키메라

당신이 제공 할 내용 1 부

• 계좌 번호.
• 40 개의 염색체를 가진 마이코 플라스마가없는 세포주.

우리가 할 것

• 우리는 세포주 당 약 50 개의 배반포를 주입 할 것입니다. 이 태어난 10 쥐 귀 착될 것 이다. 쥐의 세 강한 남성 키메라 될 것으로 예상된다. 우리는 입증 된 성공 기록을 가지고 있습니다.
• 우리는 이유(출생 후 3 주)까지 쥐를 수용 할 것입니다.

당신이 제공 할 것 2 부

• 당신은 이유 된 쥐를 수용 할 것입니다.

비용

• 129 세포주 당$3,300 및 기증자 여성의 비용;세포주 당$4,950 및 다른 유전 적 배경에 대한 기증자 여성의 비용.
• 지역 비주문 주문에는 마우스 포장 및 운송에 200 달러가 추가로 부과됩니다. 비 지역 주문은$200 및 운송 비용이 청구됩니다.연구자는 핵심에서 쥐를 받기 위해 기관으로부터 인공지능 연구기관 프로토콜이 필요하다. 이 프로토콜은 케이스 형질 전환 코어의 사용을 지정해야합니다. 동물의 재조합 유전자에 대한 검토는 형질 전환 코어에 대한 온라인 주문을 통해 제출 된 정보에 대해 수행되며,승인 된 경우 수정안으로 코어의 유전자 검사 프로토콜에 추가 될 것입니다. 주문서 제출 후 추가 정보를 얻기 위해 연락할 수 있습니다. 주사 개시 전에 승인이 필요합니다.

감사

• 우리는 당신이 세미나 및 출판물의 경우 형질 전환 및 타겟팅 시설을 인정 부탁드립니다.

타임 라인

• 세포 주사 날짜로부터,우리가 쥐를 당신에게 배달 할 수 있기까지 최소 6 주가 될 것입니다(임신 기간 동안 거의 3 주,이유 전 출생 후 성장 3 주 이상). 수컷 키메라가 번식하기에 충분히 오래되기 6 주 전에 또 다른 6 주가 될 것이고,최소 6 주 전에 자손이 유전자형에 젖어 생식계 전염을 테스트 할 것입니다-총 4 입니다.주입에서 세균 선 전송을 위해 테스트에 5 달.
• 주문 배치와 에스 셀 주입 사이의 현재(3/25/21)예상 시간은 8 주입니다. 주사 전 8 주 동안,키메라 요청은 체외출혈청 위원회에 의해 검토되고,체외출혈 세포는 해동되고 성장되고,생쥐는 주문되고 수신된다.

키메라 마우스 생성 성공률

코어는 세포주 당 평균 약 5 개의 키메라를 생성합니다.

시작
표적 돌연변이의 생식선 전염의 가능성은 이용 가능한 독립 세포주의 수에 따라 증가된다. 평균적으로,129 개의 유전 적 배경에있는 에스 세포주의 약 2/3 에서 3/4 가 생식 할 것입니다. 2014 년 12 월 15 일(토)~2015 년 12 월 15 일(일)~2015 년 12 월 15 일(일)~2015 년 12 월 15 일(일) 따라서 공용 리포지토리에서 대상 셀 라인을 구매하는 경우 129 배경에 3 개 이상의 올바른 대상 라인을 구입하고 4 개 이상의 라인을 구입하는 것이 좋습니다. 마찬가지로 129 라인에 대해 2 회 이상의 주사를 주문하고 57 라인에 대해 3 회 이상 주사하십시오. 조건부 대립 유전자를 가진 조직 특이 적 녹아웃 생성에 대한 에스 세포…에서 유컴밈,우리의 입문서를 참조하십시오.

