Nel 2009 il Brasiliano Agricultural Research Corp. (Embrapa) e Brasilia Giardino Zoologico iniziato scavenging e gelare il sangue, lo sperma e le cellule del cordone ombelicale da collisioni con animali e altri animali selvatici che erano morti, per lo più nel Cerrado savana—incredibilmente variegata collezione di foresta tropicale e pascoli ecosistemi sede di almeno 10.000 specie di piante e più di 800 specie di uccelli e mammiferi, alcuni dei quali vivono in nessun’altra parte del mondo. Gli esemplari sono stati raccolti dal cane cespuglio, dal formichiere dal collare, dal bisonte e dal cervo brocket grigio, tra le altre specie.
L’idea era di preservare le informazioni genetiche della fauna selvatica in via di estinzione del Brasile. Un giorno, ragionavano le organizzazioni, potrebbero essere in grado di utilizzare il DNA raccolto per clonare animali in via di estinzione e rafforzare la diminuzione delle popolazioni. Finora le due istituzioni hanno raccolto almeno 420 campioni di tessuto. Ora stanno collaborando su un progetto correlato che utilizzerà il DNA in questi campioni per migliorare le tecniche di allevamento e clonazione. Le attuali tecniche di clonazione hanno un tasso medio di successo inferiore al 5%, anche quando si lavora con specie familiari; la clonazione di animali selvatici ha solitamente meno dell ‘ 1% di successo.
Tutti gli animali nati durante la nuova impresa del Brasile vivranno nello zoo di Brasilia, afferma il ricercatore di Embrapa Carlos Martins. L’espansione delle popolazioni in cattività di animali selvatici, lui e il suo team sperano, scoraggerà gli zoo e i ricercatori dal prendere ancora più animali selvatici dai loro habitat nativi. Martins ei suoi colleghi non hanno ancora deciso quali specie tenteranno di clonare, ma il lupo dalla criniera e giaguaro sono candidati forti. L ” Unione Internazionale per la conservazione della natura classifica entrambi gli animali come “near threatened” sulla sua lista rossa delle specie minacciate, due livelli al di sotto “in via di estinzione.”
Molti ricercatori concordano sul fatto che, al momento, la clonazione non è una strategia di conservazione fattibile o efficace. Prima di tutto, alcuni ambientalisti sottolineano, la clonazione non affronta le ragioni per cui molti animali diventano in pericolo in primo luogo—vale a dire, la caccia e la distruzione dell’habitat. Anche se la clonazione potrebbe teoricamente aiutare in situazioni veramente disperate, le attuali tecniche di clonazione sono semplicemente troppo inefficaci per fare molta differenza. Rispetto alla clonazione di specie domestiche-in particolare bovini, che sono stati clonati con successo per anni per duplicare tratti desiderabili-la clonazione di specie in via di estinzione è molto più difficile per una serie di motivi.
La clonazione riuscita coinvolge generalmente almeno tre componenti essenziali: il DNA dell’animale da clonare; un uovo vitale per ricevere quel DNA; e una madre per la gestazione dell’embrione risultante. Spesso, centinaia di embrioni e tentate gravidanze sono necessari per produrre anche pochi cloni. Gli scienziati di solito hanno una scarsa comprensione della fisiologia riproduttiva degli animali in via di estinzione, il che rende troppo rischioso estrarre un numero sufficiente di uova da quella specie o affidarsi a femmine di quella specie per dare alla luce cloni. Le protezioni legali a volte precludono anche le specie minacciate da tali procedure. Per compensare, i ricercatori fondono il DNA di una specie in via di estinzione con le uova di una specie strettamente correlata e selezionano le madri da quest’ultima. Tali embrioni ibridi spesso non riescono a svilupparsi correttamente.
