시약
시스플라틴 및 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐-테트라졸리움 브로마이드를 시그마 케미칼 코(시그마,세인트루이스,미주리,미국)로부터 구입하였다). 플라스틱 문화 재료는 벡 튼 디킨슨과 회사(프랭클린 호수,뉴저지,미국)에서 구입 했다. 본 연구에서는 생명 테크놀로지스(주)에서 유래한’둘베코’의 변성 필수배지,’태아 소 혈청’,’게이더스버그’등의 조직 배양 시약을 연구하였습니다. (게이 더스 버그,메릴랜드,미국). 또한,본 발명의 실시예에 따르면,세포질,세포질,세포질,세포질,세포질,세포질,세포질,세포질,세포질,세포질,세포질,세포질,세포질,세포질,세포질,세포질,세포질,세포질,세포질,세포질,세포질,세포질,세포질,세포질,세포질,세포질,세포질,세포질,세포질,세포질,세포질,세포질,세포질,세포질,세포질,세포질,세포질,세포질,세포질,세포질,세포질,세포질,세포질,세포질,세포질,세포질,세포질,세포질,세포질,세포질, (미네 아 폴리스,미네소타,미국). 이 항체는 1:200 농도의 면역 조직 화학에 사용되었습니다. 항체를 p-STAT4,STAT4,p-STAT6,STAT6,NF-kB(p65),그리고 IkB 에서 구입 한 Santa Cruz Biotech Inc. (산타 크루즈,캘리포니아,미국).
세포 배양 및 생존
설립 및 조건부로 불후의 청각 세포의 특성 우리의 이전 보고서 1 에서 설명 했다. 이러한 표식들은 다음과 같은 특정 표식들의 발현을 암시한다:헤이-옥-옥-옥-옥-옥-옥-옥-옥-옥-옥-옥-전구체를 나타낸다. 10%를 함유 한 고 포도당 혈관에서 세포를 유지 하였다. 아래 기술된 실험을 위해,헤이옥 1 세포를 다음과 같은 허용 조건 하에서 배양하였다. 104 세포/24-웰 플레이트의 웰)을 20-시스플라틴으로 24 시간 배양하였다. 각 배양 우물의 광학 밀도(외경)는 590 나노 미터의 마이크로 플레이트 판독기(역가 멀티 티스 칸,유동 실험실)를 사용하여 측정 하였다. 대조군 세포의 외경은 100%생존력을 나타내기 위해 취해졌다. 다양한 사이토카인의 효과를 조사하기 위해,사이토카인에 대한 중화 항체를 30 분 동안 배양에 첨가한 후,20 개의 시스플라틴으로 24 시간 동안 배양하였다. 동형 접합체 상태 4 및 상태 6 코 마우스는 다낭성 다낭성 다낭성 다낭성 다낭성 다낭성 다낭성 다낭성 다낭성 코 마우스 어떤 발달 이상을 보여주지 않았다. 실험은 6 주 된 마우스에서 수행되었으며 모든 마우스는 3 일 이내에 연령 일치되었습니다. 쥐는 20-22 의 주위 온도에 유숙하는 동안 표준 상업적인 규정식을 먹이고 12:12 시간의 밑에 50 의 상대 습도 5%빛:특정한 병원체 자유로운 시설에 있는 어두운 주기. 모든 동물 연구는 원광대학교 의과대학 동물보호 및 이용위원회의 승인을 받았습니다.상기 제 1 형질감염 시약인 리포펙타민 2000 을 이용하여 루시페라제 리포터 플라스미드로 전이적으로 형질감염하였다. 36 시간의 배양 후,세포를 중화 사이토 카인 항체의 존재 하에서 12 시간 동안 시스플라틴으로 처리 하였다. 그런 다음 세포를 피피 버퍼로 두 번 세척 한 후 리포터 용해 완충액(미국 위스콘신 주 매디슨 프로 메가)에서 용해시켰다. 그 후,루시퍼라제 분석 시약 100 개를 혼합한 후,방출된 광 세기는 광도계를 사용하여 측정하였다. 마지막으로,루시퍼라제 활성을 삼중으로 측정하고,평균화한 다음,갈락토시다제 분석 시스템을 사용하여 제 2-갈락토시다제 활성에 대해 정규화하였다(갈락토-라이트,트로픽스).,엄마,미국)제조업체의 지시에 따라.
