박테리아 균주 및 플라스미드
이 연구에 사용 된 플라스미드는 표 2 에 나와 있습니다. 높은 온도에서 에스테르 생산을 위한 호스트로서 사용되었다. 그것은 주목해야한다는 것의 삭제 hypoxanthine phosphoribosyltransferase 유전자(hpt,Clo1313_2927)야생에서 형 DSM1313 할 수 있습 유전공학에 의해 8-azahypoxanthine(8-시작 메뉴)카운터의 선택과 이를 삭제하지 않는 모든 알려진 부작용에 효과 세포의 성장을 촉진합니다. 고양이들을 함유한 플라스미드는 열안정성이 뛰어나며,다양한 고양이들을 표출하는데 사용되었다. 애완 동물 플라스미드는 대장균에 있는 분자 클로닝 그리고 효소 표정을 위해 이용되었습니다.
화학물질 및 시약
모든 화학물질은 시그마-알드리치(미국 미주리주)및/또는 써모 피셔 사이언티컬(미국 미주리주)에서 구입하였다. 분자 클로닝의 경우,제한 효소와 티 4 리가 제를 뉴 잉글랜드 바이오 랩스(미국,미국)에서 얻었다. 폴리 메라 제 연쇄 반응(폴리 메라 제 연쇄 반응)을 위해 사용되었다.
배지와 배양용
분자복제 및 단백질 발현을 위해,달리 명시되지 않는 한 적절한 항생제가 함유된 리소제니 배지에서 대장균 균주를 재배하였다. 대장균의 생체 내 특성화를 위해 20 그램/엘 포도당을 가진 하이브리드 배지가 사용되었습니다. 2.화학물질의 화학적 조성,물리적 특성,물리적 특성,물리적 특성,물리적 특성,물리적 특성,물리적 특성,물리적 특성,물리적 특성,물리적 특성,물리적 특성,물리적 특성,물리적 특성,물리적 특성,물리적 특성,물리적 특성,물리적 특성. 광학 밀도(외경)는 600 나노 미터 파장의 분광 광도계에 의해 측정되었습니다(스펙트로닉 200+,써모 피셔 과학,석사,미국).또한,다수의 서열 정렬 분석(1092
메가 7 을 사용하여 다수의 서열 정렬 분석을 수행하였다. 단백질 서열을 클루 스탈에 의해 정렬하고 에스프립 3.0(http://espript.ibcp.fr)에 의해 가시화 하였다. 단백질 구조의 주요 특징은 각각 캣살티,캣살릭스,캣살릭스,캣살릭스,캣살릭스,캣살릭스,캣살릭스,캣살릭스,캣살릭스,캣살릭스 및 캣살릭스로부터 추출되었다.
분자 모델링 및 도킹 시뮬레이션
3 차원(3 차원)구조
관심있는 캣사와 알콜의 3 차원 구조는 스위스 모델과 모에(분자 운영 환경 소프트웨어,버전 2019.01)의’빌더’도구를 사용하여 처음 생성되었습니다. 이중 기판 경계 캣사 착물(즉,아세틸-코아-이소부탄올–캣사)의 3 차원 구조는 이소부탄올–캣사 착물로부터 이소부탄올을 추출한후 이를 아세틸–코아-캣사 착물에 첨가함으로써 얻어졌다. 모든 구조는 기본 매개 변수와 모에의’빠른 준비’도구에 의해 제조 및 더 앰버 10 과 에너지 최소화에 의해 최적화되었다.
도킹 시뮬레이션
도킹 시뮬레이션을 수행하기 위해 모에의’사이트 찾기’도구를 사용하여 잠재적 바인딩 포켓을 검색했습니다. 보고 된 촉매 사이트와 일치 하는 최고의 점수 사이트 추가 연구에 대 한 선정 됐다. 도킹 시뮬레이션은 이전에 설명 된대로 수행되었습니다. 간단히 말해서,아세틸-코아 및 각 알코올은 삼각형 매처 배치 방법 및 런던 매처 스코어링 기능을 사용하여 유도 된 맞춤 프로토콜을 사용하여 도킹되었습니다. 도킹 시뮬레이션 후 잔류 물과 루트 평균 제곱 편차에서 기판 사이의 중요 한 상호 작용을 보여주는 최고의 득점 바인딩 포즈<2,000,000,000,선택 되었다. 아세틸-코아 도킹의 예로서,세르-148 의 수산기와 코아의 엔 71 사이의 수소 결합을 나타내는 결합 포즈가 선택되었다. 알코올 도킹을 위해,그의-189 의 엔 3 과 알코올의 수산기 사이의 수소 결합을 보여주는 결합 포즈가 선택되었다.