Sebbene siano profondamente consapevoli di questi problemi, Martins ei suoi colleghi, così come alcuni altri scienziati in tutto il mondo, pensano che gli sforzi per archiviare le informazioni genetiche della fauna selvatica in via di estinzione siano utili. Alcuni ricercatori rimangono ottimisti sul fatto che la clonazione diventerà uno strumento utile per la conservazione in futuro. Gli ottimisti sottolineano i recenti successi nella clonazione di mammiferi selvatici utilizzando specie domestiche strettamente correlate, tecniche migliorate per prevenire anomalie dello sviluppo in un embrione clonato, una migliore assistenza neonatale per i cloni neonati e la fecondazione in vitro resa possibile da cellule staminali derivate da tessuti congelati.
I primi cloni
Nei primi anni 1950, presso il Lankenau Hospital Research Institute di Filadelfia, Robert Briggs e Thomas King clonarono con successo 27 rane leopardo del nord attraverso un processo noto come trasferimento nucleare. Il nucleo, spesso chiamato il centro di comando della cellula, contiene la maggior parte del DNA di un vertebrato, ad eccezione del DNA all’interno di organelli a forma di fagiolo che generano energia chiamati mitocondri. Briggs e King svuotarono le uova di rana dei loro nuclei, succhiarono i nuclei dalle cellule negli embrioni di rana e iniettarono quei nuclei nelle uova vuote. Molte delle uova si sono sviluppate in girini geneticamente identici agli embrioni che avevano donato il loro DNA nucleare.
Nel 1958 John Gurdon, allora all’Università di Oxford, e colleghi clonarono rane con DNA nucleare estratto dalle cellule di girini completamente formati. A differenza delle cellule embrionali, che sono geneticamente abbastanza flessibili da diventare una varietà di tessuti diversi, le cellule di un girino sono “differenziate”, cioè i modelli di geni che esprimono sono cambiati per adattarsi al profilo di un tipo di cellula specifico: una pelle, un occhio o una cellula cardiaca, per esempio. Gurdon ha dimostrato che, quando trapiantato in un uovo, il DNA nucleare da una cellula matura ritorna allo stato più versatile caratteristico del DNA nelle cellule di un embrione. Questa svolta ha incoraggiato gli scienziati a provare a clonare animali molto più grandi usando il DNA delle cellule adulte.
Nel 1996 i ricercatori in Scozia hanno tentato di clonare una femmina di pecora Finn-Dorset. Hanno iniettato nuclei estratti dalle sue cellule mammarie in quasi 300 uova vuote derivate da blackfaces scozzesi, una razza di pecore diversa. Di quelle uova preparate, gli scienziati sono riusciti a creare più di 30 embrioni. Solo cinque di questi embrioni si sono sviluppati in agnelli dopo essere stati impiantati in blackfaces scozzesi surrogati. E solo uno di quegli agnelli è sopravvissuto fino all’età adulta. I ricercatori la chiamarono Dolly.
Da allora alcuni biologi hanno ripetutamente suggerito che la clonazione potrebbe aiutare a salvare le specie in via di estinzione, specialmente in situazioni disastrose in cui rimangono solo poche decine o una manciata di animali. Più piccola, più omogenea e più inbred una popolazione, più suscettibile è ad una singola mutazione genetica nociva o malattia. I cloni potrebbero teoricamente aumentare la diversità genetica di una popolazione in via di estinzione se i ricercatori hanno accesso al DNA conservato da molti individui diversi. Per lo meno, i cloni potrebbero stabilizzare una popolazione in contrazione. E, alcuni ricercatori sostengono, una popolazione geneticamente omogenea ma stabile sarebbe meglio che l’estinzione; alcuni gruppi altamente inbred di animali selvatici, come il bestiame Chillingham in Inghilterra, sono sopravvissuti bene per centinaia di anni.
