단순화 된 칩-엑소 분석실험

항체

다이나 비드에 결합 된 토끼 시그마(시그마)는 탭 태그가 포함 된 탭 태그가 표적이었던 탭 태그 균주에 대해 사용되었다. Millipore07-729 체에 대해 사용되었 K562 샘플을 타겟팅 CTCF.1991 년 10 월 15 일,1992 년 11 월 15 일,1993 년 11 월 15 일,1994 년 11 월 15 일,1994 년 11 월 15 일,1994 년 11 월 15 일,1995 년 11 월 15 일,1995 년 11 월 15 일,1995 년 11 월 15 일,1995 년 11 월 15 일,1995 년 11 월 15 일,1995 년 11 월 15 일,1995 년 11 월 15 일,1995 년 11 월 15 일,1995 년 11 월 15 일,1995 년 플라스미드는 다음에서 사용할 수 있습니다. 균주 bl21(DE3)권한있는 대장균 세포는(새로운 영국 Biolabs)변형되었다고는 하나의 식민지에서 재배 37°C 는 OD600 0.4 에서 500ml LB+50µg/ml 암피실린+30µg/ml 클로람페니콜. 원심분리에 의해 세포를 수집하고,성 완충액으로 한 번 세척하고,세포 펠릿을 액체 질소에서 플래시 동결시켰다.

