L’US Food, Drug and Cosmetic Act del 1938 richiedeva ai produttori e alle aziende farmaceutiche di essere responsabili della sicurezza degli additivi / eccipienti nei loro prodotti in risposta a una tragedia in cui 100 bambini sono stati uccisi dalla presenza di glicole dietilenico in un prodotto antibatterico. Per aiutare a chiarire ciò che è necessario per stabilire un nuovo eccipiente, la FDA ha pubblicato un documento di orientamento nel 2005 intitolato “Studi non clinici per la valutazione della sicurezza degli eccipienti farmaceutici”, che delinea gli studi di sicurezza necessari per avere un eccipiente approvato1,2. Articoli recenti hanno chiesto la necessità di ulteriori eccipienti alternativi per l’uso nelle formulazioni1,3,4. I formulatori preferiscono generalmente gli eccipienti precedenti a causa del loro profilo di sicurezza ben consolidato, nonché dei rischi e dei costi associati all’approvazione di un nuovo eccipiente3. Quando si qualifica un nuovo eccipiente, è necessario eseguire studi di sicurezza e, nel caso di un evento avverso, sussistono dubbi sul fatto che l’evento avverso sia dovuto all’eccipiente o al prodotto. Quando si utilizza un eccipiente, mentre l’esperienza precedente con qualsiasi via di somministrazione iniettabile è preziosa nella giustificazione del suo uso, vale la pena notare che,secondo le normative vigenti, la modifica della via di somministrazione o l’aumento della concentrazione oltre la dose massima attuale possono richiedere ulteriori dati di sicurezza1, 2. La necessità di nuovi eccipienti è ben riconosciuta, ma ampliare le nostre conoscenze nell’uso di eccipienti meno diffusi è altrettanto importante offrendo al contempo un percorso normativo più semplice.
Determinare il pH corretto e il sistema tampone è probabilmente il passo più critico nella formulazione di una proteina per garantire la sua solubilità e stabilità (chimica e fisica)3,5-7. L’articolo si concentrerà sulla stabilizzazione della bioterapeutica. I buffer trovati sia in piccole molecole che in formulazioni parenterali proteiche approvate dalla FDA saranno indicati come giustificazione per esplorare gli effetti stabilizzanti di questi buffer sulle proteine. La tabella 1 elenca il numero di formulazioni uniche trovate cercando le etichette dei prodotti approvati dalla FDA. Sono state escluse formulazioni identiche derivanti dalla formulazione di prodotti generici o dosaggi diversi. Ogni volta che si fa riferimento alla forma salina del tampone, si deve presumere che il tampone sia titolato con idrossido di sodio o acido cloridrico poiché questi sono i titolanti più comuni.
I tamponi più comuni trovati per essere utilizzati nelle formulazioni parenterali sono stati citrato, fosfato e acetato. Verranno evidenziati alcuni punti di forza e di debolezza associati a questi eccipienti. L’obiettivo di questo documento è quello di attirare l’attenzione su altri agenti di buffering approvati, ma meno comunemente usati, che richiedono un uso più esteso per diventare generalmente accettati. Mentre questo articolo si concentrerà esclusivamente sui buffer, lo stesso argomento si estende ad altri tipi di eccipienti. Man mano che la biotecnologia si evolve come industria e si sviluppano scaffold proteici più unici, diventerà sempre più importante trovare nuovi modi per stabilizzare queste proteine. A volte gli eccipienti più comuni non saranno sufficienti per fornire un’adeguata stabilità o abilitare le tecnologie di somministrazione del farmaco.
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Comunemente usato buffer
fosfato di Sodio
fosfato di Sodio (pKa 2.1, 7.2, e 12.3) è il più comunemente usato buffer trovato in formulazioni parenterali (Tabella 1). La limitazione più notevole nell’uso del fosfato come tampone è l’effetto del congelamento sulle variazioni del pH. Lo spostamento del pH durante il congelamento è stato studiato ampiamente. Lo spostamento del pH è attribuito alla cristallizzazione selettiva del sale dibasico. La cristallizzazione può essere influenzata dal tasso di congelamento, dal pH iniziale e dalla presenza di altri cosoluti. Uno spostamento del pH di circa due unità è abbastanza tipico durante il congelamento, ma sono stati segnalati spostamenti del pH fino a 3,6 uniti8-10. L’ambiente mutevole del pH può destabilizzare le proteine durante il trattamento della sostanza farmaceutica sfusa o la liofilizzazione delle soluzioni dei farmaci11-17. Ciò è particolarmente preoccupante in condizioni in cui vengono utilizzate alte concentrazioni di fosfato o altri eccipienti cristallizzanti sono presenti in quanto queste condizioni aiutano a indurre la cristallizzazione del fosfato. Le soluzioni contenenti alte concentrazioni di proteine o soluti non cristallizzabili (ad esempio saccarosio) inibiscono la cristallizzazione dei fosfati e minimizzano gli spostamenti del pH.