Una specie che potrebbe beneficiare della clonazione è il rinoceronte bianco settentrionale, originario dell’Africa. Nel 1960 la popolazione globale di rinoceronti bianchi del nord era più di 2.000, ma il bracconaggio ha ridotto il loro numero ad appena 11 oggi. Secondo l’ultimo conteggio, tre vivono negli zoo-due a San Diego e uno nella Repubblica Ceca—quattro vivono nell’Ol Pejeta Conservancy in Kenya e solo quattro individui possono ancora vivere allo stato brado sulla base di rapporti non confermati, ma non sono stati avvistati in diversi anni. La maggior parte degli animali in cattività non è interessata all’accoppiamento o all’infertilità, sebbene due rinoceronti si siano accoppiati nell’estate del 2012.
Al momento, però, è improbabile che la clonazione aiuti il rinoceronte bianco o qualsiasi altra specie minacciata. Ad oggi, la storia della clonazione di animali in via di estinzione è uno dei pochi successi di alto profilo e molti, molti fallimenti. Dall’inizio degli anni 2000, utilizzando la stessa tecnica che ha prodotto Dolly, i ricercatori hanno clonato diversi mammiferi in via di estinzione e persino estinti, tra cui una pecora muflone e un bovino noto come gaur nel 2001; una specie di bestiame selvatico chiamato banteng nel 2003; una capra selvatica nota come stambecco dei Pirenei nel 2009; e coyote selvatici nel 2012. In ogni caso molti più cloni morirono prima della nascita che sopravvissero; nella maggior parte dei casi nessuno dei cloni sopravvisse fino all’età adulta.
Non corrispondenti
Tutti quei cloni tentati di animali in via di estinzione o estinti sono morti in modi diversi per ragioni diverse, ma tutti hanno condiviso un problema fondamentale: non erano repliche esatte delle loro controparti. Nella maggior parte dei casi, i ricercatori hanno combinato il DNA delle specie minacciate con le uova di una specie domestica correlata. Ogni madre surrogata è spesso impiantato con decine di embrioni ibridi al fine di ottenere almeno un paio di gravidanze, una strategia che richiede l’estrazione di centinaia di uova. Poiché la fisiologia riproduttiva della maggior parte degli animali in via di estinzione è così poco conosciuta, i ricercatori sono spesso incerti quando gli animali ovulano e come meglio acquisire le loro uova. In alcuni casi le protezioni legali impediscono agli scienziati di raccogliere uova da specie minacciate. Per tutti questi motivi, si rivolgono invece a specie domestiche più familiari.
Iniettare il DNA di una specie nell’uovo di un’altra specie—anche se strettamente imparentata—crea un insolito embrione ibrido che spesso non riesce a svilupparsi correttamente nel grembo di una madre surrogata. Gli embrioni ibridi hanno il DNA nucleare della specie clonata e il DNA mitocondriale (mtDNA) dell’uovo donatore. Questa mancata corrispondenza diventa problematica man mano che l’embrione si sviluppa. DNA nucleare e mtDNA lavorano insieme; entrambi contengono ricette genetiche per le proteine con cui le cellule estraggono energia dal cibo. In un embrione ibrido queste proteine non sempre si incastrano correttamente, il che lascia le cellule affamate di energia. Complicando ulteriormente le cose, la madre surrogata spesso rifiuta l’embrione ibrido perché riconosce alcuni dei tessuti dell’embrione, in particolare la placenta, come estranei.
Un altro problema—e il più intrattabile finora—è che un embrione ibrido creato tramite trasferimento nucleare non è una lavagna bianca genetica come la maggior parte degli embrioni. Tutti i vertebrati iniziano la vita come sfere vuote di cellule staminali embrionali, che possono diventare quasi tutti i tipi di cellule adulte. Ognuna di queste cellule staminali contiene una copia dello stesso identico genoma confezionato in cromosomi-fasci stretti di DNA e proteine istoniche. Man mano che l’embrione si sviluppa, le cellule staminali iniziano ad assumere le loro forme adulte: alcune diventano cellule della pelle, altre cellule del cuore e così via. Diversi tipi di cellule iniziano ad esprimere diversi modelli di geni. All’interno di ogni cellula un assortimento di molecole ed enzimi interagisce con il DNA e gli istoni per cambiare l’espressione genica. Alcune molecole, come i gruppi metilici, bloccano fisicamente i macchinari cellulari dalla lettura delle istruzioni genetiche in alcuni segmenti del DNA; alcuni enzimi allentano i legami tra istoni e DNA, rendendo particolari geni più accessibili. Alla fine, ogni tipo di cellula—cellula della pelle, cellula del fegato, cellula cerebrale—ha lo stesso genoma, ma un epigenoma diverso: un modello unico di geni che sono attivamente espressi o efficacemente messi a tacere. Nel tempo, l’epigenoma di una cellula adulta può cambiare ulteriormente, a seconda delle esperienze di vita dell’animale.
