Y kromoszóma mikrodeléció egy apában és négy terméketlen Fiában

absztrakt

az Yq Mikrodeléciói azoospermiával és súlyos oligozoospermiával társulnak. Általában a delécióval rendelkező férfiak terméketlenek, ezért a deléciókat nem továbbítják a fiaknak, kivéve, ha in vitro megtermékenyítést (IVF) és intracitoplazmatikus spermium injekciót (ICSI) végeznek. Egy szokatlan családról számolunk be, amelyet több meddőséggel és YQ mikrodeletióval rendelkező tag jellemez. Az érintett családtagoktól teljes reprodukciós anamnézist, spermaelemzéseket és vérmintákat vettek. A DNS-előkészítést és a mennyiségi meghatározást kereskedelmi készletek felhasználásával végeztük. Összesen 27 pár szekvenciával címkézett helyek alapú alapozó készlet, amely az Y mikrodeletion régió lókuszaira jellemző volt a szűréshez. Ezután az azoospermiában (Daz) és riboszomális kötő motívum (RBM) cDNS-ekben deletált déli blot-okat elemeztünk megerősítés céljából. A probandot, három testvérét és apját mind törölték a DAZ számára, de az RBM-et nem. Az elemzés idején a proband apja azoospermikus volt, míg négy fia súlyosan oligozoospermikus vagy azoospermikus volt. Apjukkal ellentétben a négy fiú terméketlen és nincs utódja, kivéve az egyiket, aki csak IVF/ICSI meddőségi kezelés után ért el lányt. A DAZ gént érintő YQ mikrodeléciói változó fenotípusos expresszióval társulnak, amely nyilvánvalóan magában foglalhatja a normális termékenységet.

Bevezetés

a meddőség a párok ~14% – ában fordul elő (Mosher, 1985), és a férfi partner rendellenességei becslések szerint az esetek legfeljebb felében fordulnak elő (Swerdloff et al., 1985). Az azoospermia okainak értékelésére irányuló erőfeszítések azt mutatták, hogy a hagyományosan felismerhető okok kizárása után (azaz abnormális kariotípus, obstrukció, varicocoele, hormonális hiba stb.), a legtöbb eset (50-75%) megmagyarázhatatlan és idiopátiásnak nevezik (Pryor et al., 1997). A közelmúltban arról számoltak be, hogy az `idiopátiás’ azoospermiában szenvedő férfiak legfeljebb 30% – A rendelkezik az Y kromoszóma mikrodeletióival (Henegariu et al., 1993; Ma et al., 1993; Nagafuchi et al., 1993; Kobayashi et al., 1994; Najmabadi et al., 1996; Reijo et al., 1996; Vogt et al., 1996; Pryor et al., 1997). Az, hogy ezek a mikrodeléciók pontosan hogyan és hogyan okozzák az azoo/oligozoospermiát, mind intenzív vizsgálat, mind vita tárgyát képezi.

elengedhetetlen ahhoz az érvhez, hogy az Y mikrodeléciók meddőséget okoznak, az a megfigyelés, hogy a termékeny férfiak ritkán nyilvánulnak meg Y mikrodeléciók. A vizsgált 200 termékeny férfi közül négyben jelentettek mikrodeletiókat (Pryor et al., 1997). Azonban a deléciók ezekben az emberekben nagyon kicsik voltak, és valószínűleg jelentéktelen polimorfizmust jelentettek. Normál termékenységű férfiaknál nem jelentettek viszonylag nagy, a férfi meddőséghez hasonló deléciókat. Bár általában feltételezik, hogy ezek a deléciók de novo merülnek fel, és hogy az Y mikrodeletió apa-fia átvitele nem várható, néhány ritka esetről számoltak be az Y kromoszóma mikrodeletió apáról egy fiúra történő átviteléről (Kobayashi et al., 1994; Stuppia et al., 1996; Vogt et al., 1996; Pryor et al., 1997). Az azoospermia (DAZ) lókuszban törölt mikrodeletió vertikális átviteléről azonban csak három esetben számoltak be (Kobayashi et al., 1994; Vogt et al., 1996; Pryor et al., 1997). Most egy négygenerációs családot írunk le, amelyben egy azoospermiás apa és négy terméketlen fia egy látszólag azonos mikrodeletionnel rendelkezik, amely magában foglalja a DAZ lokuszt. Ez a család jelenti az első és egyetlen jelentést a DAZ deléció spontán vertikális átviteléről több utódra. Bizonyítékot szolgáltat arra, hogy egyetlen Yq mikrodeletió eltérő fenotípusos expressziót eredményezhet különböző egyénekben. Klinikailag jelentős, mivel a mikrodeletió jelenléte nem abszolút marker a meddőségre, és nyilvánvalóan normális termékenységgel társítható.

anyagok és módszerek

az Yq mikrodeletió szűrését rutinszerűen végezték a férfiak meddőségére vonatkozóan az intézményi felülvizsgálati testület által felülvizsgált és jóváhagyott protokoll alkalmazásával orvosok Főiskolája & sebészek, Columbia Egyetem. A mintákat a betegektől tájékozott beleegyezés után vették.