티엔 5 는 이전에 기술된 바와 같이 정제되었으며,거의 변형되지 않았다. 100%글리세롤,0.1%트리톤-엑스 100)을 함유한 페닐메틸술포닐 플루오라이드와 라이소자임(시그마;1 밀리그램/1 그램의 세포 펠릿)을 실온에서 30 분 동안 배양하여 용해하였다. 이 lysate 었 원심 분리 20,000×g20 분에서 4°C,그리고 상등액을했 침전 0.25%polyethyleneimine(시그마)과 원심 분리에서 10,000×g15min. 상등액을 47%포화 황산 암모늄(0)으로 침전시켰다.15 분 동안 20,000 그램에서 원심분리하였다.그 후,펠렛을 50 밀리리터의 니켈 친화도 부하 완충액(50 밀리리터의 포스페이트,산도 7.4,50 밀리리터의 글리세롤,20%글리세롤)에 재중입하고,동일한 완충액으로 평형화된 1.5 밀리리터/분으로 히스토랩 마력 칼럼 상에 적재하였다. 상기 칼럼을 순차적으로 세척 완충액 1(인산칼륨 50 밀리,산도 7.4,산도 1 밀리,이미다졸 50 밀리,글리세롤 20%),세척 완충액 2(인산칼륨 50 밀리,산도 7)로 세척하였다.4,500mM KCl,50mM 이미다졸,20%글리세롤),다음 Tn5 용출되었으로 니켈의 선호도 용출 버퍼(50mM 칼륨 인산염,pH7.4,500mM KCl,500mM 이미다졸,20%글리세롤)에 2ml/min. 상기 용리액을 희석 완충액(50 밀리 포스페이트,산도 7.4,20%글리세롤)으로 희석하고,최종 용적량을 50 밀리리터로 조절하였다.그 후,헤파린 칼럼에 시료를 적재하였다. 5 열 볼륨의 완충액으로 세척 한 후,10 밀리리터의 선형(300 밀리미터 내지 1.2 미터)나클 그라데이션을 실행하여 용리시켰다. 이 칼럼에서 약 600 밀리미터까지 용출되었습니다. 주 용출 피크를 함유하는 분획물을 결합(3.5 밀리람베르트)하고,30%글리세롤을 함유하는 테그엑스 300 버퍼에 대하여 밤새 투석시킨 후,-80 에 저장하였다. 세포 실 온에서 15 분 동안 1%의 최종 농도에서 포름알데히드와 가교 하 고 5 분 동안 125 밀리 글리신의 최종 농도로 급냉. 원심분리에 의해 세포를 수집한 후,1 밀리리터의 성 완충액(10 밀리리터의 성 완충액,7.5,100 밀리리터의 성 완충액)에서 4 밀리리터의 성 완충액으로 세척하고,2 개의 분취액으로 분할하였다. 세포를 다시 펠렛 화하고,상청액을 제거하고,펠릿을 플래시 냉동시켰다.또한,상기 제제들은,상기 제제들은,상기 제제들 중,상기 제제들 중,상기 제제들 중,상기 제제들 중,상기 제제들 중,상기 제제들 중,상기 제제들 중,상기 제제들 중,상기 제제들 중,상기 제제들 중,상기 제제들 중,상기 제제들 중,상기 제제들 중,상기 제제들 중,상기 제제들 중,상기 제제들 중,상기 제제들 중,상기 제제들 중,상기 제제들 중,상기 제제들 중,상기 제제들 중,상기 제제들 중1%나트륨 데 옥시 콜레이트,및 소비자 물가 지수)및 1 밀리리터의 부피 0.5 밀리미터 지르코니아/실리카 비드 비드 박동에 의해 미니 비드 비터 -96 기계(바이오 스펙)3 분 온/5 분 오프 사이클의 3 사이클 동안(샘플은 오프 사이클 동안 얼음 위에 유지되었다). 용 해물을 새로운 튜브로 옮기고 4 에서 3 분 동안 최대 속도로 미세 원심 분리하여 염색질을 펠릿 화 하였다. 15 밀리리터의 폴리스티렌 원추형 튜브로 옮겼다. 그런 다음 샘플을 30 초 온/오프 간격으로 15 사이클 동안 바이오 루프 터(다이아 노드)에서 초음파 처리하여 크기가 100 내지 500 혈압 인 유전자 조각을 얻었다. 1 개의 칩 엑소 분석실험은 50 밀리리터의 세포 배양(~6,108 개의 세포)에 해당하는 것을 처리하였다. 이는 필요한 최소 금액이 아닌 편리한 금액을 나타냅니다.10%태아 소 혈청으로 보충 된 10%태아 소 혈청에서 105 및 106 세포 사이에서 유지되었다. 포름알데히드를 실온에서 10 분 동안 1%의 최종 농도로 가교시킨 후,5 분 동안 125 밀리 글리신의 최종 농도로 담금질하였다. 상청액을 제거하고,세포를 1 밀리리터의 피펩티비스로 재지정하여 세척하였다. 세포를 분리하여 1 억 개의 세포를 포함하고 원심 분리 한 후 상층액을 제거하고 펠렛을 플래시 냉동시켰다.100,000,000 셀 분취(다중 칩에 사용하기 위해)는 500,000,000 셀 분취(100,000,000)에서 용해되었다.10 분 동안 얼음 위에서 배양하여 단백질 분해 효소 억제제(소비자 물가 지수,로슈)를 완성한다. 그 후,펠릿을 10 분 동안 얼음위에 배양하여 핵을 용해시켰다. 100%트리톤,100%트리톤,100%트리톤,100%트리톤,100%트리톤,100%트리톤,100%트리톤,100%트리톤,100%트리톤,100%트리톤,100%트리톤,100%트리톤,100%트리톤,100%트리톤,100%트리톤,100%트리톤,100%트리톤,100%트리톤,100%트리톤,100%트리톤,100%트리톤,100%트리톤,100%트리톤,100%트리톤,100%트리톤,100%트리톤,100%트리톤,100%트리톤,100%트리톤,100%트리톤,100%트리톤,100%트리톤,100%트리톤,100 내지 500 혈압의 크기를 얻기 위해 온/오프 간격으로 30 초 동안 10 사이클 동안 바이오 루프 터(다이아 노드)를 음파 처리 하였다.