Quindi, quando i ricercatori iniettano il nucleo di una cellula adulta in un uovo vuoto, il nucleo porta con sé il suo epigenoma unico. Come i primi esperimenti di Gurdon nel 1950 e studi successivi hanno dimostrato, un uovo è in grado di cancellare l’epigenoma del DNA nucleare introdotto, pulendo la lavagna pulita—in una certa misura. Questo processo di “riprogrammazione nucleare” è poco conosciuto e l’uovo spesso non riesce a completarlo correttamente, specialmente quando l’uovo proviene da una specie e il DNA nucleare da un’altra. La riprogrammazione nucleare incompleta è uno dei motivi principali, pensano gli scienziati, per le molte anomalie dello sviluppo che uccidono i cloni prima della nascita e per i problemi medici comuni a molti sopravvissuti, come il peso alla nascita estremamente alto e l’insufficienza d’organo.
Alcuni ricercatori vedono modi per aggirare questi problemi. Pasqualino Loi dell’Università di Teramo in Italia ha fatto parte di un team che ha clonato con successo pecore muflone in via di estinzione nei primi anni 2000; i cloni sono morti entro sei mesi dalla nascita. Loi e i suoi colleghi pensano di poter aumentare le possibilità che un embrione ibrido sopravviva nell’utero di una madre surrogata. In primo luogo, propongono, i ricercatori potrebbero coltivare un embrione ibrido per un breve periodo in laboratorio fino a quando non si sviluppa in quello che è noto come un blastocisti—gli inizi a forma di palla di un vertebrato composto da un cerchio esterno di cellule, il trofoblasto, che circonda un ciuffo di cellule staminali rapidamente dividendo noto come la massa cellulare interna. Alla fine, il trofoblasto diventa la placenta. I ricercatori potrebbero raccogliere la massa cellulare interna dalla blastocisti ibrida, suggerisce Loi, e trapiantarla in un trofoblasto vuoto derivato dalla stessa specie della madre surrogata. Poiché la madre surrogata ha meno probabilità di rifiutare un trofoblasto dalla propria specie, l’embrione in via di sviluppo all’interno ha molte più possibilità di sopravvivere.
Gli scienziati hanno anche capito come incoraggiare la riprogrammazione nucleare bagnando l’uovo in alcuni composti e sostanze chimiche, come la trichostatina A, che stimolano o inibiscono gli enzimi che determinano l’epigenoma di una cellula. Più di recente, Teruhiko Wakayama del RIKEN Center for Developmental Biology di Kobe, in Giappone, e i suoi colleghi hanno prodotto 581 topi clonati da un singolo topo donatore su 25 generazioni, utilizzando trichostatin A per raggiungere tassi di successo fino al 25% in alcune ma non in tutte le generazioni. Per risolvere la mancata corrispondenza tra mtDNA e DNA nucleare, Loi suggerisce semplicemente di rimuovere l’mtDNA nativo dell’uovo e sostituirlo con mtDNA dalle specie da clonare-qualcosa che i ricercatori hanno provato negli anni ’70 e’ 80, ma non hanno tentato di recente per ragioni che non sono chiare.