spermaelemzés

az eredményeket a Who kritériumai alapján Nikon fáziskontraszt mikroszkóppal elemeztük.

a Szérumhormon koncentrációját

follikulus stimuláló hormont (FSH), luteinizáló hormont (LH) és tesztoszteront szilárd fázisú, két helyen végzett kemilumineszcens enzim immunometriás vizsgálattal mértük (Immulite; Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, CA, USA). A férfiak normál tartománya az FSH <10 mIU/ml; LH < 10 mIU/ml; és a tesztoszteron 270-1070 ng/dl.

genomi DNS

a genomi DNS teljes vérből történő kivonását vörösvérsejtek lízisével, majd fehérvérsejtek és sejtmagjaik lízisével végeztük. A sejtes fehérjéket só kicsapással távolítottuk el, a genomi DNS-t pedig izopropanollal kicsaptuk Puregene DNS extrakciós készlet (Gentra Systems, Inc. Minneapolis, MN, USA; katalógus száma. D-5004).

polimeráz láncreakció (PCR)

a primereket szárított oligonukleotidok formájában állítottuk elő automatizált DNS-szintetizátoron (Perkin-Elmer Applied Biosystems Inc., Foster City, Kalifornia, USA). Összesen 27 Y kromoszóma-specifikus szekvenciával jelölt helyet (STS) (1.ábra) választottunk ki egy STS térképből (Vollrath et al., 1992). Ezek közé tartozik a három javasolt spermatogenezis loci AZFa, AZFb, és AZFc (mint egy Vogt et al., 1996) az 5-ös, 6-os és 7-es Yq-intervallumokra terjed ki. Gyors szűrési protokollként két-hat különböző primer párból álló PCR multiplex rendszert használtunk összesen hat multiplexelt reakcióban (I. táblázat). Minden PCR-vizsgálathoz egy női kontrollt és egy normál férfi kontrollt is bevontak. Az összes PCR-reakciót polikarbonát (Techne) lemezeken futtattuk egy MJ Research GmbH gépben. A PCR-körülmények lényegében a korábban leírtak voltak (Henegariu et al., 1993). Röviden, egy 14 6L össztérfogatú reakcióban 50 ng genomi DNS-t használtunk sablonként, 1 ml primer standard oldatot (I. vagy II.vagy III. vagy IV. vagy V. vagy VI. keverék, amely primerenként 10 pmol-t tartalmaz), 12 ml PCR hideg keveréket (1,5 mmol/l MgCl2, 0,2 mmol/l mindegyik dNTP-ből, 5% DMSO-t, 1 db Taq polimeráz reakciópuffert Mg2+ nélkül), 1,25 ne Taq DNS polimerázt (Promega) és 1 csepp olajat. A teljes keverékeket közvetlenül egy előmelegített termociklerbe helyeztük 94 Kb C. kerékpáros feltételek 27 ciklusok voltak: 94-30 MP (olvasztás); 55-45 MP (lágyítás); és 72-60 MP (hosszabbítás). A végső hosszabbítási idő 5 perc volt. A PCR reakciótermékeket ezután 3% agaróz gélen (Bio-Rad, ultra-tiszta minőségű) szétválasztottuk elektroforézissel TBE pufferben. A PCR termékeket etidium-bromiddal festettük, és ultraibolya fény hatására láthatóvá tettük. A multiplex reakciókban amplifikációt nem mutató STS-t egyetlen reakció PCR-rel igazolták, megfelelő pozitív és negatív kontrollokkal. Az STS-t három amplifikációs hiba után hiányzónak tekintették.

Déli hibridizáció

a déli blotolást a megállapított protokoll szerint végeztük (Sambrook et al., 1989). Röviden, 5 6G genomiális DNS-t HindIII-vel vagy TaqI-val emésztettünk, 0,7% – os agaróz gélen futtattuk standard TBE pufferben, átvittük egy nejlon membránra, és 32P-vel jelölt próbákkal hibridizáltuk. A DAZ szonda egy teljes hosszúságú cDNS-t tartalmazó plazmid (pDP1577) tisztított betétje volt (Reijo et al., 1995). Hasonlóképpen, az RBM szonda egy RBM cDNS klón plazmid betétje volt (MK5) (Ma et al., 1993).

apasági meghatározás

mind a négy fiú apaságát négy erősen polimorf autoszomális marker várható szegregációjának bemutatásával igazolták (Weber és May, 1989). Ezek a következők voltak: d21s156, D21S270, D13S132 és D13S159, 0,83, 0,86, 0,84 és 0,90 heterozigózissal.

fluoreszcens in-situ hibridizáció (FISH)

a DAZ-t a Cosmid 63c9-vel végeztük (Saxena et al., 1996), bevett módszerekkel (Yu et al., 1996).