마우스 조직 준비

16 주 된 성인 남성 마우스 뇌,폐,간,및 신장 조직 아낌없이 제공 했다 박사 얀 밍 왕 마우스 조직 100 밀리 그램 처리 하 고 염색 질 이전에 설명 된 대로 생성 된 21 사소한 수정. 간단히 말해서,100 밀리그램의 마우스 조직을 얼음 위에 조각으로 다진 후 10 분 동안 1%포름 알데히드로 고정시킨 다음 5 분 동안 125 밀리 글리신의 최종 농도로 담금질했습니다. 세포 용해 완충액,세포 용해 완충액,세포 용해 완충액,세포 용해 완충액,세포 용해 완충액,세포 용해 완충액,세포 용해 완충액,세포 용해 완충액,세포 용해 완충액,세포 용해 완충액,세포 용해 완충액,세포 용해 완충액,세포 용해 완충액,세포 용해 완충액,세포 용해 완충액,세포 용해 완충액,세포 용해 완충액,세포 용해 완충액,세포 용해 완충액,세포 용해 완충액,세포 용해 완충액,세포 용해 완충액,세포 용해 완충액,세포 용해 완충액,세포 용해 완충액,세포 용해 완충액. 분리 된 핵은 방사에 의해 분리되고 리파 핵 용해 완충액(1%,1%,0.5%,0.5%,0.5%,0.5%,0.5%,0.5%,0.5%,0.5%,0.5%,0.5%,0.5%,0.5%,0.5%,0.5%,0.5%,0.5%,0.5%,0.5%,0.5%,0.5%,0.5%,0.5%,0.5%,0.5%,0.5%, 핵은 다음 100-500 혈압 크기 범위에서 유전자를 생성 하기 위해 30 초 온/오프 간격으로 10 사이클에 대 한 바이오 럽 터(다이아 노드)와 함께 초음파 했다. 간 세포 수는 이전에 기술 된 바와 같이 추정되었다.22,1 밀리그램 조직 습식 중량의 전환 계수를 사용하여~250,000 세포와 같습니다.염색질 면역침착

50 밀리리터의 배양-당량의 효모 또는 1,000 만개의 세포-당량의 크로마틴을 이피 희석 완충액으로 200 크로마틱으로 희석하고,적절한 항체와 함께 4 크로마틴에서 밤새 배양하였다. 효모 샘플에 이그-다이나비드의 10 개 침상 부피를 첨가하였다; 3μg anti-CTCF 항체와 함께 10µl 슬러-해당하는 단백질의 Mag Sepharose(GE Healthcare)추가 되었 K562 샘플입니다.

칩-엑소 1.1

칩-엑소 1.1 은 이전에 기술된 7,8,23 으로 수행되었다. 간략 하 게,다음 효소 단계 각 단계 사이 여러 소금 세척과 수 지에 여전히 면역 침전 염색 질으로 수행 했다: T4DNA 중합효소 연 끝 닦,T4 뉴클레오티드 kinase,Klenow 조각 A 찌끼,T4DNA 리가 중재 Read_2 어댑터 결찰,phi29DNA 중합효소 연기 두 번째,T4 뉴클레오티드 kinase,람다 exonuclease 소화,그리고 RecJf exonuclease 소화입니다. 다음과 같은 하룻밤 역 크로스 연결 및 성분 K 처리,다음과 같은 단계를 수행되었에서 해결책:phi29 프라이머를 확장,두 번째 Klenow 조각 A 찌끼,T4DNA 리가 중재 Read_1 어댑터 내 PCR.

칩-엑소 3.0 및 3.1(태그 침착 기반 버전)

