현미경 검사는 기본적으로 생물학적 사건을 측정하기보다는 관찰하고 일부 계산을 기반으로하지 않고 우리가 보는 것을 기반으로 결론을 내릴 수있는 기술입니다. 따라서이 기사의 주제는 공동 화의 측정을 다루기 때문에 약간 놀라운 것처럼 보일 수 있습니다. 육안으로 단백질 공동화를 결정할 수 있는 상황이 있지만,두 프로브의 상호 분포에 대한 보다 정확한 확인이 종종 필요할 것입니다.
왜 색소화의 시각적 결정이 불충분한가?
콜로컬라이제이션 분석을 위한 제어 프로토콜(각 채널에 충분한 신호,자가 형광 또는 신호 블리드 스루 없음)에 따라 이미지를 수집한 경우에만 두 프로브가 관측을 기반으로 단독으로 콜로컬라이제이션된다고 말하는 것이 안전합니다. 이 경우 녹색 신호가 빨간색 신호와 함께 콜로코 화되고 그림이 대부분 노란색 인 경우 통계적 측정이 필요하지 않습니다. 그러나 당신이 중복을 보지 않는 경우에,거기 다는 것을 의미하지 않는다! 두 채널의 강도가 동일하지 않을 수 있습니다. 즉,우리가 보는 중간 색상은 두 프로브가 동일한 강도 인 경우에만 나타날 수 있습니다. 따라서 시각적 결정에 기반한 결론은 종종 잘못된 부정적인 결과를 초래할 수 있습니다.
중첩 측정 방법은 무엇입니까?
이 문제에 대한 하나의 표준 접근 방식은 없지만 널리 사용되고 일반적으로 받아 들여지는 두 가지 방법이 있습니다. 이 계수는 1999 년 12 월 15 일에 발표되었으며,1999 년 12 월 15 일에 발표되었습니다.
이 두 가지 방법은 상관 관계와 공동 발생의 두 가지 다른 측면과 관련이 있습니다. 피어슨의 계수는 두 채널의 픽셀 강도의 상관 관계와 관련이 있습니다. 한 채널의 신호 값이 다른 채널과 동시에 상승하는지 또는 다른 채널이 상승 할 때 하나의 신호가 떨어지는 지 여부 간의 관계를 측정합니다. 상관 관계는 맨더 계수를 통해 수학적으로 표현되는 공동 발생과 구별됩니다. 이 두 프로브가 같은 장소를 차지하는 정도를 보여 다른 통해 하나의 신호의 범위를 나타냅니다. 이 점을 조금 더 살펴 보겠습니다.신호 강도 사이의 선형 관계를 반영한다. 값은 1(완벽한 양의 상관 관계)과 -1(완벽한 음의 상관 관계)사이의 범위를 가질 수 있지만 0 은 상관 관계가 없음을 의미합니다. 플롯의 좌표가 두 채널의 픽셀 값(신호)을 나타내는 스 캐터 그램을 통해 시각적으로 탐색 할 수 있습니다. 직선을 중심으로 클러스터링되는 점이 많을수록 두 신호 간의 상관 관계가 더 좋아집니다.
요구 사항:가양성 또는 네거티브를 피하기 위해 관심 영역에서 측정해야 합니다. 전체 이미지 위에 픽셀을 측정하면 배경의 픽셀이 완벽하게 상호 연관되어 픽셀을 팽창시킵니다. 반면,두 채널의 이질적인 분포가 있는 관심 없는 영역에서 측정이 수행될 경우,측정이 중단됩니다.
손 또는 임계값으로 투자 수익을 선택하여 배경을 제외할 수 있습니다. 어느 쪽이든,특히 탈곡 할 때 조심하십시오. 투자 수익률의 선택은 셀(들)의 모든 관련 영역,즉 프로브가 배포될 것으로 예상될 수 있는 모든 장소를 포함할 필요가 있다. 투자 수익(임계값)을 선택하는 데 강도 기반 방법을 사용하는 경우 실수로 관련 결과를 제외할 수 있습니다. 어떻게 이런 일이 일어날 수 있습니까? 당신은 어느 라벨이 나타납니다 상호 배제의 영역을 가질 수 있으며,이(두 분자는 셀에 그 장소에 표현되지 않습니다)생물학적으로 관련 결과가 될 수 있습니다. 그러나 임계값은 투자 수익률에 이 영역을 포함하지 않으므로 관련 결과를 잃을 위험이 있습니다.
권장 대상:강도간에 선형 관계가 있다면 이미지에 사용해야합니다. 데이터가 더 복잡한 모델에 맞으면 성능이 좋지 않습니다. 프로브가 서로 다른 비율로 분배되는 고르지 않은 오버랩이 있는 경우 다른 방법을 선택해야 합니다. 이 프로브는 단일 프로브로 사용될 때 발생할 수 있습니다. 그것의 발현 수준은 세포간에 다를 수 있으며 잠재적으로 높은 세포 간 가변성으로 인해 세포 간 분열의 우울증을 유발할 수 있습니다.