Acido citrico
L’acido citrico è uno dei tamponi più comunemente usati (Tabella 1). È un tampone trivalente contenente tre acidi carbossilici con pKa di 3.1, 4.8 e 6.4 (Tabella 2) che offre un’ampia gamma di bufferizzazioni5. Secondo il database degli ingredienti inattivi della FDA, il citrato si trova in oltre 100 prodotti iniettabili approvati, dandogli una grande storia di utilizzo e dimostrando la sua sicurezza.
Tuttavia, studi che confrontano le iniezioni sottocutanee di formulazioni tamponate con citrato contro formulazioni paraboliche tamponate con fosfato o istidina hanno stabilito che le soluzioni tamponate con citrato inducevano più dolore dopo l’iniezione sottocutanea18-20. Anche se questo dolore è stato relativamente breve nella durata (meno di due minuti), solleva preoccupazioni di conformità del paziente con iniezioni di auto-somministrazione contenenti citrato18. Quando si formula con acido citrico, si deve indicare il profilo del prodotto target e la via di somministrazione prevista. Quando sono previste frequenti iniezioni sottocutanee, un altro agente tampone può essere più appropriato.
Acido acetico
L’acido acetico ha un pKa di circa 4,8, offrendo un intervallo di buffer di 3,7 – 5,6 (Tabella 2). L’uso di acido acetico è ideale per la formulazione di proteine stabili allo stato liquido in condizioni acide. La liofilizzazione delle soluzioni di acido acetico è accompagnata da un aumento del pH dovuto alla sublimazione della forma acida volatile del tampone, lasciando dietro di sé il sale basico. Ciò è potenzialmente destabilizzante per la proteina e rende difficile il controllo del pH nei prodotti farmaceutici liofilizzati.
Buffer aggiuntivi approvati
Trometamina
Trometamina (Tris) (pKa 8.1) ha proprietà simili al fosfato (pKa 7.2) e potrebbe essere usato come sostituto vicino a condizioni di pH neutro. Entrambi i tamponi mostrano un cambiamento di pH durante il congelamento. In condizioni identiche, lo spostamento del pH per la trometamina (+2.1) era circa uguale a quello del fosfato (1.8), ma nella direzione opposta (Tabella 2)8.
La scelta di un buffer rispetto ad un altro dipenderebbe probabilmente dalla sensibilità della singola proteina alla direzione dello spostamento del pH e da eventuali interazioni specifiche tra proteine e buffer. Trometamina e istidina hanno dimostrato di essere stabilizzanti migliori del fosfato quando l ‘eritropoietina è stata sottoposta a stress ad alta temperatura, prevenendo l’ aggregazione favorendo la reversibilità dello svolgimento21. Ure2p ha dimostrato di essere più stabile contro la formazione di fibrille quando formulato in trometamina rispetto a fosfate22.
Istidina
L’istidina, un aminoacido essenziale, sta diventando sempre più comune nelle formulazioni di terapie proteiche. Avendo un pKa di 6.1, è ideale per le formulazioni proteiche vicino a condizioni neutre (Tabella 2).
L’istidina ha dimostrato di proteggere un anticorpo monoclonale sia allo stato liquido che liofilizzato contro lo stress da calore23-25. Gli studi che hanno esaminato la stabilità di interferone-tau hanno dimostrato che le formulazioni contenenti istidina (seguita da Tris poi fosfato) erano le più stabili contro l’aggregazione indotta dal calore. Questa stabilizzazione è stata attribuita al legame diretto dell’istidina con la proteina26. Durante la liofilizzazione, l’istidina e l’acido aspartico hanno dimostrato di proteggere gli anticorpi agendo come donatori di legame idrogeno per preservare i fogli β-24-25 intramolecolari. Ulteriormente, l’istidina è stata trovata per avere le proprietà di un antiossidante a causa della sua capacità di legare gli ioni del ferro e l’ossigeno del singoletto 24,27. Lo svantaggio dell’utilizzo di istidina è che le soluzioni di istidina sono state osservate per cambiare colore a temperature accelerate e pH acido, nonché estrarre il ferro dall’acciaio inossidabile24.