면역 침강 후,수지에 대해 다음 단계를 수행 하였다. 트랜스포사제를 조립하기 위해,티엔 5 를 다음 성분을 함유하는 10 개의 트랜스포사제 혼합물에서 배양하고 실온에서 30 분 동안 배양하였다:12.5 티엔 5,50%글리세롤,및 7.5 티엔 5 어댑터(넥사 2/미 컴포지션). 이 연구에서 사용 된 올리고 뉴클레오티드 서열에 대해서는 보충 표 1 을 참조하십시오.상기 수지상의 칩 재료를 순차적으로 세척한 후,상기 수지상의 칩 재료를 순차적으로 세척한 후,상기 수지상의 칩 재료를 순차적으로 세척한 후,상기 수지상의 칩 재료를 순차적으로 세척한 후,상기 수지상의 칩 재료를 순차적으로 세척한 후,상기 수지상의 칩 재료를 순차적으로 세척한 후,상기 수지상의 칩 재료를 순차적으로 세척한 후,상기 수지상의 칩 재료를 순차적으로 세척한 후,상기 수지상의 칩 재료를 순차적으로 세척한 후,상기 수지상의 칩 재료를 순차적으로 세척한 후,상기 수지상의 칩 재료를 순차적으로 세척한 후,본 발명의 실시예에 따르면,상기 제 1 항과 제 2 항은 제 2 항 및 제 2 항과 제 2 항과 제 2 항과 제 2 항은 제 2 항과 제 2 항과 제 2 항은 제 2 항과 제 2 항은 제 2 항과 제 2 항은 제 2 항은 제 2 항은 제 2 항은 제 2 항은 제 2 항은 제 2 항은 제 2 항은 제 2 항은 제 2 항은 제 2 항은 제 2 항은 제 2 항은 제 2 항은 제 2 항은 제 2 항은 1 단계부터 1 단계부터 1 단계부터 1 단계부터 1 단계부터 1 단계부터 1 단계부터 1 단계부터 1 단계부터 1 단계부터 1 단계부터 1 단계부터 1 단계부터 1 단계부터 1 단계부터 1 단계부터 1 단계부터 1 단계부터 1 단계부터 1 단계부터 1 단계부터 1 단계부터 1 단계부터 1 단계부터 1 단계부터 1 단계부터 1 단계부터 1 단계부터 1 단계부터 1 단계부터 1 단계부터 1 단계부터 1 단계부터 1 단계부터 1 단계부터 1 단계부터 1 단계부터 1 단계부터 1 단계부터 1 단계부터 1 단계부터 1 단계부터 1 단계부터1%sodium deoxycholate)5min37°C,다음 한 번 licl 위상 버퍼 10mm Tris-HCl,pH8.0 4°C.

을 채우기에서 반응(30µl)다음과 같은 내용이 포함된 10U phi29 효소(NEB),1×phi29 반응 버퍼(NEB),2×(200µg/ml)BSA 및 165μm dNTPs 동안 배양을 위해 20min30°C;다음으로 세척 10mm Tris-HCl, pH8.0 4°C 니 반응(30µl)다음과 같은 내용이 포함된 10U T4PNK(NEB),1×T4DNA 리가 버퍼(NEB),2×BSA 동안 배양에서 15 분 37°C;다음으로 세척 10mm Tris-HCl,pH8.0 4°C λ exonuclease 소화(100μl)을 포함하는: 20U λ exonuclease(NEB),1×λ exonuclease 반응 버퍼(NEB),0.1%Triton-X100,그리고 5%DMSO 동안 배양 30min37°C;다음으로 세척 10mm Tris-HCl,pH8.0 4°C RecJf exonuclease 소화(100μl)포함:75U RecJf exonuclease(NEB),2×NEBuffer2,0.1%Triton-X100,그리고 5%DMSO 동안 배양 30min37°C 다음으로 세척 10mm Tris-HCl,pH8.0 4°C.

DNA eluted 에서 수지,그리고 역 크로스 연결 및 성분 K 치료에 수행되었(40µl)포함:30µg 성분 25mM Tris-HCl,pH7.상기 상청액을 새로운 튜브로 이송하고 제조자의 지시에 따라 제조자의 지시에 따라 아젠코트 암퓨어 자성비드(베크만 콜터)로 정제하고,1.8 암퓨어 슬러리를 1.8 부피에 첨가하여 정제한 후,암퓨어 슬러리를 1.8 부피로 정제한 후,암퓨어 슬러리를 1.8 부피로 정제한 후,암퓨어 슬러리를 1.8 부피로 정제한 후,암퓨어 슬러리를 1.8 부피로 정제한 후,암퓨어 슬러리를 1.8 부피로 정제한 후,암퓨어 슬러리를 1.8 부피로 정제한 후,암퓨어 슬러리를 1.8 부피로 정제한 후,암퓨어 슬러리를 1.8 부피로 정제한 후,샘플을 물 10,000,000 에 암퓨어 비드로부터 용출하고,다음의 효소 단계를 용액에서 수행하였다.

접합기 결찰(버전 3.0):프라이머 연장 반응용(총 반응량 20 개); 을 resuspended 에 샘플을 추가 1×phi29 반응 버퍼,2×BSA,100μm dNTPs,0.5μm 나를 시퀀스 올리고 뉴클레오티드(총 9µl)인큐베이션에서 5 분 95°C,다음 10min45°C 을 허용 올리고 시간을 단련하십시오. 샘플 변동되었 30°C 하기 전에 추가 10U phi29 효소(1µl)및 배양을 위해 20min30°C;다음 10 분에서 65°C 을 비활성화,그리고 이동하 37°C.