시르나 구조를 이용한 형질감염
마우스 스테이트 4,스테이트 6,컨트롤 스크램블 시르나에 대해 미리 디자인된 시르나를 산타크루즈 바이오테크놀로지에서 구입하였다. 스타트 4 및 스타트 6 에 대한 시르나스의 센스 가닥은 다음과 같다. 이중 1 센스 스트랜드:5′-인덱스 스트랜드:5′,이중 2 센스 스트랜드:5′-인덱스 스트랜드:5′,이중 3 센스 스트랜드:5′,이중 3 센스 스트랜드:5′,이중 3 센스 스트랜드:5′,이중 3 센스 스트랜드:5′,이중 3 센스 스트랜드:5′,이중 3 센스 스트랜드:5′,이중 3 센스 스트랜드:5′,이중 3 센스 스트랜드:5′,이중 3 센스 스트랜드:5′,이중 3 센스 스트랜드: 이중 1 센스 스트랜드:5′-인덱스 스트랜드,이중 2 센스 스트랜드:5′-인덱스 스트랜드,이중 3 센스 스트랜드:5′-인덱스 스트랜드,이중 3 센스 스트랜드:5′-인덱스 스트랜드,이중 3 센스 스트랜드:5′-인덱스 스트랜드,이중 3 센스 스트랜드,이중 3 센스 스트랜드,이중 3 센스 스트랜드,이중 3 센스 스트랜드,이중 3 센스 스트랜드,이중 3 센스 스트랜드,이중 3 센스 스트랜드,이중 3 센스 스트랜드,이중 3 센스 스트랜드, 시르나 형질감염 시약(로슈 응용 과학,펜츠베르크,독일)은 제조사의 프로토콜에 따라 100 나노미터의 시르나 구조로 일시적으로 형질감염되었다. 36 시간 동안 33%의 이산화탄소 및 5%의 이산화탄소를 배양 한 후,세포를 24 시간 동안 시스플라틴으로 추가로 처리 하였다. 표현의 간섭은 면역 블록 분석에 의해 확인되었습니다.
엘리사에 의한 프로-염증성 사이토카인의 측정
시스플라틴-처리된 세포로부터 프로-염증성 사이토카인의 분비를 측정하기 위해,배양 상등액을 매 시점마다 수확하고,분비된 프로-염증성 사이토카인의 수준을 엘리사(퀀틴 사이토카인 키트)에 의해 결정하였다.; (주)디시스템즈)제조업체의 지침에 따라.
세포질 및 핵 추출물의 제조
세포질 및 핵 추출물의 제조
세포질 및 핵 추출물의 제조
세포질 및 핵 추출물의 제조
세포질 및 핵 추출물의 제조
세포질 및 핵 추출물의 제조
세포질 및 핵 추출물의 제조
15 분 동안 얼음에 배양 하였다. 10 초 동안 10%의 10%의 10%의 10%의 10%의 10%의 10%의 10%의 10%의 10%의 10%의 10%의 10%의 10%의 10%를 첨가 하였다. 상기 펠릿을 추가로 가공하여 핵 추출물을 얻었다. 그 후,펠릿을 추출 완충액(5 밀리미터 헤페스,산도 7.9,1.5 밀리미터 엠지엘 2,0.5 밀리미터 페닐메틸술포닐 플루오라이드,0.2 밀리미터 에타,0.5 밀리미터 디티오트레이톨 및 25%(권/권)글리세롤)에 재지입하고,4 에서 30 분 동안 배양하였다. 그런 다음 상청액을 제거하고 웨스턴 블롯 분석에 사용될 때까지-80 에서 저장 하였다. 마지막으로,단백질 농도는 로리 방법에 의해 결정되었다.
웨스턴 블롯 분석
웨스턴 블롯 분석을 다음과 같이 수행하였다. 간단히 말해서,세포를 수확하고 얼음처럼 차가운 핍바이러스로 두 번 세척 하였다. 총 및 핵/세포질 분별 화 된 용 해물을 12%폴리 아크릴 아미드 겔에 전기 영동을 실시한 후 20 밀리암페어에서 3 시간 동안 실시한 후 니트로 셀룰로오스로 옮겼다. 막는 다음 incubated5%(wt/vol)건조 우유 단백질에 PBS 를 포함하는 0.05%(vol/vol)Tween-20(PBS-T)1 에서,그 후 그들은 세척했 PBS-T,및 다음과 반응의 기본 항체(1:1 000)1h. 다음으로,멤브레인은 광범위하게 세척 PBS-T and then incubated anti-rabbit IgG 항체를 활용 HRP(1:3 000)1h. 후에 다양한 세척,단백질 밴드에 멤브레인 표현되었을 사용하여 요정맛 보물 진화하는 시약에 따르면 제조업체의 지침(Supersignal 기판;찌르기,Rockford,IL,USA).