Acido gluconico, lattico e tartarico
Gluconico, acido lattico e acido tartarico sono eccipienti che sono stati utilizzati quasi esclusivamente in formulazioni di piccole molecole. Il gluconato di calcio è stato concesso in licenza per il trattamento delle ustioni di fluoruro di idrogeno attraverso un’applicazione topica. Nei casi più gravi è stata utilizzata un’infusione di una soluzione di gluconato di calcio al quattro per cento in soluzione salina per la prevenzione dei danni tissutale28. Delle 23 formulazioni iniettabili disponibili in commercio contenenti acido lattico trovate nel database degli ingredienti inattivi della FDA, quattro formulazioni sono utilizzate per i biologici: due peptidi e due proteine. Delle 12 formulazioni contenenti acido tartarico, solo una è stata utilizzata nella formulazione di una proteina. Questi tamponi possono essere idonei sostituti dell’acetato e del citrato.
L’acido gluconico è un composto naturalmente formato dall’ossidazione del glucosio. È un composto interessante in quanto ha il potenziale per agire come tampone, stabilizzatore e agente chelante a causa della sua struttura contenente acidi carbossilici e gruppi idrossilici.
Il tartarato ha dimostrato di migliorare la ritenzione del monomero rispetto al citrato in una formulazione anticorpale a pH 4,0-4,5 se conservato come liquido a 25°C29. È stato ipotizzato che i gruppi idrossilici in tartarato, citrato, malato e per estensione lattato e gluconato potrebbero fornire legami idrogeno stabilizzanti nella fase amorfa di una torta liofilizzata30-31.
Acido aspartico e glutammico
Sia l’acido aspartico che l’acido glutammico si trovano nelle infusioni somministrate a neonati e pazienti pediatrici con concentrazioni plasmatiche insufficienti di aminoacidi. In TrophAmine®, aspartato e glutammato vengono infusi rispettivamente a concentrazioni di 22 mM e 34 mm32. Queste concentrazioni sono sufficientemente elevate da fornire un adeguato tampone delle formulazioni proteiche.
L’acido glutammico formulato con quantità uguali di arginina ha dimostrato di migliorare la stabilità e la solubilità delle proteine intracellularie23,33 e di prevenire l’aggregazione durante la ricostituzione23,34-35. Studi su insulina e albumina sierica umana indicano che l’aggiunta di glutammato e aspartato è stata in grado di inibire la formazione di aggregati36-38. Gli studi con pegfilgrastim hanno indicato che la stabilità di pegfilgrastim formulato in glutammato o formiato era paragonabile a acetata39.
Intermedi del ciclo dell’acido citrico
Citrato, fumarato, α-chetoglutarato, malato e succinato sono tutti intermedi del ciclo dell’acido citrico ritenuti sicuri ed efficaci come tamponi o contro ioni nelle formulazioni iniettabili. Fumarato, α-chetoglutarato, malato e succinato sono stati utilizzati in un numero limitato di prodotti (Tabella 1). È ovvio che gli altri intermedi del ciclo di Krebs possono anche essere appropriati per l’uso in parenterali. Questi composti includono aconitato, isocitrato e ossaloacetato. Essendo acidi carbossilici bivalenti e trivalenti, hanno PKA che vanno da 2,0 a 6,4, rendendo questi composti adatti per una vasta gamma di formulazioni (Tabella 2).
A causa dell’uso limitato di questi composti come tamponi, non è chiaro se lo stesso dolore all’iniezione associato alle iniezioni sottocutanee di citrato sarebbe associato a questi composti. Tuttavia, ci sono altri vantaggi associati al loro uso. È stato dimostrato che il citrato induce la gelificazione di soluzioni anticorpali quando la concentrazione proteica era superiore a 100 mg / mL. Questo è stato attribuito alla natura trivalente del buffer. Succinato, avendo solo due acidi carbossilici, non è stato trovato per avere lo stesso effetto allo stesso pH40.
Conclusione
Determinare il corretto sistema di pH e tampone è fondamentale per portare la bioterapeutica in clinica e sul mercato. La necessità di nuovi eccipienti e una migliore comprensione degli eccipienti esistenti è altamente auspicabile. Istidina, trometamina e una serie di altri tamponi alternativi offrono vantaggi rispetto agli eccipienti usati convenzionalmente. L’uso di questi buffer alternativi non può fare altro che aiutare ad aumentare gli strumenti che i formulatori hanno e può consentire lo sviluppo di un terapeutico che altrimenti potrebbe aver fallito. Per stabilizzare il vasto numero di terapie proteiche in fase di sviluppo, tutti gli approcci dovrebbero essere presi in considerazione.
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Circa l’autore
David Sek ha guadagnato la sua BS in chimica dal Bates College e la sua MS in chimica e biologia chimica dalla Northeastern University. Ha 10 anni di esperienza come scienziato della formulazione e ha trascorso gli ultimi otto anni di lavoro presso Pfizer studiando la stabilità di nuove bioterapie.