mechanismen van chromosomale herschikking in het menselijk genoom

pathologische DSBs worden willekeurig gedefinieerd als DSBs die geen fysiologische doeleinden dienen en kunnen leiden tot celdisfunctie.

willekeurige DNA-breuken als gevolg van ioniserende straling of oxidatieve vrije radicalen

bij vele chromosomale herschikkingen lijken de DSB ‘ s bij één of beide genen willekeurig te zijn gelokaliseerd binnen grote gebieden van vele kilobasen. Willekeurige positionering en het schijnbare gebrek aan sequentiebereidheid wijzen op sequentiegebonden DSB-mechanismen zoals oxidatieve vrije radicalen, ioniserende straling of, minder vaak, spontane DNA-backbone hydrolyse.Ongeveer de helft van de natuurlijke ioniserende straling van het milieu is afkomstig van natuurlijke zware metalen van de aarde, zoals uranium, thorium en zelfs kalium. De andere helft van de ioniserende straling komt voort uit kosmische straling die niet volledig wordt geblokkeerd door de atmosfeer. In totaal, ongeveer 3 x 108 ioniserende straling deeltjes passeren elk van ons elk uur , produceren hydroxyl vrije radicalen uit water in hun kielzog. Dit kanaal van hydroxyl vrije radicalen veroorzaakt clusterschade op DNA, waardoor beide DNA-strengen worden gebroken.

ongeveer 0,1% van de zuurstof die we inademen wordt omgezet in vrije radicalen . Dit genereert 3 x1022 vrije radicalen per uur in ieder van ons, en deze schadelijke vrije radicalen worden verspreid over de 1014 cellen van het menselijk lichaam. Vrije radicalen veroorzaken voornamelijk enkelstrengige DNA-schade, maar twee in de buurt van dergelijke gebeurtenissen kunnen resulteren in een DSB.

RAG actie op cryptische RSS sites op off-target locaties op een sequentiespecifieke manier: V (D)J-type breaks

de RSS heptamer/nonamer consensus sequence is geenszins uniek voor de IG en TCR loci, en het RAG complex kan snijden op sites die wezenlijk verschillen van de 16 BP consensus . Het minimale motief voor lap nicking is alleen CAC. Aldus kan het RAGCOMPLEX bij RSS-als niet-plaatsen van de locus van de antigeenreceptor handelen, genoemd cryptic RSS (cRSS). Dit komt in veel van de herschikkingen voor die in menselijk T-cel acuut lymfoblastic lymfoom worden waargenomen . In deze gevallen, in plaats van de RAG complex koppelen een 12-RSS met een 23-RSS, een 12-RSS paren met een 23-cRSS of een 23-RSS paren met een 12-cRSS. We noemen deze pauzes V (D)J-type pauzes omdat ze plaatsvinden via hetzelfde mechanisme als normale V(D)J recombinatie, ongeacht het feit dat een van de plaatsen buiten de gebruikelijke antigenreceptorloci (dat wil zeggen, het is off-target).

RAG-actie bij DNA-bubbelstructuren en andere gebieden van heterologie op een structuurspecifieke manier

naast de sequentiespecifieke manier van snijden kan het RAG-complex ook op een structuurspecifieke manier nick maken op plaatsen waar de overgang van dsDNA naar ssDNA plaatsvindt, zoals aan de randen van DNA-structuren van de bubbel of zelfs mismatches met één basis . Dergelijke activiteit door het RAGCOMPLEX kan zijn ontstaan omdat het RAGCOMPLEX gewend is aan het creëren van haarspeldstructuren, wat aanzienlijke vervorming van DNA impliceert. Vandaar, om het even welk gebied van mismatch of slippen is een potentieel doel voor het stelen door het RAGCOMPLEX in lymfoïde cellen.

Rag-gemedieerde transpositie als mechanisme voor chromosomale herschikking

van 1998 tot 2007 stelden verschillende laboratoria voor dat het RAG-complex de botte RSS-bevattende uiteinden van V(D)J-recombinatie, de zogenaamde signaaleinden, zou kunnen inbrengen in nieuwe locaties in het genoom. Dit wordt genoemd RAG omzetting, en komt op een laag niveau voor gebruikend een verkorte vorm van de RAG proteã nen genoemd kern lompen (herzien binnen ). Nochtans, toonden de inspanningen om RAG-omzettingsgebeurtenissen in vivo te vinden aan dat deze veel minder gemeenschappelijk dan willekeurige integratie van DNA waren . Tot slot zijn er geen voorbeelden van menselijke lymfoïde maligniteiten (of een ander type van maligniteit) waar het genoom werd veranderd door een RAG transpositionele insertie van signaaleinden (of een andere schijnbare variant van een dergelijke transpositie).