Alcuni dei tentativi più riusciti di clonare animali in via di estinzione negli ultimi anni hanno coinvolto due delle specie domestiche più amate: cani e gatti. All’Audubon Center for Research of Endangered Species di New Orleans, Martha Gomez e i suoi colleghi hanno creato molti cloni di gatti selvatici africani dalla metà degli anni 2000, usando gatti domestici come madri surrogate. Gomez dice otto cloni sono sopravvissuti in età adulta finora e sono tutti sani oggi. Attribuisce il suo successo, in parte, al fatto che i gatti selvatici e i gatti domestici sono molto più strettamente correlati tra loro rispetto alla maggior parte delle specie selvatiche e domestiche accoppiate allo scopo di clonare. Lei e il suo team hanno anche imparato ad aumentare i tassi di successo con le sezioni cesariane—per risparmiare ai cloni lo stress di una nascita tipica—e per mantenere i cloni appena nati in terapia intensiva per alcune settimane, come se fossero bambini prematuri. Nel 2008, a. C. Lee della Seoul National University in Corea ei suoi colleghi hanno ottenuto un successo simile usando cani domestici per creare tre cloni di lupo grigio maschi sani. La squadra di Lee aveva precedentemente creato due cloni femminili di lupo grigio. Tutti e cinque gli animali sono sopravvissuti in età adulta, Lee conferma.
Lavorando con gatti dai piedi neri, originari dell’Africa e elencati come “Vulnerabili” nella lista rossa, Gomez si sta ora concentrando su un metodo di clonazione che differisce dal trasferimento nucleare. Sta cercando di trasformare le cellule adulte da gatti dai piedi neri in cellule staminali e successivamente indurre quelle cellule staminali a diventare spermatozoi e uova. Quindi, attraverso la fecondazione in vitro o tecniche simili, poteva impregnare i gatti domestici con embrioni di gatto dai piedi neri. In alternativa, lo sperma e le uova derivati dalle cellule staminali potrebbero essere utilizzati per impregnare le femmine delle specie in via di estinzione.
Dire che questo approccio è tecnicamente impegnativo sarebbe un eufemismo, ma i ricercatori hanno fatto progressi impressionanti. Nel 2011 Jeanne Loring dello Scripps Research Institute di La Jolla, California., e i suoi colleghi hanno prodotto cellule staminali dalle cellule della pelle congelate di due specie in via di estinzione: il rinoceronte bianco settentrionale e un primate simile a baboon noto come trapano. E nel 2012 Katsuhiko Hayashi della Kyoto University Graduate School of Medicine e colleghi hanno trasformato le cellule della pelle da topi adulti in cellule staminali, che hanno poi trasformato in uova vitali. Dopo aver fecondato le uova con lo sperma in provetta, i ricercatori hanno impiantato gli embrioni in topi madri surrogate che hanno dato alla luce prole sana e fertile.
“Non sto dicendo che la clonazione salverà le specie in via di estinzione”, dice Gomez, “ma sono ancora un credente della clonazione come un altro strumento. Non è facile, però. La ricerca si muove lentamente.”
Anche la Loi di Teramo resta ottimista. Pensa che gli scienziati dovrebbero continuare a raccogliere e preservare le informazioni genetiche degli animali in via di estinzione, come ha fatto il Brasile, creando bio-banche di tessuto sul ghiaccio, come lo “zoo congelato” presso l’Istituto per la conservazione della ricerca dello zoo di San Diego. Se i ricercatori riescono ad aumentare drasticamente l’efficienza della clonazione di animali selvatici e in via di estinzione—sia con il trasferimento nucleare o la fecondazione in vitro—allora il DNA di cui hanno bisogno li aspetterà. Se non lo fanno, bio-banche sarà ancora utile per la ricerca più di base. “Una volta che la clonazione di animali in via di estinzione è stata stabilita correttamente, sarà uno strumento molto potente”, afferma Loi. “Se qualcosa può essere fatto, sarà fatto in 10 anni.”