Claudina 1 in Tumorigenesi mammaria: Rivelazione di un possibile nuovo sottoinsieme “Claudina alta” di tumori mammari

Abstract

Le claudine sono la componente principale delle giunzioni strette nelle cellule epiteliali e come tali svolgono un ruolo chiave nella posizione polarizzata dei canali ionici, dei recettori e degli enzimi nei diversi domini di membrana. A questo proposito, i claudini sono necessari per lo sviluppo armonioso di un epitelio funzionale. Inoltre, giunzioni strette difettose sono state associate allo sviluppo del fenotipo neoplastico nelle cellule epiteliali. La ripartizione delle interazioni cellula-cellula e la deregolamentazione dell’espressione delle proteine giunzionali sono quindi credute per essere punti chiave nell’invasione e nella metastasi. Diversi studi suggeriscono che le claudine sono i principali partecipanti alla tumorigenesi mammaria. In questo articolo, discutiamo i recenti progressi nella nostra comprensione del potenziale ruolo di claudin 1 nel cancro al seno. Discutiamo anche il significato di un sottoinsieme di tumori al seno negativi ai recettori degli estrogeni che esprimono livelli “alti” della proteina claudina 1. Proponiamo che claudin 1 funzioni sia come soppressore del tumore che come potenziatore/facilitatore del tumore nel cancro al seno.

1. Cancro al seno

Il cancro al seno rimane uno dei tumori più comunemente diagnosticati tra le donne in Nord America . Sulla base di osservazioni molecolari, epidemiologiche e istologiche, un modello di progressione morfologica per il cancro al seno è stato assemblato nell’ultimo decennio . Questo modello proposto (Figura 1) delinea un continuum di lesioni che descrivono una progressione graduale del cancro al seno, dall’iperplasia epiteliale, attraverso iperplasia atipica e carcinoma duttale in situ, al carcinoma invasivo e alla malattia metastatica . Nonostante molti progressi nella diagnosi e nel trattamento del cancro al seno, la metastasi rimane una sfida insormontabile. Circa il 40% delle donne attualmente falliscono le strategie di gestione primaria per il cancro al seno precoce e alla fine soccombono alla malattia.

Figura 1

Modello ipotetico di tumorigenesi e progressione della mammella. La progressione graduale del cancro al seno è descritta come un continuum di lesioni da iperplasia epiteliale a carcinoma invasivo e infine metastasi.

La natura complessa della presentazione della malattia e le limitazioni nell’identificazione di sottoinsiemi clinicamente rilevanti di pazienti creano grandi difficoltà per le attuali strategie diagnostiche e terapeutiche del cancro al seno. Una crescente comprensione della natura eterogenea di questa malattia è derivata principalmente da studi microarray e immunoistochimici cDNA, che hanno portato a una ridefinizione dei sottoinsiemi del cancro al seno . Ad oggi, sono state identificate 5 distinte categorie di cancro al seno (Tabella 1 ) in base allo stato ER/PR, Her2, CK5/6 e all’espressione EGFR. Dal punto di vista terapeutico, questi sottotipi hanno dimostrato di visualizzare un’ampia varietà di risposte a diversi trattamenti . Il sottotipo luminal A (Tabella 1), che è più sensibile agli ormoni, ha l’esito più favorevole mentre i sottotipi Her2 e basali, che non sono sensibili agli ormoni, sono più aggressivi, dimostrano la prognosi peggiore e hanno meno opzioni terapeutiche . Evidentemente, l’ulteriore identificazione di diversi sottotipi di cancro al seno fornirà maggiori opportunità terapeutiche per abbinare le caratteristiche dei singoli pazienti affetti da cancro al seno, migliorando la nostra capacità di iniziare a offrire un trattamento individualizzato ai pazienti.

Sono stati proposti due modelli ipotetici per spiegare l’evoluzione dei sottotipi del cancro al seno . Nel primo modello, il modello lineare, la cellula di origine è la stessa per diversi sottotipi tumorali (e quindi il sottotipo tumorale è determinato da eventi genetici ed epigenetici acquisiti). Nel secondo modello, il modello non lineare, la cellula di origine è diversa (presumibilmente una cellula staminale o una cellula progenitrice) per i diversi sottotipi. Lavoro recente di Jeselsohn et al. ha fornito prove che suggeriscono che ci sono due popolazioni di cellule progenitrici, una che dà origine ai tumori al seno luminali e l’altra ai tumori al seno basali.