AID action at off-target locations

zoals vermeld in de bovenstaande bespreking van klasse switch recombinatie, AID kan C converteren naar U of methyl C of T op elke regio van ssDNA. Dit schijnt om niet alleen bij de schakelaaropeenvolgingen en veranderlijke domeinen van IG loci voor te komen, maar ook op sommige pathologische plaatsen, zoals sommige oncogenes zoals c-myc . Wanneer gericht door hulp, kunnen deze gebieden puntmutaties of DSBs ondersteunen . AID action op de IgH switch region tijdens CSR en onafhankelijke AID action op het c-myc gen om een DSB te creëren worden verondersteld om de basis te zijn van de twee initiërende Dsb ‘ s in zowel muis als mens c-myc translocaties . Men kan pauzes van dit type beschouwen als MVO-type pauzes (zoals hierboven vermeld in de bespreking van klasse schakelaar recombinatie) of SHM-type pauzes, waar SHM verwijst naar hulp geïnitieerde gebeurtenissen van het type vergelijkbaar met wat normaal gebeurt in somatische hypermutatie.

vermeende gecombineerde werking van hulp en lompen op CpG-locaties: CPG-typeonderbrekingen

onlangs hebben we gemeld dat Dsb ‘ s op bepaalde loci in translocaties in het pro-B/pre-B – stadium-de Bcl-2 van t(14;18), de bcl – 1 van t(11;14) en E2A van t(1;19) – een sterke neiging hebben om op te treden bij de dinucleotidesequentie CpG.

de Bcl-2-translocatie is de meest voorkomende translocatie bij kanker en komt voor bij >90% van de folliculaire lymfomen en een derde van de diffuse grootcellige lymfomen. Vijftig procent van de pauzes bij het Bcl-2 gen komen voor binnen het belangrijke breekpuntgebied (MBR), dat een hotspot van 175 bp in de 3′ meest exon in het gebied is die 3 ‘ UTR coderen. Twee minder vaak gebruikte hotspots bevinden zich 18 en 29 kb verder distaal aan het Bcl-2 gen, 105 BP Bcl-2 intermediate cluster region (icr), en 561 BP Bcl-2 minor cluster region (mcr), respectievelijk. Elk van de CpG-sites binnen een van deze drie Bcl-2 translocatiezones kan een doel zijn voor een DSB . Dertien procent van de Bcl-2 translocatieonderbrekingen bevindt zich in het icr en 5% in het mcr.

het gebruik van CpGs is ook van toepassing op de grote translocatiecluster BCL-1, de locatie die betrokken is bij de translocatie t(11;14). De BCL-1 translocatie komt voor in bijna alle mantelcellymfomen, met 30% van de breuken die voorkomen in de 150 BP BCL-1 major translocation cluster (MTC).

CPG-type breuken komen ook voor bij een derde lymfoïde maligniteit, de t (1;19) in een klein percentage van pre-B ALLs, een translocatie die plaatsvindt tussen het Pbx1-gen en het E2A-gen. De onderbrekingen bij het E2A-gen komen in een streek van slechts 23 bp voor, en deze DSBs zijn ook beduidend rond CpG plaatsen geclusterd . Alle drie translocaties waarbij de Bcl-2, bcl-1 en E2A betrokken zijn, vinden plaats in het pro-B/pre-B-stadium van de B-celontwikkeling.