자주 묻는 질문

키메라 란 무엇입니까?
전형적으로,키메라는 유전자-표적화 또는 유전자 포획된 세포주로부터 마우스를 생성하도록 구성된다. 숙주 배아에 주입 된 에스 세포는 키메라 로 알려진 모자이크 마우스를 발생시킵니다.
수컷 에스세포를 생략되지 않은 배반포에 주입한다. 숙주 배아가 여성이고 수컷 에스 세포가 생식 세포를 만들면 키메라는 종종 비옥 한 남성이 될 것입니다. 숙주 배아는 숙주 세포와 너무 강하게 경쟁하지 않는 균주에서 사용되며,두 가지 구성 요소(숙주 및 숙주 배아)는 유 전적으로 외투 색 유전자로 표시되어 동물에 대한 숙주 세포의 기여도를 쉽게 결정할 수 있습니다. 동물의 외투에 있는 에스 세포 자손의 비율이 높은 경우에,에스 세포가 배아발생 초기에 숙주 세포와 완전히 섞이기 때문에,에스 세포가 배우자에서 대표되기 확율은 또한 높습니다. 코트 컬러 마킹 시스템은 또한 키메라의 자손이 에스 세포 구성 요소 또는 숙주 배아 구성 요소에서 나온 경우 적절한 십자가를 사용하여 결정할 수 있습니다.
129 세포들은 갈색 외피 색을 발생시키는데,이는(야생형 아구 티)이기 때문이고,숙주 배아는 검은 색 외피 색을 발생시키는데,이는(열성 비아구 티)이기 때문이다. 이 세포들은 생쥐의 129 균주로부터 유래되었다;숙주 배아는 생쥐의 129 균주로부터 유래되었다. 이러한 키메라가 무아구티 생쥐에게 사육된다면,모든 갈색 자손(무아구티 생쥐)은 세포 유래 배우자로부터 발생해야 하며,갈색 자손의 50%는 녹아웃 대립 유전자를 가지고 있을 것으로 예상된다. 대안으로,돌연변이의 전염은 자손의 조직 분석 또는 남부 오점에 의해 직접 분석 될 수있다.2984 년 11 월 29 일,이 연구는 숙주 배아가 백색이고 백색이고 백색이고 백색이고 백색이고 백색이고 백색이고 백색이고 백색이고 백색이고 백색이고 백색이고 백색이고 백색이고 백색이고 백색이고 백색이고 백색이고 백색이고 백색이고 백색이고 백색이고 백색이고 백색이고 백색이고 백색이고 백색이고 백색이고 백색이고 백색이고 백색이고 백색이고 백색이고 백색이고 백색이고 백색이고 백색이고 백색이고 백색이고 백색이고 백색이고 백색이다. 이러한 키메라를 흰둥이로 번식시키는 것은 세포 구성 요소에서 검은 자손(에이/에이,티르/티르-2 제이)을 생성 할 수 있으며,그 중 50%는 돌연변이를 수행해야하며,흰 자손(에이/에이,티르-2 제이/티르-2 제이)은 숙주 배아 구성 요소에서.

표적 돌연변이를 전달할 가능성이있는 수컷 키메라는 교합 플러그 유전자형에 의해 식별 될 수있다.

기타 용도의 키메라
우리는 또한 응집 키메라와 이배 체성 치수체 키메라를 만듭니다. 두 개의 서로 다른 생쥐 균주의 두 개의 이식 전 배아가 결합되어 집합체 키메라를 형성합니다. 이 기술은 유전자 작용의 자율성 및 비 자율성 분석 및 기타 실험 목표를 위해 유전자 모자이크 배아를 생성하는 데 사용될 수 있습니다. 에 이배체 사배체 키메라,사배체 구성 요소는 주로 배아 유래 태반과 이배체 구성 요소의 대부분을 배아로 발생시킵니다. 이 유형의 키메라는 태반 또는 배아에서 유전자가 필요한지 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

왜 내 마우스는 재미있는 색상입니까?
일부 에스 세포주는 다음 세대에서만 자신을 드러내는 외투 색 대립 유전자에 대해 이형 접합체이다. 우리가 사용하는 세포는 흰둥이 궤적에서 이형 접합체이며,흰둥이의 친칠라 대립 유전자 사본 하나를 가지고 있으며 분홍색 눈 희석 궤적(피)에서 이형 접합체입니다. 번식 자손은 코트 색 대립 유전자의 구색에 따라,회색,갈색의 다른 음영,또는 노란색의 검은 색,다른 음영 마우스에 상승을 제공 할 수 있습니다.