실리코 돌연변이 유발 분석
아세틸-코아–이소부탄올–캣사 복합체의 실리코 돌연변이 유발 분석에서 앞서 설명한 바와 같이 수행되었다. 특히,’알라닌 스캔’및’잔류물 스캔’도구 모에 돌연변이 유발에 대 한 잠재적인 잔류물 후보를 식별 하는 데 사용 되었다.
분자 클로닝
플라스미드 구성
플라스미드는 추가 파일 1:표 1 에 나열된 프라이머를 사용하여 리가 제 의존 방법 및/또는 깁슨 어셈블리의 표준 분자 클로닝 기술에 의해 구성되었다. 생성 된 플라스미드는 열 충격 변환에 의해 대장균 톱 10 에 도입되었습니다. 선택적 플레이트에 고립 된 식민지를 스크리닝 하 고 플라스미드 정제 했다. 정제된 플라스미드는 생거 시퀀싱을 통해 확인되었다. 사이트 지향 돌연변이 유발 감소 오버랩 길이 또는 깁슨 조립 방법으로 퀵 체인지 및 사이트 지향 돌연변이 유발 프로토콜을 사용하여 수행되었습니다. 에 대한 C.thermocellum 엔지니어링,플라스미드 pHS005 건설되었다 처음 수정을 pHS0024. 플라스미드의 다른 서열은 동일하다.
변형
종래의 화학적 변형 및 전기충격 방법은 대장균 및 다.열전 세포의 변형에 각각 사용되었다. 에 대한 열 세포,방법은,그러나,약간 여기에 설명 된대로 수정되었습니다. 본 발명의 실시예에서,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,또는,미국). 0.8-1.0 범위의 외경을 이용한 세포 배양을 실온에서 20 분 동안 냉각시켰다. 이 점을 넘어 모든 단계가 챔버 외부에서 수행되었습니다. 냉각 세포에서 수확 6500×g 고 4°C20min. 상기 세포 펠릿을 얼음냉각 밀리큐 물 2 회 세척하고,250 밀리 수크로오스 및 10%글리세롤로 이루어진 변형 완충액 200 밀리 수크로스에 재수입하였다. 여러 30µL 분취의 electrocompetent 셀 즉시장에서 80°C 으며,계속 사용하실 수 있습니다. 전기충격을 위해,전기능력 세포를 얼음 위에서 해동하고,500-1000 응의 메틸화 플라스미드로 10 분 동안 배양하였다. 그 후,세포를 얼음으로 식힌 1-밀리미터 갭 일렉트로 포 레이션 큐벳(미국 매사추세츠 주 하버드 장치)으로 옮긴 다음 1 과 함께 2 개의 연속적인 지수 붕괴 펄스로 옮겼다.8kV,350Ω,25µF. 펄스 일반적으로 결과 7.0-8.0 밀리 시간 상수. 상기 세포들은 즉시 미리 데워진 신선한 씨티푸드-뉴욕에 재수입되었고,고무 캡핑된 발치 튜브 내부의 혐기성 조건(90%엔 2,5%수소및 5%이산화탄소)하에서 50 씨티푸드에서 회수되었다. 0-12 시간의 회복 후,세포를 용융 된 씨푸드-뉴욕 한천 배지와 혼합 하였다. 마지막으로,중간 세포 혼합물을 페트리 접시에 붓고 혐기성 챔버 내부에서 응고시켰다. 접시는 식민지가 나타날 때까지 최대 1 주까지 50,000,000 에서 배양 하였다. 변환 효율은 플라스미드 당 2-100 콜로니 형성 단위였다.
대장균에서의 캣사 및 그 변이체의 생체내 특성화
대장균에서의 캣사 및 그 변이체의 생체내 특성화를 위해,다양한 알콜의 2 그램/리터를 첨가하여 앞서 설명한 바와 같이 고세포 밀도 배양을 수행하였다. 에스테르의 제자리 적출을 위해,각 튜브는 25%(브이/브이)헥사 데칸으로 중첩되었다. 15 밀리리터의 배양관에서 37 밀리리터의 배양관과 200 밀리리터의 배양관에서 밤새 성장하였다. 그 후,하룻밤 배양 물의 4%를 24 웰 마이크로 플레이트에서 항생제를 함유하는 1 밀리리터의 파운드 배지로 옮겼다. 배양용 마이크로플레이트 셰이커를 사용하여 배양용 마이크로플레이트 셰이커를 0.4–0.6 에 도달한 후 0 에 의해 유도될 때까지 배양용 마이크로플레이트 셰이커를 사용하여 배양용 마이크로플레이트 셰이커에서 배양하였다.2.유해화학물질관리법에 의한 규제 라.폐기물관리법에 의한 규제 폐유기용제중 할로겐족에 해당되는 물질 규제되지 않음. 단백질 시료는 제조자의 지시에 따라 비-당 완전한 시약(고양이#89822,열 과학,석사,미국)을 사용하여 얻어졌고,에 의해 분석되었다.