2. Transizione mesenchimale epiteliale (EMT)

Si ritiene che l’acquisizione del fenotipo invasivo segni il cambiamento più significativo nella biologia del cancro al seno in quanto rappresenta il primo passo verso lo sviluppo della malattia metastatica. Quando le cellule si convertono dal fenotipo non invasivo a quello invasivo, diventano indipendenti dall’ancoraggio e presentano una motilità migliorata e una maggiore aggressività, un processo denominato transizione epiteliale-mesenchimale (EMT).

Durante questa transizione, le cellule epiteliali acquisiscono un fenotipo simile al mesenchimale attraverso l’interruzione dell’adesione intercellulare e una maggiore motilità (per la revisione vedere ). Si ritiene che le cellule passino da una rete ricca di cheratina (epiteliale) a una rete ricca di vimentina (mesenchimale) per facilitare la loro motilità . Per quanto riguarda le cellule mesenchimali, a differenza delle cellule epiteliali, possono migrare individualmente, penetrare nei tessuti circostanti e diffondersi in siti distanti . La ripartizione delle interazioni cellula-cellula e l’espressione deregolamentata delle proteine giunzionali sono quindi credute per essere punti chiave nell’invasione e nella metastasi .

3. Giunzioni strette

Le giunzioni strette sono le giunzioni intercellulari più apicali e appaiono come una rete di filamenti continui e anastomosanti sulla faccia protoplasmatica della membrana plasmatica (Figura 2). Contribuiscono alla barriera transepiteliale che controlla il trasporto di ioni e piccole molecole attraverso la via paracellulare, una proprietà denominata funzione “barriera”. Giunzioni strette sono anche cruciali per l’organizzazione della polarità delle cellule epiteliali, separando la membrana plasmatica in domini apicali e basolaterali . Pure, sono inoltre critici per la posizione polarizzata dei canali ionici, dei ricevitori e degli enzimi ai domini della membrana necessari per gli epiteli strutturalmente e funzionalmente sviluppati, una funzione riferita a come la funzione “del recinto”. Le giunzioni strette sono quindi essenziali per la sigillatura stretta dei fogli cellulari e il mantenimento dell’omeostasi . Oltre a mantenere la polarità cellulare e le funzioni paracellulari, le proteine a giunzione stretta sono coinvolte nel reclutamento di proteine di segnalazione . Principalmente, tre tipi di proteine di membrana integrali costituiscono le giunzioni strette(Figura 2); le claudine, l’occludina e le molecole di adesione giunzionali, con le claudine e l’occludina che sono le due componenti molecolari principali nella formazione del filo di giunzione stretto. Si ritiene che la molecola di adesione giunzionale funzioni come spunto spaziale iniziale per la formazione di giunzioni strette . In combinazione con le proteine di giunzione aderenti, che sono responsabili dell’adesione meccanica tra cellule adiacenti e della stabilizzazione dell’intera architettura multicellulare, costituiscono il complesso giunzionale apicale nel tessuto epiteliale .

Figura 2

Giunzioni strette. Le giunzioni strette sono le giunzioni intercellulari più apicali nelle cellule epiteliali. I principali componenti molecolari delle giunzioni strette sono le claudine, l’occludina e la molecola di adesione giunzionale (JAM). Le proteine di giunzione strette in combinazione con le proteine di giunzione aderenti (cadherine, catenine) formano complessi giunzionali delle cellule epiteliali . La giunzione del gap si trova basale alla giunzione aderente.

4. Proteine a giunzione stretta e tumorigenesi

È stata stabilita una forte associazione tra proteine a giunzione stretta e sviluppo del cancro. Alterazioni nella struttura e nella funzione delle giunzioni strette sono state infatti riportate negli adenocarcinomi di vari organi . Un’assenza di giunzioni strette o giunzioni strette difettose è stata anche associata allo sviluppo del fenotipo neoplastico nelle cellule epiteliali . Tali osservazioni sono coerenti con l’idea accettata che la rottura di giunzioni strette porta alla perdita di coesione, invasività e mancanza di differenziazione, promuovendo così la tumorigenesi. Attualmente, la maggior parte delle conoscenze sul ruolo delle proteine giunzionali nel cancro, e più specificamente il cancro al seno, è derivata da studi sulla principale proteina di giunzione aderente, E caderina (per la revisione vedi ). Il downregulation di E cadherin è creduto per essere un evento molecolare importante durante la transizione epiteliale-mesenchymal . In contrasto con E cadherin, il ruolo delle proteine a giunzione stretta non è ben compreso nel cancro al seno.