에 대한 미행 반응(총 반응을 볼륨 30µl); 프라이머 확장자 반응이 추가되었 10U Klenow 조각-exo(NEB),1×NEBuffer2,100μm dATP(총 10µl)및 종묘에 대한 30 분 37°C,다음 20min75°C 을 비활성화,그리고 이동하는 25°C. 두 번째 어댑터 결찰 반응(총 반응을 볼륨 40µl);A-찌끼의 반응에 추가 되었 2,000U T4DNA 리가(enzymatics),1×NEBNext 빠른 결찰 버퍼(NEB), 375nM 어댑터(ExA1-58/13)및 배양을 위한 1 시간 25°C.

부목 결찰(version3.1):접합기를 위한 내(40µl); 1.0 및 3.1:결찰 반응을 암퓨어 비드로 정제하고 물 15 에 재중합하였다. 그런 다음 샘플을 통해 증폭했습니다. PCR 증폭(총 반응을 볼륨 40µl);을 resuspended 에 DNA 를 추가되었 2U Phusion 핫 스 효소(Thermo 과학),1×Phusion HF 버퍼(Thermo 과학),200μm dNTPs,500nM 각 프라이머(P1.18 사이클 동안 증폭(98 초에서 20 초,52 초에서 1 분,52 초에서 1 분,72 초에서 1 분,72 초에서 1 분,72 초에서 1 분,72 초에서 1 분,72 초에서 1 분,72 초에서 1 분,72 초에서 1 분,72 초에서 1 분,72 초에서 1 분). 반응의 1/4 은 추가 6 사이클(총 24 회)동안 증폭되었으며 라이브러리의 존재는 2%아가로스 겔에 대한 전기 영동에 의해 결정되었습니다.200-500 제품을 키아퀵 겔 추출 키트(키아겐)를 사용하여 2%아가로오스 겔로부터 겔 정제하였다.

칩 엑소 4.0 및 4.1(단일 가닥 결찰 버전)

면역 침강 후,수지에 대해 다음 단계를 수행하였다. 칩에서 자료 수지를 세로 순차적으로 FA Lysis Buffer,NaCl 버퍼,licl 위상 버퍼,10mm Tris-HCl,pH8.0 에서 4°C 로 끝나 수리는 반응(50µl)포함:7.5U T4DNA polymerase(NEB),2.5U DNA Polymerase I(NEB),25U T4PNK,1×T4DNA 리가 버퍼 390μm dNTPs 동안 배양 30 분에서 12°C;다음으로 세척 10mm Tris-HCl, pH8.0 4°C λ exonuclease 소화(100μl)포함:20U λ exonuclease,1×λ exonuclease 반응 버퍼,0.1%Triton-X100,그리고 5%DMSO 동안 배양 30min37°C;다음으로 세척 10mm Tris-HCl,pH8.0 4°C RecJf exonuclease 소화(100μl)포함:75U RecJf exonuclease,2×NEBuffer2,0.1%Triton-X100,그리고 5%DMSO swas incubated30min37°C;다음으로 세척 10mm Tris-HCl,pH8.0 4°C.

첫 번째 어댑터 내:ssDNA 결찰(버전 4.0 40µl):에 대한 adapterion 내 1200U T4DNA 리가,1×T4DNA 리가 버퍼 과 375nM 단일 가닥 어댑터(ExA1-58-N5)었 배양을 위한 1 시간 25°C;다음으로 세척 10mm Tris-HCl,pH8.0 4°C.

부목 결찰(4.1 버전,40µl): 1200U T4DNA 리가,1×T4DNA 리가 버퍼,그리고 375nM 어댑터(ExA2.1-N5/ExA2.1-20)었 배양을 위한 1 시간 25°C;다음으로 세척 10mm Tris-HCl,pH8.0 4°C.