효소 특성화
그의 태그 정제
효소 발현을 위해,1 박 배양을 접종하였다:200 분당 회전수 진동 인큐베이터에서 밤새 배양(최대 20 시간)하였다. 유도세포를 수확하고 원심분리 4°C4700×g10min. 그 후,셀 펠렛을 밀리포 물로한 번 세척하고,비-당 완전 시약에 다시 현탁시켰다. 상온에서 30 분 배양 한 후,혼합물을 17,000 에서 2 분 동안 원심 분리 하였다. 상청액을 수집하여 조 추출물로 지정하였다. 그의 태그 정화를 위해,원유 추출물은 제조업체가 권장하는대로 일괄 적으로 히스 푸르 니–노타 슈퍼 플로우 아가로 오스와 함께 배양되었습니다. 그 후,수지를 적어도 3 부피의 세척 완충액으로 세척하여,50 밀리미터의 트리스-에이치엘,300 밀리미터의 나클,10 밀리미터의 이미다졸,및 0.1 밀리미터의 에타로 구성하였다. 수지 행이는 단백질 용출하여 300µL 용출 버퍼 포함하는 50mm Tris–HCl(pH8.0),50mM NaCl,300mM 이미다졸고,0.1mM EDTA. 그 후,용출된 샘플을 탈염하고 아미콘 필터 칼럼을 통해 농축시켰다. 마지막으로,단백질 샘플을 200 에 현탁 하였다. 단백질 농도는 브래드포드 분석법에 의해 소 혈청 알부민을 기준 단백질로 측정하였다.단백질 용해 온도를 측정하기 위해,시프로 오렌지와 함께 열 불소 분석법을 사용하였다. 에 대한 10-250µg 그의 태그 정제 단백질 혼합 5×SYPRO 오렌지에는 50µL 최종 볼륨에 96-well qPCR 판이다. 플레이트는 분석을 실행하기 전에 인쇄 회로 기판 캡으로 밀봉 하였다. 2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월각 고양이에 대한 반응 속도는 384-웰 플레이트에서 디티오비스계 분석법에 의해 결정되었다. 상기 반응 완충액을 포함하는 총 반응량은 50 내지 50 밀리의 트리스–하이히치엘(산도 8.0)으로 하였다. 아세틸-코아(미국 텍사스 주 코알라 생명과학)와 알콜의 농도는 각 실험에 명시된 바와 같이 다양했다. 클로람페니콜 및 알콜에 대한 반응에 각각 0.05 의 최종 효소 농도 및 10 의 최종 효소 농도를 사용 하였다. 반응 속도론은 마이크로 플레이트 판독기(시너지 마이크로 플레이트 판독기,바이오텍)에서 1 시간 동안 1 분마다 412 나노 미터의 흡광도를 측정하여 수집되었습니다. 반응 속도는 동일한 조건 하에서 자유 코엔자임의 표준 곡선으로부터 소멸 계수를 사용하여 계산 하였다. 판 판독기에 권장되는 최대 작동 온도가 50 이므로 높은 온도에서 고양이에 대한 높은 처리량 효소 분석은 효소 속도론 매개 변수를 결정하기 위해서만 수행되었다는 점에 유의해야합니다.
반응 속도에 대한 운동 파라미터 계산
미카엘–멘텐 속도 법칙의 파라미터(식. 1)각 효소에 대해 다음과 같이 계산하였다. 첫 번째,선형 회귀 초기 반응 속도,\(와이_{나는}\),다른 초기 기판 농도,\(에스_{나는}\)를 식별 하기 위해 마이크로 플레이트 리더에서 수집 된 데이터에 대해 수행 되었다,여기서 나는={1,2,…,엔}수집 된 데이터 포인트의 수입니다. 그런 다음,모든 복제에 대한 이러한 초기 반응 속도 및 관련 초기 기질 농도는 동시에 미카엘리스–멘텐 모델에 적합했습니다. 1)강력한 비선형 회귀 분석 사용(식. 2)소프트 엘 1 손실 추정기(식. 3)스키피 수치 컴퓨팅 라이브러리 버전 1.2.0 에서 구현 된대로 :
최소제곱 문제는 모델 예측 반응속도와 측정된 반응속도의 차이를 최소화하여 매개 변수를 결정합니다. 2). 평활화 함수\(\로\왼쪽(지\오른쪽)\)는 최소 제곱 문제를 특이치에 저항력있게 만드는 데 사용됩니다. 3). 특이치에 대한 편견없는 저항과 기존의 선형화 방법으로 인한 오류 방지로 인해 강력한 비선형 회귀는 미카엘-멘텐 모델에 대한 가장 정확한 모수 추정치를 제공합니다.