4.1. Le Claudine

Le claudine sono il componente principale della giunzione stretta, e 24 membri di questa famiglia di proteine sono stati identificati fino ad oggi . Sono piccole proteine di dimensioni variabili da 22 a 27 kD e sono codificate da almeno 17 geni umani (Tabella 2), situati su 12 cromosomi diversi . La distribuzione dei loci per i geni claudin tra tanti cromosomi diversi è interessante in quanto generalmente molte famiglie di geni hanno la maggior parte, se non tutti i loro membri situati su un cromosoma . L’ampia distribuzione può riflettere le caratteristiche multifunzionali di queste proteine. Tre cluster di geni claudin sono facilmente evidenti sul cromosoma 3 (3q28), 4 (4q35.1) e 7 (7q11.23) ed è molto probabile che i membri all’interno di questi cluster possano avere funzioni e specificità tissutali simili . A parte questi tre cluster di geni claudin, non sembra esserci nessun altro schema ovvio (Tabella 2). È possibile che l’espansione della famiglia genica claudina negli esseri umani possa aver permesso l’acquisizione di nuove funzioni durante l’evoluzione, come postulato per questa famiglia genica nei pesci teleostei . Le claudine condividono una topologia transmembrana comune; si prevede che ogni membro della famiglia possieda quattro domini transmembrana con ammino intracellulare e carbossile-termini nel citoplasma e due anelli extracellulari . Il modello di espressione delle proteine claudin è tessuto specifico ; tuttavia, la maggior parte dei tessuti esprimono claudine multiple che possono interagire in modo omotipico o eterotipico per formare il filo di giunzione stretto . L’esatta combinazione delle proteine di claudina all’interno di un dato tessuto determina la selettività, la forza e la tenuta della giunzione stretta .

Ad oggi, solo pochi studi hanno affrontato il ruolo delle claudine nel cancro al seno e le scoperte sulla loro funzione rimangono controverse . In parecchi cancri, compreso cancro al seno, l’espressione alterata della proteina di alcuni membri della famiglia di claudin è stata dimostrata (per la revisione vedi ). Ad esempio, l’espressione proteica di claudina 3 e 4 ha dimostrato di essere sovraregolata nel carcinoma mammario invasivo mentre, anche nel carcinoma mammario invasivo, l’espressione delle proteine claudina 1 e 7 è stata ridotta .

4.2. Claudin 1

Gli esperimenti sui topi Knockout hanno stabilito che la proteina a giunzione stretta claudin 1, e non l’occludina, forma la spina dorsale del filo a giunzione stretta ed è cruciale per la funzione di barriera epidermica . L’espressione di claudin 1 è stata esaminata in un certo numero di tumori (per la revisione vedere ). È stato dimostrato che sia un aumento che una diminuzione dell’espressione della proteina claudina 1 sono associati alla tumorigenesi. In alcuni tumori, tra cui la prostata , la mammella e la neoplasia melanocitica , la perdita di claudina 1 è stata associata alla progressione e all’invasione del cancro e all’acquisizione del fenotipo metastatico. Nel carcinoma a cellule squamose esofagee è diminuita l’espressione di claudina 1 correlata con recidiva e più breve sopravvivenza libera da malattia, mentre nel cancro del polmone, claudina 1 è stato dimostrato di sopprimere l’espressione di invasione/metastasi enhancers e aumentare l’espressione di invasione del cancro/metastasi soppressori, fornendo così prove a sostegno di suggerire che funziona come un cancro invasione/metastasi soppressore . Al contrario, in altri tumori, come il carcinoma a cellule squamose orali della tiroide papillare, l’ovaio , il colon , il melanoma e lo stomaco , la sovraespressione di claudina 1 è stata associata all’aggressività e all’aumento del fenotipo maligno. Inoltre, studi funzionali hanno dimostrato che claudina 1 potrebbe reclutare e promuovere l’attivazione della metalloproteinasi MMP-2 e portare a un fenotipo più aggressivo nel cancro orale e ovarico.

