1.4.1 균질화 매체
세포 분열은 일반적으로 형태 학적 완전성을 유지하기 위해 약간 저 삼투압 또는 이소 삼투압 배지에서 수행됩니다. 수크로오스는 삼투액으로 통용됩니다 불리한 팽윤 또는 수축량에서 세포하 세포소기관 또는 소포를 방지하기 위하여. 만니톨과 소르비톨은 또한 자당이 세포 하 성분의 생화학 적 분석을 방해하는 것으로 밝혀 졌을 때 사용되었습니다. 후자는 세포 소기관을 집계하는 경향이 있기 때문에 자당은 소금 용액에 바람직하다. 저 삼투성 매체는 이 조건 하에서 때문에 원형질막 분획의 고립에서 자주 사용합니다,혼란한 세포는 큰 유령 장의 모양으로 원형질막을 열매를 산출합니다. 이 크게 원심 분리 하기 전에 이러한 조각의 크기에 변화의 높은 학위를 줄일 수 있습니다. 균질화 매질은 일반적으로 본질적으로 수성이지만 에테르/클로로포름과 같은 비 수성 매질은 세포 하 세포 소기관을 분리하는 데 사용되었습니다. 그러나 비 수성 매질은 일부 효소를 비활성화시키고 일부 조직의 형태 학적 완전성을 감소시킬 수 있습니다.
킬레이트제(에다타 또는 에다타)를 균질화 배지에 첨가하여 막 프로테아제에 의해 요구되는 마그네슘 2+또는 칼슘 2+와 같은 2 가 양이온을 제거할 수 있다. 에다 및 티올 시약이 일부 단백질 분해 효소를 활성화시킬 수 있기 때문에 프로테아제 억제제가 여전히 배지에 포함되어야한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 그러나 많은 막 마커 효소는 활동을 위해 이러한 양이온을 필요로하며 양이온이 추출물에서 제거 된 후에 억제 될 수 있습니다. 균질화 매체에 마그네슘 2+또는 칼슘 2+를 첨가하면 핵 무결성이 유지됩니다. 그러나 이러한 이온은 막 응집을 유발하고 미토콘드리아에서 호흡 조절을 감소시킬 수 있습니다.
식물 조직의 세포 파괴는 종종 식물 효소에 여러 가지 해로운 영향을 미칠 수있는 페놀을 방출합니다. 식물 페놀 화합물은 본질적으로 두 그룹으로 구성됩니다:페닐 프로파 노이드 화합물(예:가수 분해성 탄닌)및 플라보노이드(예:응축 탄닌). 페놀릭은 단백질의 펩타이드 결합과 수소 결합 또는 페놀 산화 효소에 의해 퀴논으로 산화를 겪을 수 있습니다. 퀴논은 또한 중합 및 식물 조직의 갈변의 기초를 형성하는 멜라닌이라는 어두운 색소를 형성하는 단백질의 반응성 그룹과 응축하는 경향이 강력한 산화제이다. 단백질에 멜라닌을 부착하면 많은 효소가 비활성화 될 수 있습니다. 페놀 수산기는 단백질의 염기성 아미노산과 이온 상호 작용을 형성하거나 단백질의 소수성 영역과 소수성으로 상호 작용할 수 있습니다. 따라서 페놀 화합물을 가능한 한 빨리 제거하는 것이 중요하며,이는 페놀 또는 퀴논에 결합하는 흡착제를 사용하거나 페놀 산화 효소 활성을 억제하는 붕산염,게르마 네이트,아황산염 및 메르 캅토 벤조 티아 졸과 같은 보호제를 사용함으로써 가장 잘 달성됩니다. 페놀 흡착제,폴리 비닐 피 롤리 돈 물-수용성 형태 또는 고도로 가교 된 불용성 생성물 인’폴리 클라’는 격리 매질에 첨가 될 수있다. 폴리 비닐 피 롤리 돈은 단백질과 강한 수소 결합을 형성하는 페놀 화합물을 결합합니다. 둔감한 혈청 알부민은 또한 식물 페놀 릭으로 반작용하기 위하여 보고되고 또한 효과적인 퀴논 넝마주이입니다.