펠렛 단백질을 측정하여 세포 성장을 모니터링하였다. 800 물 샘플링에서 셀-셀 룰 로스 펠 릿을 밀리-큐 물으로 두 번 세척 하 고 200 물 용해 버퍼(0)에 의해 중단 했다.실온에서 1 시간 배양 하였다. 그런 다음 솔루션으로 중화시킨 후 50µL0.8M HCl 및 희석하여 550µL 물. 혼합물을 17,000 제곱미터에서 3 분 동안 원심분리하였다. 상층액에서 단백질 농도는 세제 호환성 브래드포드 분석실험에 의해 분석되었습니다(미국 워싱턴 주 서모 사이언티픽). 잔류 펠렛을 잔류 셀룰로오스를 정량화하기 전에 1 시간 동안 98 제곱미터의 오븐에서 삶았다.
잔류 셀룰로오스를 일부 변형하여 페놀–황산 방법에 의해 정량화 하였다. 비등된 샘플을 밀리큐 물로 두 번 세척하고 800 물(물)에 부유시켜 원래의 부피와 동등한 부피를 만들었다. 10 초 동안 피펫팅 및 와류에 의해 시료를 균질화하고,균질화된 시료의 20 개를 새로운 2.0 밀리리터의 미세 원심 분리기 튜브 또는 96 웰 플레이트로 옮기고,55 밀리리터의 오븐에서 밤새 건조시켰다. 건조된 펠릿을 95%황산의 200,000,000 에 부유시키고 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 펠렛을 완전히 용해시킨 후,5%페놀의 20,000 페놀을 첨가하고 황산 용액과 혼합 하였다. 실온에서 30 분 배양 한 후,샘플 100 개를 새로운 96 웰 플레이트로 옮기고 490 나노미터의 흡광도를 측정 하였다. 흡광도는 동일한 절차에 의해 처리 된 아비 셀 산도-101 의 표준 곡선에 의해 셀룰로오스 농도로 전환되었다.
분석 방법
고성능 액체 크로마토그래피
고성능 액체 크로마토그래피 시스템을 사용하여 세포 외 대사 산물을 정량화 하였다. 미국). 17,000 개의 배양 샘플을 3 분 동안 원심 분리한 후,상청액을 0.2 개의 여과기를 통해 여과하고,1000 개의 이동상을 아미넥스 상에서 0.6 밀리리터/분으로 실행하였다. 220 나노미터의 굴절률 검출기와 자외선 검출기를 사용하여 당,유기산 및 알콜의 농도를 모니터링하였다.또한,가스 크로마토그래피(질량 분광법)와 결합된 에스테르는 가스 크로마토그래피(마력 6890,애질런트,캘리포니아,미국)가 장착된 가스 크로마토그래피(마력 5973,애질런트,캘리포니아,미국)에 의해 측정되었다. 에 대한 GC 시스템 Zebron ZB-5(Phenomenex,CA,미국)모세관 칼럼(30m×0.25mm×0.25μm)를 사용하여 별도의 분석은,그리고 헬륨었으로 사용되는 캐리어의 흐름율이 0.5mL/min. 오븐 온도 프로그램은 다음과 같이 설정:50°C 초기 온도 1°C/min 최대 58°C,25°C/min 최대 235°C,50°C/min 최대 300°C 이고,2 분 굽-에서 300°C.1µL 의 샘플링 hexadecane 층에 주입의 열 splitless 모드 인젝터 온도의 280°C. MS 시스템을 선택한 이온 모드(SIM)을 사용하였을 검출하고 정량화 에스테르 다음 매개변수:(i)에틸 아세테이트,m/z45.00 및 61.00 부터 4.2 4.6min 보존 기간(RT),(ii)이소프로필 아세테이트,m/z45 102 부터 4.7 5.0 분 RT(iii)프로필 아세테이트,m/z59 73 부터 5.2 5.8 분 RT(iv)에틸 isobutyrate, m/z73 116 에서 제 6.1 조 내지 제 6.6 조의 분 RT(v)이소부틸 아세테이트,m/z61 101 부터 6.6 7.6 분 RT(vi)부틸 아세테이트,m/z61 및 116 부터 7.7 9.2 분 RT(vii)이소부틸 isobutyrate,m/z89 129 부터 10.1 12.이소아밀 알코올 및 이소아밀 아세테이트는 내부 표준 분석물로서 사용되었다. 에스테르는 실온에 의해 확인되고 피크 영역 및 표준 곡선에 의해 정량화되었다. 1990 년대 초반,1990 년대 초반,1990 년대 초반,1990 년대 초반,1990 년대 초반,1990 년대 초반,1990 년대 초반,1990 년대 초반,1990 년대 초반,1990 년대 초반,1990 년대 초반,1990 년대 초반,1990 년대 초반,1990 년대 초반.