5. Claudina 1 nel carcinoma mammario normale e nel carcinoma mammario

Nella ghiandola mammaria normale, le proteine a giunzione stretta sono state studiate principalmente in relazione alla lattogenesi . Il lavoro precedente del nostro laboratorio ha identificato la claudina 1 come un gene altamente sovraregolato durante l’involuzione precoce della ghiandola mammaria, e la sua espressione è risultata essere strettamente regolata durante le diverse fasi del normale sviluppo della ghiandola del topo . Recentemente, c’è stato un interesse aumentato nel ruolo potenziale di claudin 1 in cancro al seno. Sebbene gli studi siano ancora relativamente limitati, ci sono alcuni rapporti critici che dimostrano una chiara associazione tra l’espressione di claudin 1 e la progressione del cancro al seno. La maggior parte degli studi indica una downregulation o una perdita completa dell’espressione di claudin 1 nei cancri al seno umani invasivi maligni e in alcune linee cellulari umane del cancro al seno . Recentemente è stata riportata anche una correlazione tra la regolazione di claudin 1 down e la recidiva della malattia . Inoltre, studi funzionali suggeriscono anche che claudin 1 può essere un attore chiave nella tumorigenesi mammaria. È stato dimostrato che una regolazione verso il basso dell’espressione genica di claudina 1 porta alla trasformazione neoplastica delle cellule epiteliali della mammella . Pure, la ri-espressione di claudin 1 da solo è stata indicata per essere sufficiente indurre l’apoptosi in una linea cellulare umana del cancro al seno . È stato anche suggerito che la claudina 1 da sola potrebbe essere sufficiente per esercitare una funzione di gate mediata dalla giunzione stretta nelle cellule tumorali metastatiche anche in assenza di altre proteine associate alla giunzione stretta . Inoltre, la localizzazione subcellulare di claudina 1 ha dimostrato (da noi e da altri ) di essere interrotta nel cancro al seno invasivo che porta a una rilevazione di questa proteina nel citoplasma. È interessante notare che è stata recentemente stabilita un’associazione tra claudina 1 e transizione mesenchimale epiteliale. Come con E cadherin i fattori di trascrizione, lumaca e lumaca, marcatori chiave della transizione mesenchimale epiteliale, hanno dimostrato di legarsi al promotore claudin 1 con conseguente repressione della sua attivazione .

Il lavoro aggiuntivo del nostro laboratorio ha anche fornito prove per dimostrare che l’espressione di claudin 1 nel cancro al seno è ancora più complessa di quanto si pensasse in origine. Utilizzando le strategie di microarray tissutale, abbiamo dimostrato che in una coorte di tumori al seno invasivi umani che presentano lesioni patologiche miste (340 biopsie, le più grandi esaminate fino ad oggi), solo una piccola percentuale di tumori esprime la proteina claudina 1. La frequenza dei tumori positivi di claudin 1 era significativamente inferiore alla frequenza dei tumori osservati come positivi per claudin 3 e 4, due membri della famiglia precedentemente dimostrati sovraespressi nel carcinoma mammario umano invasivo .

Poiché lo stato ER è spesso considerato un importante classificatore dei tumori al seno (Tabella 1), abbiamo voluto determinare se vi fosse alcuna associazione tra estrogeno/recettore degli estrogeni e claudina 1. Abbiamo dimostrato che nei tumori al seno ERve (189 biopsie), un numero significativamente ridotto di tumori (5%) era positivo per l’espressione di claudina 1, mentre nei tumori ERve (151 biopsie), la frequenza di colorazione tumorale positiva per claudina 1 era significativamente più alta (39%) . Un’associazione positiva è stata trovata anche con EGFR, un marker di prognosi infausta. Sorprendentemente, è stata trovata anche una correlazione significativa con claudin 1 e marcatori del sottotipo basale-simile dei tumori al seno, un sottotipo aggressivo di cancro al seno associato alla prognosi peggiore e alla ridotta sopravvivenza del paziente. Abbiamo anche dimostrato per la prima volta che nel recettore degli estrogeni positivo (ERve) linea cellulare umana, MCF7, che claudin 1 espressione era giù regolata da estrogeni in vitro (dati inediti).

