1-molekyler kan fosforyleres ved atr som forhindrer chk1-s-binding, noe som resulterer i høy Chk1-aktivitet og s-fase vedlikehold til fullføring AV DNA-replikasjon. I g2-fasen øker Chk1-s-uttrykket, og som rapportert (29) Reduseres chk1–fosforylering, noe som fremmer En chk1-Chk1-s-interaksjon for å undertrykke Chk1-aktivitet. Reduksjonen I Chk1-aktivitet Ved g2 / m-fase er kritisk for mitotisk oppføring. Under Betingelser Med Chk1-s induksjon eller overuttrykk, vil store mengder Chk1-S sekvestrere Chk1 og redusere kinaseaktiviteten under s-fasen, noe som resulterer i prematur mitotisk oppføring uten fullføring AV DNA-replikasjon, noe som fører til mitotisk katastrofe. UNDER DNA-skade fosforyleres Chk1, noe som resulterer i redusert chk1-s-binding, økt chk1-aktivitet Og g2 / M-arrest (Si Vedlegg, Fig. 11). Våre funn støtter» de-undertrykkelse » – mekanismen For Chk1-aktivering (29). Det er viktig At Chk1-S ser ut til å være en av de viktigste undertrykkende faktorene For Chk1-aktivitet. Ved å motvirke Chk1 kan Chk1-S akselerere cellesyklusen, noe som fører til økt proliferasjon i føtal-og kreftvev. Høye Nivåer Av Chk1 i prolifererende celler koordinerer s-fase og mitose, mens høye nivåer Av Chk1-S kan gi en kraftig bryter For s-Til-G2/m faseovergang. I motsetning til dette induserer tvungen overekspresjon Av Chk1-S ved høye nivåer, ubalansert Av Chk1, for tidlig mitotisk oppføring og celledød (Fig. 2) og undertrykker tumorvekst i tumor xenograft modeller (Fig. 4). Chk1 har blitt foreslått å være et effektivt terapeutisk mål i kreftbehandling, Og Chk1-hemmere blir evaluert i kliniske studier (40-43). Identifisering Av Chk1-S som en endogen inhibitor Av Chk1 kan åpne nye forskningsområder innen cellesyklusregulering, DNA-skaderespons og kreftbehandling.