염색질 면역 침지(칩)분석은 특정 단백질과 게놈 영역 간의 상호 작용에 대한 지식이 밝혀진 전사 조절 모니터링을위한 중요한 방법입니다. 이 경우,칩이 적절한 항체에 의해 세포 용해물로부터 단백질–유전자 복합체를 면역 침지 시키는데 사용된다. 면역 침전 된 복합체는 원심 분리에 의해 수집되고,단백질은 웨스턴 블롯과 같은 추가 분석을 위해 용출된다. 이 프로토콜은 빠르고 효율적인 방식으로 성공적인 칩 분석을 달성하기위한 상세한 절차를 제공합니다.
시약:
- 37% 포름 알데히드
- 1 미터 글리신
- 세포 용해 완충액:150 밀리미터,50 밀리미터,5 밀리미터,5 밀리미터,0.5%,1%트리톤 엑스-100,1 개의 단백질 분해 효소 억제제 칵테일.
- 4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4.
- 10% Chelex 100
Equipments:
- Sonicator
- Ultrasonic bath
- Rocking or shaking device
- Eppendorf tube rotator
- Refrigerated microcentrifuge
- Gel electrophoresis apparatus
- PCR apparatus
Steps:
Cross-link and cell collection
1. 1%에서 최종 농도를 얻기 위해 배양 배지당 27%37%포름알데히드를 첨가하고,흔들림 또는 흔들림 장치에서 천천히 흔들면서 실온에서 10 분 동안 세포를 배양한다.
2. 해소 간에 링크를 추가하여 141µL1M 글리신 per1mL 문화 중간를 얻을 최종 농도에서 125mM,배양 세포는 5 분간 실온에서.
3. 플로팅 셀의 경우:콜렛 셀을 15 밀리리터의 원추형 튜브에 넣고 2,000 밀리리터의 원추형 튜브에서 4,000 밀리리터의 원추형 튜브에서 5 분 동안 4,000 밀리리터의 원추형 튜브로 원심 분리합니다. 상청액을 버리고 차가운 핍박으로 세포를 두 번 씻으십시오.
5 단계로 건너뜁니다.
4. 접착 셀의 경우:매체를 제거하고 차가운 피브로 세포를 두 번 씻으십시오. 을 긁어 세포로에서 PBS15mL 원추형 튜브,분리기에서 2,000×g4°C for5min.
용해 및 초음파 처리
5. 상등액을 버리고 107 셀 당 1 밀리리터의 차가운 세포 용해 완충액을 추가하십시오. 펠렛을 여러 번 위아래로 피펫팅하여 다시 주입하고 얼음 위에서 10 분 동안 배양합니다.
6. 염색질을 0.5~1 킬로바이트 파편으로 깎는 초음파 처리. 거품을 피하고 얼음에 견본을 지키십시오.
노트:
- 초음파 처리 조건은 샘플 및 초음파 발생기 모델에 따라 최적화되어야합니다. 일반적으로 출력 6.0 에서 6 개의 15 초 펄스와 45 초 휴식 기간이 작동하는 것으로 밝혀졌습니다. 단편의 크기를 분석하기 위해 전단 염색질의 분취액에서 총 유전자의 작은 부피를 추출 한 다음 아가로 오스 겔(1~2%)을 분석합니다.
- 볼륨은 초음파 처리 효율을 유지하기 위해 1 밀리리터로 제안됩니다.
7. Centrifuge at12,000×g4°C 에서 10 분,그리고 유지 뜨.
8. 이동 0.5 미리리터 상청액 신선한 1.100000000000
면역 침강
9. 샘플에 관련 항체 또는 정상 이그 제그를 추가하고 실온에서 초음파 물 욕조에서 15 분 동안 배양한다.
노트:
- 항체가 생성 된 동일한 종에서 이그를 선택.
- 항체 및 항원에 따라 배양 시간이 최적화되어야 한다. 낮은 수준의 발현을 가진 항원의 경우,잠복기는 회전 플랫폼에서 밤새 4 에서 수행 될 수 있습니다.
10. 단백질 아-아가로오스 비즈 준비: 비드를 1 밀리리터의 용해 완충액(프로테아제 억제제 제외)으로 세 번 씻고 2000 에서 원심 분리기를 몇 초 동안 4 초 동안 원심 분리 한 다음 상청액을 폐기하십시오.
11. 비드를 용해 완충액으로 1:1 로 희석하고 샘플에 50,000,000 을 첨가하십시오.
12. 회전 플랫폼에서 30~45 분 동안 배양한다.
13. 2000 에서 1 분 동안 4000 에서 1 분 동안 4000 에서 1 분 동안 원심 분리 한 다음 상청액을 폐기하십시오.
14. 1 밀리리터의 용해 완충액(프로테아제 억제제 제외)으로 구슬을 네 번 씻고 상청액을 버립니다.
유전자 정제 및 분석
15. 세척 된 구슬을 100 으로 다시 넣으십시오.10%첼렉스 100.
16. 피펫을 몇 초 동안 위아래로 한 다음 샘플을 10 분 동안 끓입니다.
17. Centrifuge at12,000×g1min 실온에서,그리고 전송 상등액으로 신선 1.5㎖tube.
18. 정제 키트 또는 표준 페놀:클로로포름 추출 프로토콜을 사용하여 정제하십시오.
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