생식선 전염을 보장하기 위해 무엇을 할 수 있습니까?
배양에서 최소한의 시간을 소비하고 정상적인 염색체 보체를 가지고 있으며 효모,박테리아 및 마이코 플라스마가없는 에스 세포로 생식선 전염을 극대화합니다. 당신이 당신의 기관에 당신의 조건 하에서 전송되는 알고 있는 세포주를 표적으로 하십시오. 유효한 가장 낮은 통행 수에 있는 어버이 세포주를 이용하십시오(가급적이면 통행 수 16 보다는 더 적은). 대상 라인이 배양 되는 시간을 최소화 합니다. 표적으로 한 세포주에는 염색체의 정상적인 수가 있다는 것을 확인하십시오. 마이코 플라스마에 대한 세포 라인을 테스트합니다. 이러한 모든 매개 변수가 당신의 호의에있는 경우에도 일부 셀 라인은 전송하지 않습니다. 최적의 조건 하에서도 표적 세포주의 3 분의 2 만이 생식계를 통해 전염됩니다. 그러므로,전송을 지키기 위하여 적어도 3 개의 독립적인 표적으로 한 세포주에 시작하십시오.

나는 약한 키메라/여성 키메라를 가지고있다. 그들은 녹아웃을 전송할 것인가?
약한 키메라와 암컷 키메라는 드물지만 돌연변이 대립 유전자를 전달할 수 있습니다. 표적 돌연변이를 전달할 가능성이있는 남성 키메라는 교합 플러그 유전자형에 의해 식별 될 수 있습니다. 여성 키메라의 약 10%만이 에스 세포 게놈을 전송,그들은 그렇게 할 때 그것은 단지 처음 몇 새끼에,그들의 남성 자손의 대부분은 그들을 불임 렌더링 성 염색체 이수성을 가지고(브론슨 외. 1995 년 92,3120).

왜 내 가장 강한 키메라가 죽었습니까?
사망률은 가장 좋은 세포주에서도,에스 세포에서 나오는 동물의 비율에 따라 증가 할 수 있습니다. 이 사망률은 주로 문화에서 발생한 후성 유전 학적 수차 때문입니다. 후성유전학적 수차는 생존하는 쥐의 후속 번식에 의해 수정되는 것으로 생각되며,비록 그렇지 않더라도,표적화된 궤적으로부터 무작위로 멀리 분리될 것이다.

내 돌연변이를 번식시키는 생쥐의 변종은 무엇입니까?
가능한 한 빨리 유전 적 다양성을 최소화하기 위해 키메라를 에스 세포와 같은 배경으로 번식시킵니다. 에스 세포가 129 인 경우,129 마우스에 키메라를 번식하고 돌연변이는 한 단계에서 129 근친 배경에 완전히있을 것입니다. 유전 연구에 대 한 가장 일반적인 근 친 배경입니다. 키메라를 건너서 쥐를 잡으십시오. 당신이 배경을 변경하고자하는 경우,표준은 선택의 근친 변형(약 2.5 년)에 9 직렬 십자가를 수행하는 것입니다. 9 세대에 대한 이론적 근거는 리 실버에 의해 여기에 설명되어 있습니다. 또는 마커 보조 백 크로스 또는 속도 선천성에 의해 세대 수의 약 절반이 필요합니다.최대 재생산을 위해,당신의 쥐를 씨디 1 과 같은 혈통 균주에 교차 시키십시오. 스위스 마우스에서 파생 된 유전자 변이의 높은 수준 및 강력한 재생산을 위해 선택 되었다.