맨더의 콜로케이션 계수
정의:고객 센터는 공동 발생을 설명하는 메트릭이다-다른 함께 콜로케이션 한 단백질의 분율. 고객센터는 소낭에 있는 하나의 단백질에 라벨을 붙이고 그것이 세포 내의 특정 구조로 어떻게 콜로코사이즈되는지 보고 싶을 때 콜로코사이즈화를 측정할 수 있는 좋은 방법을 제공할 것입니다. 모든 소포가 미세 소관으로 공동 화되지만 미세 소관의 비율 만 소포와 함께 공동 화한다고 가정하면 각 채널에 대한 고객 센터를 계산하고이 분수 중첩을 정량적으로 설명하는 메트릭을 얻을 수 있습니다.
요구 사항:고객 센터 캐치는 배경의 제거를 필요로한다는 것입니다. 여기서 가장 까다로운 부분은 배경 빼기를 가능하게하는 강도에 대한 컷오프 포인트를 설정하는 것입니다. 고객 센터는 모든 위의 제로 픽셀에서 하나의 프로브의 완전한 형광을 측정합니다. 그러나 제로 픽셀 이상은 다음과 같은 요인으로 인해 매우 드뭅니다: 자동 형광,빛 누출,비특이적 라벨링 또는 초점이 맞지 않는 이미지 평원에서 형광. 따라서 고객 센터의 측정은 임계 값(컷오프)의 신중한 선택이 필요합니다.
이 작업을 수행하는 첫 번째 방법은 전역 임계값으로,각 픽셀에서 임계값을 빼서 선택한 컷오프 아래의 모든 레벨이 배경이 되고 위의 모든 픽셀이 관심 영역으로 떨어질 수 있도록 하는 것입니다. 이것은 매우 직관적이지만 전역 임계값은 다소 조잡하며 배경에 가깝지만 실제로는 긍정적 인 낮은 값의 픽셀을 배제하는 것과 같은 원치 않는 상황을 초래할 수 있습니다.
보다 자동적이고 덜 주관적인 옵션은 임계 값을 여러 번 계산하여 추정하는 코스 테 방법입니다. 이는 양수이므로 제외해서는 안 되는 픽셀 값의 범위를 정의하는 데 사용됩니다. 각 픽셀의 각 그룹에 대해 계산되며,각 픽셀이 0 과 같거나 0 에 가까운 픽셀 값은 임계값으로 사용됩니다. 그럼에도 불구하고 신호 대 잡음비가 낮은 이미지에서 레이블이 지정된 구조를 배경과 구별하지 않도록 매우 낮은 임계 수준을 식별 할 수 있기 때문에 시각적으로 확인해야합니다.
권장 대상:실험의 생물학적 문제가 단백질/구조가 겹치는 정도에 관한 경우,고객 센터는 선택의 척도가되어야합니다. 이러한 계수는 보다 더 직관적으로 해석됩니다.,신호 비례(각 프로브에 의해 레이블이 지정된 구조 수의 차이)와 독립적입니다.
분석을 시작하기 전에
어떤 콜로컬라이제이션 측정을 선택하든 이미지 수집이 올바른 방식으로 수행되는 것이 매우 중요합니다. 가능한 한 많은 요소를 제어하고 가능한 한 많은 변수를 모니터링할 수 있는 컨트롤 샘플 집합을 준비하십시오.
관찰자의 주관성,각 개인의 두뇌가 색을 다르게 볼 수 있다는 사실,관찰자의 색맹 가능성,픽셀 크기를 결정하는 공간 해상도 등 많은 요인에 의해 시각적 색소화 결정이 영향을 받는다는 것을 명심하십시오. 분석할 이미지를 일정한 방식으로 처리해야 하며,통제되지 않은 조작으로 인해 관련 정보가 손실될 수 있습니다.
그리고 마지막으로
이러한 계산은 대부분의 이미지 분석 소프트웨어 패키지에서 구현됩니다. 그러나 콜로컬라이제이션을 측정하는 것이 여전히 다소 혼란스러운 분야라는 점을 감안할 때 개선이 필요하므로 소프트웨어의 새 버전 및 패키지를 추적하십시오.
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문학:
던 킬로와트,카모카,맥도날드 제이. 생물학적 현미경 검사에서 색소화 평가에 대한 실용적인 가이드. 또한,형광 현미경에서의 색소화 분석,형광 현미경에서의 색소화 분석,형광 현미경에서의 색소화 분석,형광 현미경에서의 색소화 분석,형광 현미경에서의 색소화 분석,형광 현미경에서의 색소화 분석,형광 현미경에서의 색소화 분석,형광 현미경에서의 색소화 분석,형광 현미경에서의 색소화 분석,형광 현미경에서의 색소화 분석,형광 현미경에서의 색소화 분석,형광 현미경에서의 색소화 분석,형광 현미경에서의 색소화 분석,형광 현미경에서의 색소화 분석. 에서:Taatjes,Douglas J.,로스,Jürgen(ed.세포 이미징 기술:방법 및 프로토콜,뉴욕:휴 매나 프레스,2012,97-109 쪽
던 킬로와트. 생물학적 현미경 검사에서 대장 화 측정에 대한 통계 테스트. 현미경 저널. 2013; 252(3): 295-302
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