시스플라틴 이독성의 생체 내 실험
모든 마우스를 각각 6 마리의 마우스 두 그룹으로 무작위로 나누었다. 그룹 1 동물,대조군으로 간주 된,복강 내 주사를 받았다. 그룹 2 동물 연속 4 일 동안 복강 내 주사에 의해 시스플라틴(4 밀리그램/킬로그램 체중)을 투여 하였다. 그 후 최종 시스플라틴 주사 다음날 이산화탄소 가스를 사용하여 마취하에 동물을 살해 한 후 오른쪽 귀의 측두골을 제거했습니다.청각 역치의 추가 분석을 위해 시스플라틴의 최종 치료 전과 24 시간 후에 시스플라틴을 측정 하였다. 그런 다음 전처리와 후 처리 사이의 역치 변화를 비교했습니다. 쥐를 케타민(40 밀리그램/킬로그램)및 자일라진(10 밀리그램/킬로그램)의 칵테일을 사용하여 마취시키고,아브르 기록 중에 가열 패드로 따뜻하게 유지하였다. 피하(활성)바늘 전극을 정점에 삽입 한 반면,접지 및 기준 전극은 반대쪽 귀의 깃 아래 느슨한 피부에 피하로 삽입했습니다. 테스트 자극 4,8,16,및 32 키로헤르쯔의 주파수에서 위상 톤 버스트를 번갈아 이루어져 있었다. 신호는 터커 데이비스 기술을 사용하여 생성 된(게인즈 빌,플로리다,미국)시겐 소프트웨어. 각 톤 버스트(1 밀리 초 지속 시간)는 블랙 만 창을 통해 게이팅되었으며 고원이없는 0.5 밀리 초의 상승-하강 시간을 가졌습니다. 자극 동물의 머리 수준에 배치 하는 마이크와 스피커의 출력을 기록 하 여 각 테스트 세션 전에 보정 했다. 각 테스트 주파수에서 300 톤 버스트에 대 한 응답에서 평균 파형 했다. 각 주파수에서 신호의 진폭은 90 데시벨 스필부터 100-3000 헤르쯔의 필터 설정으로 기록 된 트레이스에서 사라질 때까지 10 데시벨 단계에서 자동으로 감쇠되었습니다. 문턱의 판단은 두 명의 독립적 인 실험적으로 맹인 관찰자에 의해 오프라인으로 이루어졌습니다.
코르티 외식 기관의 표면 처리
모든 마우스는 최종 시스플라틴 주사 다음 날에 사망했다. 측두골을 해부하여 4%파라포름알데히드에 고정시킨 후 4%파라포름알데히드에 고정시킨 후 4%파라포름알데히드에 고정시킨 후 4%파라포름알데히드에 고정시킨 후 4%파라포름알데히드에 고정시킨 후 4%파라포름알데히드에 고정시켰다. 측두골은 3 일 동안 측두골에서 10%과다로 더 탈 석회화되었다. 달팽이관은 조심스럽게 해부되었습니다. 다음으로,줄무늬 혈관과 나선형 인대를 해부하여 코르티 기관을 남겼습니다. 달팽이관의 중간 회전은 20 분 동안 트리트 레이블이 붙은 팔로 이딘(시그마 1951,1:100)에 담갔다. 3 회 세척 후,시편을 트리트씨에 적합한 필터를 사용하여 형광 현미경으로 검사하였다(여기:510-550 나노미터,방출:590 나노미터).제거된 측두골을 4%파라포름알데히드에 16 시간 동안 고정시킨 후,2 주 동안 10%에다타로 탈칼슘화한 후,탈수하여 파라핀 왁스에 매립하였다. 섹션 5μm 었 deparaffinized 에서 자일렌과 리하이드레이션을 통해 분류 농도에 에탄올이다. 면역 조직화학 연구를 위해,면역 조직화학 키트(미국 캘리포니아 주 카핀테리아)가 사용되었고 제조사의 지침에 따라 절차가 수행되었습니다. 내인성 퍼 옥시 다제는 실온에서 5 분 동안 3%과산화수소로 차단되었다. 1 차 항체(1:200 희석)를 슬라이드에 첨가하고,그 후 1 시간 동안 배양 하였다. 최종적으로,새로 제조된 기판 용액(아세트산 나트륨 완충액(산도 4.9)에서 3-아미노-9-에틸카르바졸 3 밀리그램,디메틸포름아미드 500,0.03%과산화수소)에 5 분 동안 염색하였다. 그런 다음 면역 염색 세포의 핵을 메이어의 헤 마톡 실린(시그마-알드리치 공동.). 세포 사멸 세포는 튜넬 분석법을 이용하여 현장에서 검출되었다(튜넬 포드 키트,로슈 분자 생화학,만하임,독일). 간단히,섹션을 탈 카페인 화하고 재수 화 하였다. 2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 현미경.