유컴에서 조건부 대립 유전자를 가진 에스 세포
유컴에서 각 세포주는 물질 전달 계약을 완료해야합니다. 이 과정을 가능한 한 일찍 시작하십시오.
생쥐의 생성 시간과 실험용 생쥐를 생성하는 데 필요한 교차 횟수는 생쥐 유전학에 사용되지 않는 생쥐에게는 놀라운 시간으로 결합되므로 미리 계획하십시오. 생쥐의 생성 시간(성적으로 성숙한 성인에서 성적으로 성숙한 자손까지의 시간)은 약 3 개월입니다.
유컴 조건부 대립 유전자는 일반적으로 측면 카세트(“측면 카세트”카세트). 카세트에는 이 윤곽에 있는 대립 유전자에게 손실 의 기능 돌연변이를 만드는 카세트로 실제로 모든 접합을 기분 전환하는 결합 수락자가 있습니다. 조건부 대립 유전자를 생성 하기 위해 플 렛-측면 카세트 플 렛 표현 쥐를 교차 하 여 제거 해야 합니다. 이 시스템은 1999 년에 설립되었으며 1999 년에 설립되었습니다.
우리는 키메라 쥐를 만들기 위해 에스 세포를 숙주 배아에 주입 할 것이다. 거기에서,당신은 돌연변이(생식 전송)를 들고 마우스를 생성하는 마우스를 번식합니다. 이 창시자 세대의 마우스는 플레 페를 발현하는 마우스로 교차하여 조건부 대립 유전자를 생성하여 카세트를 제거 할 수 있습니다. 그런 다음 실험용 마우스를 생성하기 위해 몇 가지 더 십자가를 수행해야합니다.

1. 에스 세포 주사에서 성인 성적으로 성숙한 키메라 생쥐의 생성 시간(3 개월)입니다.
2. 키메라는 생식선(3 개월)에서 돌연변이를 확립하기 위해 야생형 마우스로 사육됩니다.
3. 이형 접합체 조건부 마우스는 동형 접합체를 발현하는 플레 페로 교차된다. 이 문제를 해결하려면 다음을 수행하십시오. (3 개월)
4. 이 조건부/+마우스는 야생형으로 교차하여 생식선에서 절제 된 대립 유전자를 확립하고 멀리 번식하고,이 조건부/+마우스(3 개월)에서 분자로 절제가 확인됩니다.
5. 조건부/+마우스는 동형 접합 조건부 대립 유전자 마우스(3 개월)를 만들기 위해 서로 자란다.
6. 조건부/조건부 마우스는 조직 특이 적-크리/조직 특이 적-크리,널/+마우스로 사육되어 실험 조직 특이 적-크리/오,조건부/널 마우스 및 대조 조직 특이 적-크리/오,조건부/+마우스를 만든다.

또한,플라,널,크레아 마우스를 얻을 필요가 있고,조직 특이 적-크레아/조직 특이 적-크레아,널/+마우스를 사육 할 필요가있다.
또한,조건부 대립 유전자는 그것이 크레아틴 절제술 전에 함수에서 야생형인지,그리고 크레아틴 절제술 후에 널인지를 결정하기 위해 분석되어야한다. 조건부 대립 유전자가 절제 전에 함수에서 야생 유형인지 확인하려면 조건부/조건부 및 조건부/널 돌연변이 체를 검사하여 표현형이 각각+/+및 널/+마우스와 동일한지 확인해야합니다. 절제 된 조건부가 널 대립 유전자인지 확인하기 위해 조건부는 생식선 크리 마우스로 교차되고 절제 된 조건부의 표현형이 널/무효 및/또는 단백질이 절제 된 조건부 대립 유전자에서 만들어지지 않았는지 테스트하기 위해 절제 된 조건부가 교차됩니다.
로사레포터와 같은 크레아틴 활성의 리포터,또는 더 이상적으로는,관심 단백질이 면역형광에 의해 표적 세포로부터 존재하지 않는다는 것을 직접 보여주는 것이 중요한 대조군이다. 에 노출 된 모든 세포에서 영구적 인 베타-갈 락토시다 제 발현을 생성합니다.
과도한 핵발현은 조건부 대립유전자의 기능과 무관한 표현형을 유발할 수 있는 염색체 파손을 초래할 수 있다. 따라서 크롬을 발현하지만 일부 유전자 기능(예:조건부/+)을 유지하는 형제 마우스는 중요한 컨트롤입니다.