de bcl-2 MBR is reactief met een chemische sonde voor single-strandedness genaamd bisulfiet . Net als de bcl-2 MBR, is deze BCL-1 MTC relatief klein (150 bp) en beschikt over een soortgelijke reactiviteit aan bisulfiet . Deze zeer bisulfiet reactieve zones zijn rijk aan runs van Cs. Gebaseerd op cirkeldichroism, kristallografie van de Röntgenstraal, NMR, en chemisch het sonderen, neigen dergelijke looppas van Cs om een structuur van DNA goed te keuren die tussenpersoon tussen B-vormdna en A-vormdna is, genoemd b/a-tussenpersoon . De B / A-intermediaire structuur heeft snellere openings kinetiek, misschien verantwoordelijk voor een deel van de waargenomen toename in bisulfietreactiviteit. Dergelijke ongebruikelijke gebieden van DNA kunnen meer vatbaar zijn voor slippen gebeurtenissen, misschien veroorzaakt door de replicatie of transcriptie van DNA. Dit kan dan voor hun kwetsbaarheid in de analyses van de minichromosomal nieuwe combinatie verklaren .

de Cs van de CPG ‘ s in of direct grenzend aan deze B/A-intermediaire zones lopen een verhoogd risico om deaminatie te ondergaan . Deze deaminatie is niet van toepassing op alle Cs in de regio, maar alleen de Cs die zich binnen CpG-sites bevinden. Het enige onderscheidende kenmerk over dergelijke Cs binnen CpGs is dat zij door methyltransferase van DNA kunnen worden geméthyleerd. Wanneer reguliere Cs deamineren, worden ze u, wat resulteert in een U: G mismatch. Maar wanneer methyl Cs deaminaat, ze worden T, wat resulteert in een T: G mismatch. De reparatie van U: G mismatches is zeer efficiënt, maar de reparatie van T:G mismatches is niet efficiënt. In feite is de mismatchherstel van T:G zo inefficiënt, dat het verantwoordelijk is voor ongeveer de helft van de puntmutaties op het p53-gen in een breed scala van menselijke kankers. Deze T: G mismatch sites zijn altijd op CpG sites.

Wat veroorzaakt de breuk op deze T: G mismatch sites? Interessant is dat deze deaminatie bij deze lymfoïde translocatie hotspots lijkt voor te komen in de pre-B fase van differentiatie. Dit is het stadium van de celontwikkeling van B wanneer de nieuwe combinatie van D aan j het krachtigst voorkomt. Aangezien de translocaties bcl-2 en bcl-1 in dit stadium voorkomen, lijkt dit waarschijnlijk het stadium van de translocatie te zijn. We hebben aangetoond dat het RAG-complex een DSB kan veroorzaken op locaties met kleine bubbelstructuren en zelfs incongruenties met een enkel basispaar. (Zoals hierboven vermeld, weerspiegelt deze actie van het RAGCOMPLEX zijn structuur-specifieke nucleaseactiviteit, misschien een eigenschap die de structuur-specifieke acties van het RAGCOMPLEX tijdens de haarspeldvormingsstap van de recombinatie van V(D)J weergeeft. Daarom hebben wij voorgesteld dat het RAG-complex de DSB ‘ s op de locaties van T:G mismatch maakt .

als het RAG-complex de DSB ‘ s veroorzaakt op CpG-locaties, waarom komen dergelijke CPG-achtige breuken dan niet voor in pre-T-cellen, die ook het RAG-enzymcomplex tot expressie brengen? De cellijn van B drukt een cytidinedeaminase voor de recombinatie van de klassenschakelaar en somatische hypermutatie uit. Zoals hierboven vermeld, wordt dit enzym activatie-geïnduceerde deaminase (AID) genoemd. De hulp wordt uitgedrukt in B-cellen maar niet in andere somatische cellen. De hulp wordt hoogst uitgedrukt in cellen van B wanneer zij in de germinal centra zijn. Nochtans, is een laag niveau van hulpuitdrukking beschreven in pre-B cellen . Bovendien worden de cellen van B die enkel het beendermerg verlaten, genoemd overgangscellen van B, ook verondersteld om hulp uit te drukken . Daarom is er een periode waarin de cellen van B de recombinatie van V(D)J voltooien en hulp beginnen uit te drukken wanneer zowel hulp als het RAGCOMPLEX in de cellen van B aanwezig zijn. Er is aangetoond dat de hulp methylc naar T kan deamineren.daarom stellen wij voor dat de hulp waarschijnlijk verantwoordelijk is voor de mutatie van meC naar T op CpG-locaties in vroege B-cellen. De resulterende T: G mismatch wordt vervolgens gesneden door het RAG complex, wat resulteert in een DSB. Dit model verklaart drie pieken van translocatie binnen de bcl-2 MBR, die allemaal zijn gecentreerd op CpG-sites .