역전사-PCR 증폭
한 인공와우 PCR,왼쪽 귀에 시간 뼈가 신속하게 수확하고 몰입에 RNAlater(하 여 수행 되었습,Inc. 그 후,전체 달팽이관을 해부하여 제조사의 프로토콜에 따라 트리졸(인비트로겐)을 사용하여 총 인공와우를 추출하였다. 트리졸을 이용한 총 아르바이트나 추출 후,단일 좌초된 아르바이트나 총 아르바이트나로부터 합성하였다. 10 마이크로리터를 1.2%아가로오스 겔에서 분리하여 자외선으로부터 가시화하였다. 상기 프라이머의 서열은 다음과 같다: GAPDH (forward, 5′-IndexTermGGG TGT GAA CCA CGA GAA AT-3′, reverse, 5′-IndexTermGTC ATG AGC CCT TCC ACA AT-3′), TNF-α (forward, 5′-IndexTermCAG GGG CCA CCA CGC TCT TC-3′, reverse, 5′-IndexTermCTT GGG GCA GGG GCT CTT GAC-3′), IL-1β (forward, 5′-IndexTermAAG GAG ACC AAG CAA CGA C-3′, reverse, 5′-IndexTermGAG ATT GAG CTG TCT GCT CA-3′), IL-2 (forward, 5′-IndexTermGTC AAC AGC GCA CCC ACT TCA AGC-3′, reverse, 5′-IndexTermGCT TGT TGA GAT GAT GCT TTG ACA-3′), IL-4 (forward, 5′-IndexTermACG GAG ATG GAT GTG CCA AAC GTC-3′, reverse, 5′-IndexTermCGA GTA ATC CAT TTG CAT GAT GC-3′), IL-5 (forward, 5′-IndexTermGCT CCT TCA GGA ATC TGT TC-3′, reverse, 5′-IndexTermGGC TCA TGTACT TTC ATG AG-3′), IL-6 (forward, 5′-IndexTermTTG CCT TCT TGG GAC TGA TGC-3′, reverse, 5′-IndexTermTTG GAA ATT GGG GTA GGA AGG A-3′), IL-10 (forward, 5′-IndexTermAGA CTT TCT TTC AAA CAA AGG ACC AGC TGG A-3′, reverse, 5′-IndexTermCCT GGA GTC CAG CAG ACT CAA TAC ACA CTG C-3′), IL-12 (forward, 5′-IndexTermACC TCA GTT TGG CCA GGG TC-3′, reverse, 5′-IndexTermGTC ACG ACG CGG GTG GTG AAG-3′), and IFN-γ (forward, 5′-IndexTermTAC TGC CAC GGC ACA GTC ATT 1.이 제품은 높은 품질과 경쟁력있는 가격으로 제공됩니다.
통계 분석
각 실험은 적어도 3 회 수행되었으며,보고 된 모든 값은 3 중 분석의 수단을 나타냅니다. 통계적 다변량 분석은 분산 분석과 던컨 테스트에 의해 수행되었습니다. 양방향 분산 분석 및/또는 단방향 분산 분석을 사용하여 결과의 중요성을 결정했습니다. 통계 결과는 석사 수준의 생물 통계 학자에 의해 검토되었습니다. 2115>0 의 값입니다.05 는 통계적으로 유의미한 것으로 간주되었다.