세포 또는 조직 분별 화는 막 프로테아제의 활성을 감소시키기 위해+4 에서 변함없이 수행된다. 프로테아제는 엔도 펩티다아제와 엑소 펩티다아제로 세분 될 수 있습니다. 내부 펩타이드 결합을 절단하는 효소 인 엔도 펩티다아제는 산도 2.5–3.8 의 산도 옵티마를 가지며 전이 상태 억제제 펩 스타틴에 의해 억제 될 수있는 산 프로테아제를 포함한다; 이소프로필플루오로포스페이트 및 페닐메틸술포닐플루오라이드에 의해 억제될 수 있는 세린 프로테아제;및 엔-에틸말레이미드 또는 이-64(엘-트랜스-에폭시숙시닐류실아미드–부탄)에 의해 억제되는 설프하이드릴프로테아제. 엑소펩티다제의 예는 대부분의 식물 조직에 존재하고 대부분의 씨-말단 아미노산을 쉽게 가수분해하는 카르복시펩티다제를 포함한다. 현재까지 연구 된 모든 식물 카르복시 펩 티다 제는 디 이소 프로필 플루오로 포스페이트에 의해 억제됩니다. 아미노 펩티다제,디 펩티다제 및 트리 펩티다제도 식물에서 확인되었다. 균질화 매질에 사용되는 다른 화합물은 2-머 캅토 에탄올,디티오 트레이톨,디티오 에리트 리톨,환원 글루타티온 또는 시스테인과 같은 이황화 환원제를 포함한다. 이것은 많은 효소가 효소 활성을 유지하기 위하여 감소된 남아 있어야 하는 근본적인 활동적인 위치 설프히드릴기를 포함하기 때문입니다. 소기관 격리의 많은 문제는 허약 한 막의 파열과 관련이 있습니다(예:액포를 둘러싼 토노 플라 스트). 이러한 막의 물리적 파괴 외에도 식물 조직에는 활성 지방 분해 효소가 포함되어있어 막의 지질 성분을 직접 공격하고 세포 기관을 파괴 할 수 있습니다. 아실 가수 분해 효소의 가수 분해 작용에 의해 방출되는 유리 지방산은 미토콘드리아,엽록체 및 원형질막의 아타 제 활성을 억제 할 수 있습니다. 지방산의 다른 해로운 효과 또한 잘 설립. 식물에서 리파아제 및 지방 분해 아실 가수 분해 효소에 의한 지질 분해를 줄일 수있는 특정 조건이 있습니다. 여기에는(1)7 의 산도를 가진 격리 매체를 사용하는 것이 포함됩니다.그러나 많은 지방 분해 효소는 킬레이트 제 및(3)지방산 하이드로퍼옥사이드,디설파이드 환원제,특이 효소 억제제 및 유리 지방산을 결합하는 지방산이없는 소 혈청 알부민의 사용을 방지하기 위한 산화 방지제와 같은 다른 첨가제에 의해 영향을 받지 않는다. 각각의 개별 균질화 배지는 다르며 포스 포 리파아제 또는 포스 파타 아제와 같은 효소에 대한 특정 억제제를 포함 할 수 있습니다. 예를 들어 글리세롤은 종종 포스파티드산 포스파타제를 억제하기 위해 분리 매질에 첨가된다. 식물 세포 분별 균질화 매체의 완충 능력은 세포의 상당한 부피를 구성하는 파괴 된 액포에 의한 유기산의 방출을 상쇄하기 위해 높아야한다. 균질화 매체는 경험적 평가 또는 합리적인 분석에 의해 공식화 될 수 있습니다. 예를 들어,관련 정제된 단백질이 그대로 유지되도록 하기 위해 프로테아제의 모든 주요 억제제가 균질화 배지에 첨가되거나 또는 대안적으로 생리학적 용액이 복사될 수 있다. 식물 세포의 세포질 산도는 약 7.5–8.0 이기 때문에 균질화 배지는 세포의 생리적 상태를 반영해야하므로 세포질 산도에 약하게 완충됩니다.