andere oorzaken van pathologische Dsb ‘ s met een onbekend mechanisme

bepaalde translocaties zijn sterk geassocieerd met behandeling met topoisiomeraseremmers type II . Na een dergelijke behandeling ontwikkelen sommige patiënten secundaire maligniteiten met deze karakteristieke translocaties. Topoisomerases in het algemeen maken enig – of dubbel-bundel onderbrekingen om DNA op te winden of af te wikkelen, dus hebben zij een nucleaseactiviteit als deel van hun functie. Na het wikkelen of afwikkelen van het DNA, sluiten ze normaal gesproken de breuk(en) opnieuw. Men heeft voorgesteld dat de onderbreking of de preventie van het opnieuw sluiten in stabiele breuken kan resulteren die in chromosomale herschikkingen worden gezien .

sommige DBB ‘ s ontstaan op plaatsen in de buurt van directe of omgekeerde DNA-herhalingen. Dergelijke herhalingen kunnen tot uitgegooide structuren van DNA leiden die gebieden van single-stranded DNA bevatten, die doelstellingen voor splitsing kunnen zijn. Het beste voorbeeld hiervan is de constitutionele translocatie t (11; 22) (q23;q11), die een At-rijk palindroom van enkele honderden basen bevat, met potentieel voor kruisvormige vorming.

combinatie van meerdere DSB-mechanismen binnen een herschikking

aangezien twee Dsb ‘ s nodig zijn om een translocatie te genereren, zijn de twee breuken vaak niet aan elkaar gerelateerd. In de translocaties bcl-2 en bcl-1 is de breuk op de IgH-locus bijvoorbeeld een breuk van het V(D)J-type die wordt gegenereerd door de sequentie-specifieke actie van het RAGCOMPLEX tijdens de recombinatie van V(D)J. (Men zou dit kunnen beschouwen als een mislukking in de voltooiing van het normale recombinatieproces van V(D)J .) Het DSB op de locatie bcl-2 of BCL-1 is een breuk van het CpG-type die naar verluidt te wijten is aan de sequentiële werking van de steun en de structuurspecifieke sloopactiviteit van het RAG-complex .

zelfs binnen een bepaalde locus kan er een breed scala aan DSB-mechanismen zijn. De SCL-en LMO2-loci ondersteunen voornamelijk zowel V(D)J-Type DSBs, maar een derde of meer van de DSBs zijn onverenigbaar met de sequentievereisten voor V (D)J-type DSBs, en deze kunnen te wijten zijn aan schade door vrije radicalen, ioniserende straling, of topo-isomerase storingen. De verschillende plaatsen binnen één enkele cel zijn daarom naar voren gebogen voor verschillende types van mechanismen DSB.

replicatie-geïnduceerde DSBs

tijdens DNA-replicatie kunnen verwijderingen optreden als gevolg van slippen van de synthetiserende streng op de template streng. Chromosomale herschikkingen die voorkomen op specifieke hotspots, hetzij bij kanker in somatische cellen of tijdens gametogenese / initiële ontwikkelingsafdelingen als constitutionele translocaties, worden terugkerende translocaties genoemd die bij veel patiënten kunnen worden waargenomen. Niet-herhalende translocaties zijn die welke op verschillende plaatsen van de ene patiënt aan de andere voorkomen maar een gen dat een ziekte veroorzaakt veranderen of inactiveren. In tegenstelling tot de terugkerende translocaties die we hierboven bij kanker hebben besproken, lijken de mechanismen die de bundeluitwisseling in niet-terugkerende translocaties veroorzaken template switching te impliceren tijdens replicatieve DNA-synthese. Deze malplaatjeschakelaars kunnen bij kleine gebieden van de opeenvolgingshomologie van DNA, zoals 5 bp voorkomen. Deze template switching wordt microhomology-mediated breakage-induced replicatie (MMBIR) of Fork Stalling and Template Switching (FoSTeS) genoemd. Voor niet-recurrent translocatieverbindingen die verscheidene lange stukken van opeenvolging van gebieden van het genoom impliceren die normaal van elkaar worden gescheiden, zijn de veelvoudige gebeurtenissen van de malplaatjeomschakeling voorgesteld als mechanisme .