6. Claudin 1 è molto più di un soppressore del tumore nella tumorigenesi del seno?

Sia una sovraespressione che una sottoespressione di claudina 1 sono state osservate in diversi tipi di tumori , delineando la complessità del suo potenziale ruolo nella carcinogenesi. Nel cancro al seno, la maggior parte degli studi pubblicati fino ad oggi, sebbene in numero limitato, mostra che la perdita parziale o totale dell’espressione di claudin 1 è correlata con un aumento del potenziale maligno e dell’invasività e con la ricorrenza della malattia . Inoltre, la ri-espressione di claudina 1 nelle cellule di cancro al seno è stata dimostrata per indurre apoptosi . Inoltre, i nostri studi di microarray tissutale hanno dimostrato che una frequenza significativamente bassa di tumori al seno invasivi umani era positiva per l’espressione di claudin 1 . Complessivamente, questi studi forniscono prove a supporto per suggerire che claudin 1 funzioni come soppressore del tumore nella tumorigenesi del seno.

Paradossalmente, il nostro laboratorio ha anche fornito prove che suggeriscono che il ruolo di claudin 1 nel cancro al seno può essere molto più di un soppressore del tumore. Abbiamo dimostrato nei nostri studi TMA che la frequenza dei tumori positivi a claudina 1 era significativamente più alta nei tumori al seno ERve rispetto ai tumori al seno ERve . A nostra conoscenza questi studi sono il primo rapporto per affrontare l’espressione di claudin 1 nel cancro al seno nel contesto dello stato di ER. Abbiamo inoltre dimostrato che la positività di claudin 1 (così come claudin 4) era significativamente associata al sottotipo basale dei tumori al seno, uno dei sottotipi più aggressivi . Da notare, in un recente studio di Kulka et al., 2008, è stato dimostrato che l’espressione di claudin 4 era significativamente più alta nel sottotipo basale-simile di cancri al seno . Poiché claudin 1 è generalmente considerato un “soppressore del tumore” nel cancro al seno, le nostre osservazioni sono state inaspettate. Come si possono razionalizzare tali osservazioni? Ci sono alcuni possibili scenari che possono spiegare questi risultati. Innanzitutto, è plausibile che durante la tumorigenesi, non tutte le cellule tumorali perdano l’espressione di claudina 1. In linea con il modello non lineare proposto di sottotipi di cancro al seno, è possibile che le cellule che mantengono l’espressione di claudina 1 siano le cellule già predeterminate per diventare tumori al seno ERve basali. Quindi, in queste cellule, il ruolo di claudin 1 può essere quello di un promotore tumorale piuttosto che di un soppressore tumorale. D’altra parte , se si considera il modello lineare dei sottotipi di cancro al seno, si ritiene che le cellule tumorali progrediscano da ERve a ERve man mano che il cancro avanza. Quindi, l’aumento della frequenza dei tumori positivi di claudina 1 nella coorte ERve è attribuito a una ri-espressione di claudina 1 in questi tumori? Tale concetto è supportato dall’espressione significativamente più alta della colorazione claudina 1 (un indicatore dell’espressione proteica) che è stata osservata nei tumori ERve. Qui, la funzione soppressore del tumore della claudina 1 ri-espressa viene quindi eliminata e ora sostituita da una funzione di miglioramento del tumore, facilitando così la tumorigenesi del seno. Questa ri-espressione di claudina 1 potrebbe essere attribuita a una serie di fattori attenuanti, tra cui la mutazione genetica nel gene claudina 1 o la modificazione epigenetica della proteina. Tuttavia, gli studi di analisi di sequenza della regione codificante di claudina 1 in pazienti mammari sporadici ed ereditari non sono riusciti a identificare alcuna mutazione significativa che potrebbe essere responsabile dell’alterazione dell’espressione genica di claudina 1 nei tumori mammari. Una possibilità interessante è che il livello più alto della proteina di claudina 1 potrebbe essere dovuto ad un partner interagente difettoso con conseguente incapacità di claudina 1 di essere trasportato indietro alla membrana dove può sfuggire più in basso regolazione da altri fattori, e quindi portando ad un accumulo di claudina 1 nel citoplasma. Quest’ultimo è stato recentemente dimostrato per E cadherin . Inoltre, si pensa che l’esatta combinazione di proteine di claudina all’interno di un dato tessuto determini la forza della giunzione stretta . Pertanto, una delle conseguenze di questo aberrante accumulo di claudina 1 nei tumori al seno invasivi ERve può essere una ridefinizione della composizione della giunzione stretta, minando ulteriormente l’integrità della giunzione e quindi facilitando ulteriormente la progressione del tumore. Presi insieme, sembra che il ruolo di claudin 1 si estende oltre quello di un soppressore del tumore. Vorremmo proporre che claudin 1 funzioni sia come soppressore del tumore che come potenziatore/facilitatore del tumore nel cancro al seno. Proponiamo inoltre che il suo ruolo di facilitazione del tumore sia particolarmente associato ai sottotipi di cancro al seno ERve (Figura 3).