모두 4.0 버전 4.1:DNA eluted 에서 수지,그리고 역 크로스 연결 및 성분 K 치료에 수행되었(40µl)포함:30µg 성분 25mM Tris-HCl,pH7.5,2mM EDTA,200mM NaCl,0.5%SDS incubated16 서 65°C.

상등액을 전달되었습니다 이 새로운 튜브와 정화 Agencourt AMPure 자석 구슬(Beckman Coulter)다음과 같은 제조업체의 지침(1.8×볼륨). 샘플을 물 20,000,000 에 암퓨어 비드로부터 용출하고,다음의 효소 단계를 용액에서 수행하였다.상기 제 2 접합기 결찰은,상기 제 2 접합기 결찰은,상기 제 2 접합기 결찰은,상기 제 2 접합기 결찰은,상기 제 2 접합기 결찰은,상기 제 2 접합기 결찰은,상기 제 2 접합기 결찰은,상기 제 2 접합기 결찰은,상기 제 2 접합기 결찰은,상기 제 2 접합기 결찰은,상기 제 2 접합기 결찰은,상기 제 2 접합기 결찰은,상기 제 2 접합기 결찰은,상기 제 2 접합기 결찰은,상기 제 2 접합기 결찰은,상기 제 2 접합기 결찰은,상기 제 2 접합기 결찰은,상기 제 2 접합기 결찰

부목 어댑터 결찰(4.1 버전,총 반응을 볼륨 40µl):을 resuspended 에 DNA 를 추가되었 1200U T4DNA 리가,1×T4DNA 리가 버퍼,375nM 어댑터(ExA1-58/ExA1-SSL_N5)및 배양을 위한 1 시간 25°C.

모두 4.0 버전 4.1:결찰 반응은 다음 순화와 AMPure 구슬(1.8×볼륨)및 resuspended 에서 15µl 의 물. 그런 다음 샘플을 통해 증폭했습니다. 증폭(총 반응량 40,000,000,000,000,000); 18 사이클 동안 증폭(20 초 98 초 변성,1 분 52 초 어닐링,1 분 72 초 어닐링,1 분 72 초 어닐링,1 분 72 초 어닐링,1 분 72 초 어닐링,1 분 72 초 어닐링,1 분 72 초 어닐링,1 분 72 초 어닐링,1 분 72 초 어닐링,1 분 72 초 어닐링,1 분 72 초 어닐링,1 분 72 초 어닐링,1 분 72 초 어닐링,1 분 72 초 어닐링,1 분 72 초 어닐링,1 분 반응의 1/4 은 추가 6 사이클(총 24 회)동안 증폭되었으며 라이브러리의 존재는 2%아가로스 겔에 대한 전기 영동에 의해 결정되었습니다. 크기 선택:키아퀵 겔 추출 키트(키아겐)를 사용하여 2%아가로오스 겔로부터 200~500 개의 제품을 겔 정제하였다.이 어댑터에는 긴 프라이머와 함께 나중에 바코드가 추가되었습니다. 람다 엑소 뉴 클레아 제 소화와 관련된 라이브러리 구성에 긴 프라이머를 사용할 때마다 라이브러리는 낮은 수율과 높은 어댑터 이량 체로 고통 받았습니다. 우리는 이제 전체 길이 어댑터와 최소 길이 프라이머 만 사용합니다.

칩-엑소 5.0

면역침착 후,수지에 대해 다음 단계를 수행하였다. 칩에서 자료 수지를 세로 순차적으로 FA Lysis Buffer,NaCl 버퍼,licl 위상 버퍼,10mm Tris-HCl,pH8.0 4°C.A 찌끼 반응(50µl)포함:15U Klenow 조각-exo(NEB),1×NEBuffer2,및 100μm dATP incubated30min37°C;다음으로 세척 10mm Tris-HCl,pH8.0 에서 4°C 로 첫 번째 어댑터는 결과 니 반응(45µl) 다음과 같은 내용이 포함된 1200U T4DNA 리가,10U T4PNK,1×NEBNext 빠른 결찰 버퍼,그리고 375nM 어댑터(ExA2_iNN/ExA2B)었 배양을 위한 1 시간 25°C;다음으로 세척 10mm Tris-HCl,pH8.0 4°C 채우기 반응(40µl)다음과 같은 내용이 포함된 10U phi29 효소,1×phi29 반응 버퍼,2×BSA,180μm dNTPs 동안 배양을 위해 20min30°C;다음으로 세척 10mm Tris-HCl,pH8.0 4°C λ exonuclease 소화(50µl)다음과 같은 내용이 포함된 10U λ exonuclease,1×λ exonuclease 반응 버퍼,0.1%Triton-X100,그리고 5%DMSO 동안 배양 30min37°C 다음으로 세척 10mm Tris-HCl,pH8.0 4°C.

DNA eluted 에서 수지,그리고 역 크로스 연결 및 성분 K 치료에 수행되었(40µl)을 포함하는: 상기 상청액을 새로운 튜브로 이송하고 제조자의 지시(1.8 권)에 따라 어젠코트 암퓨어 자성비드(베크만 콜터)로 정제하였다.샘플을 물 20,000,000 에 암퓨어 비드로부터 용출하고,다음의 효소 단계를 용액에서 수행하였다. 두 번째 어댑터 결찰(총 반응량 40,000,000): 상기 결찰반응을 암퓨어 비드(1.8 부피)로 정제한 후,15 의 물에 재중합하였다.물(1.8 부피)로 재중합한 후,상기 결찰반응을 암퓨어 비드(1.8 부피)로 재중합한 후,상기 결찰반응을 암퓨어 비드(1.8 부피)로 재중합한 후,상기 결찰반응을 암퓨어 비드(1.8 부피)로 재중합한 후,상기 결찰반응을 암퓨어 비드(1.8 부피)로 재중합한 후,상기 결찰반응을 암퓨어 비드(1.8 부피)로 재중합한 후,상기 결찰반응을 암퓨어 비드(1.8 부피)로 재중합한 후,상기 결찰반응을

그 후,샘플을 회로 기판을 통해 증폭시켰다. PCR 증폭(총 반응을 볼륨 40µl);을 resuspended 에 DNA 를 추가되었 2U Phusion 핫 스 효소(Thermo 과학),1×Phusion HF 버퍼(Thermo 과학),200μm dNTPs,500nM 각 프라이머(P1.3P2.1)및 18 사이클 동안 증폭(98 에서 20 초,52 에서 1 분,52 에서 1 분,72 에서 1 분,72 에서 1 분,72 에서 1 분). 반응의 1/4 은 추가 6 사이클(총 24 회)동안 증폭되었으며 라이브러리의 존재는 2%아가로스 겔에 대한 전기 영동에 의해 결정되었습니다. 크기 선택:키아퀵 겔 추출 키트(키아겐)를 사용하여 2%아가로오스 겔로부터 200~500 개의 제품을 겔 정제하였다.

참고:이 단계에서 겔 정제 이외의 방법을 사용하면 최종 샘플에서 용납 할 수 없을 정도로 높은 수준의 어댑터 이량 체가 발생한다는 것을 발견했습니다. 겔 정제는 어댑터 이량 체(150 혈압 단편)와 칩 엑소 라이브러리의 작은 단편을 효과적으로 분리 할 수 있습니다(200 혈압 단편=150 혈압 어댑터+50 혈압 삽입).

DNA 시퀀싱

높은 처리량 DNA 시퀀싱이었으로 수행 NextSeq500 에서 짝이 엔드 모드 생산 2×40bp 읽습니다. 2012 년 12 월 1 일,이 연구는 효모의 유전자좌를 조사한 결과,이 유전자좌를 조사한 결과,이 유전자좌를 조사한 결과,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일에 확인함. 정렬 된 읽기는 고유하지 않은 정렬 및 복제본을 제거하기 위해 필터링되었습니다. 동일한 읽기 _1 및 읽기 _2 시퀀스를 갖는 시퀀스 읽기로 정의되었습니다.

데이터 가용성

이 연구의 모든 시퀀싱 파일 및 피크 파일은 다음과 같습니다. 이 논문의 수치를 생성하는 데 사용되는 좌표 파일,스크립트 매개 변수 및 사용자 지정 코드는 다음 위치에서 다운로드할 수 있습니다.

기타 모든 데이터는 합리적인 요청에 따라 작성자로부터 구할 수 있습니다.

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