Figura 3

Un modello ipotetico di claudin 1 espressione in diversi sottotipi di cancro al seno. Questo modello propone che claudin 1 sia un soppressore del tumore nei sottotipi ER+ve del cancro al seno (luminal A e B) e un potenziatore/facilitatore del tumore nei sottotipi erâ € ™ ve (basal-like, Her2 over expressing, normal-like). Considerando che è stata dimostrata un’associazione significativa tra claudin 1 e il sottotipo basale, questo deve ancora essere determinato per l’Her2 over expressing e i sottotipi normali.

Recentemente, è stato identificato un sottotipo” claudin low ” di cancro al seno che era principalmente ERve e mostrava una bassa espressione di claudin 3, 4 e 7 . Vorremmo inoltre proporre un sottotipo “claudin high” che è ER-ve e che presenta un’alta espressione della proteina claudin 1 (e claudin 4). Questo sottotipo includerebbe i tumori al seno basali ed escluderebbe i sottotipi luminali ERve. Il significato clinico di un’elevata espressione della proteina claudina 1 nei tumori al seno ERve e la sua associazione con il sottotipo basale può identificare il suo potenziale uso come indicatore diagnostico e prognostico per un particolare sottoinsieme di cancro al seno.

7. Prospettive future

L’evidenza crescente suggerisce che claudin 1 ha un ruolo unico nel cancro al seno e nella progressione del cancro al seno. Poiché claudin 1 è una proteina transmembrana con due grandi cicli extracellulari, è un candidato potenzialmente attraente per uso nelle strategie terapeutiche. Mentre iniziamo ad affrontare il ruolo di claudin 1 nella progressione del cancro al seno, ci rimangono molte domande senza risposta. Qual è il livello di espressione della proteina claudina 1 in diversi sottotipi istologici del cancro al seno? Cosa innesca la sua regolazione e fa sì che claudin 1 cambi il suo ruolo nelle diverse fasi della progressione del cancro al seno? Perché claudin 1 si accumula nel citoplasma? C’è una mutazione nel gene claudin o nella proteina nel sottotipo basale del cancro al seno? Claudin 1 funziona in concerto con altre claudine o proteine giunzionali come E caderina? C’è un cross-talk con la via del recettore degli estrogeni? Chiaramente, studi di analisi funzionale più dettagliati sono giustificati sia in vitro che in vivo.

Si può solo prevedere che più sottotipi di cancro al seno saranno identificati nel prossimo futuro e una comprensione più chiara dei cambiamenti cellulari e molecolari che si verificano durante la tumorigenesi al seno sarà fondamentale per facilitare una gestione più efficace del paziente e influire direttamente sulla riduzione dei tassi di mortalità. Solo attraverso tale comprensione saranno identificati nuovi biomarcatori che riferiranno sui cambiamenti metastatici, sulla progressione del cancro al seno e fungeranno da obiettivi terapeutici che porteranno alla gestione specifica e individualizzata del paziente.

Riconoscimento

Gli autori riconoscono con gratitudine i finanziamenti per questo lavoro forniti dalla Manitoba Medical Services Foundation, dalla Paul Thorlakson Foundation e dalla Canadian Breast Cancer Foundation.