eredmények

a proband (egyéni III 8 ábra 2) és házastársa (III-9) bemutatták a reproduktív-endokrinológia-meddőség Klinika Columbia-Presbiteriánus Orvosi Központ panaszával az elsődleges meddőség 3 évig. A vizsgálatok normális kariotípust és normális szérumhormonszintet mutattak, míg az ondó analízise súlyos oligozoospermiát mutatott (II.táblázat). Az STS-alapú PCR-rel végzett mikrodeletió-szűrés mikrodeletió jelenlétét tárta fel az Y kromoszóma hosszú karjának 6D–6f alintervallumában (1.ábra). A beszélgetés során a proband arról számolt be, hogy két idősebb testvére (III-4 és III-6) ismert volt azoospermikus és terméketlen. Az ezt követő munka során kiderült, hogy mindhárom testvérnek látszólag azonos mikrodeletiója volt. Az egyiken végzett herebiopszia (III-6) csak Sertoli-sejt szindrómát mutatott ki.

a mikrodeléció megállapítása három terméketlen testvérnél azt sugallta, hogy apjuk valószínűleg ugyanazt a deléciót hordozza. Részletes tanulmányt készítettek a család többi tagjáról, akik mind a Dominikai Köztársaság kisvárosában laktak. A felnőtt családtagoktól teljes reproduktív kórtörténetet váltottak ki. A törzskönyvben (2.ábra) ábrázolt családi kapcsolatokat több autoszomális polimorf markernek (adatok nem szerepelnek) az érintett családtagokra (I-1, I-2, II-1, II-8 és II-1, II-2, III-1, III-4, III-6, III-8, III-10) várható szegregációja igazolta. Nem volt bizonyíték az apaság hiányára. Az érintett családtagokon (I-1, II-1, II-6, II-8, II-10, III-1, III-4, III-6, III-8, III-14, III-15, III-17, III-19 és IV-1) végzett alapos citogenetikai vizsgálatok normális kariotípusokat tártak fel. A 16 férfi közül hétben végeztek spermaelemzést, és a legtöbb családtagtól vérmintát vettek.

a II.táblázat az érintett családtagokon végzett spermaelemzés és endokrin vizsgálatok eredményeit foglalja össze. A proband (III-8), apja (II-1) és három testvére közül kettő (III-4, III-6) azoospermikusak vagy súlyosan oligozoospermikusak voltak. A proband legidősebb testvére (III-1) elutasította a sperma elemzését. Ezen túlmenően, a proband nagybátyja (II-8) azt találták, hogy azoospermia és emelkedett FSH alacsony tesztoszteron. Amint az 1. ábrán látható, a proband, apja és három testvére STS PCR analízissel mind YQ mikrodeléciót mutattak ki. A DAZ (3.ábra) és az RBM (adat nem látható) próbákkal végzett déli blotolás megerősítette, hogy a deléció magában foglalta a DAZ lokuszt, de nem az RNS-kötő motívum (RBM) lokuszt. HALELEMZÉS a DAZ Cosmid 63c9 – vel (Saxena et al., 1996) a proband apja (II-1) leukocitái a DAZ lokusz egységes hiányát mutatták (4.ábra).

meglepetés volt az a megállapítás, hogy a törzskönyvben szereplő II-8 egyén azoospermikus volt, de nem volt mikrodeletiója. A DAZ lokuszt ebben az egyénben további Déli analízissel tesztelték a DAZ cDNS és egy másik restrikciós enzim (TaqI) felhasználásával. Nem mutatott semmilyen rendellenességet a DAZ lokuszban. Ezenkívül a DAZ Cosmid 63c9-es halak normál intenzitást mutattak (az adatok nem jelennek meg).

a proband (III-8) és bátyja (III-6) meddőségi kezelésre szorultak. Kiterjedt tanácsadás után az in vitro megtermékenyítés (IVF) és az intracitoplazmatikus spermium injekció (ICSI) mellett döntöttek. A proband (III-8) és felesége (III-9) két IVF-ICSI cikluson esett át, amelyek nem eredményeztek terhességet a rossz petefészek válasz miatt. A proband testvére (III-6) és felesége (III-7) egy kontrollált ovárium hiperstimulációs cikluson esett át, és kilenc petesejtet nyertek ki. Tizenegy Érett spermatozoidot találtak három ejakulátumban a visszakeresés napján, és az ICSI-hez használták. Három megtermékenyített petesejt, amelyek később hasadtak és átkerültek. Egészséges női babát szült (IV-2).

Vita

egy kivételes családról számolunk be, amelyben egy azoospermiás apa és négy terméketlen fia látszólag azonos YQ mikrodeletionnel rendelkezik, amely magában foglalja a DAZ lokuszt. Úgy tűnik, hogy a De-novo mutáció, amely a DAZ mikrodeléciójához vezetett, a proband apjától származik (II-1). Ez a deléció várhatóan azoo/oligozoospermiát és férfi meddőséget okoz, mégis spontán öt gyermeket fogant, és nem tudott semmilyen termékenységi problémáról. Érdekes módon azonban mind a négy fiú terméketlen, vagy azoospermikus, vagy súlyosan oligozoospermikus.

ez a család számos kérdést vet fel az Yq mikrodeletion és a meddőség közötti összefüggéssel kapcsolatban. Először is megerősíti, hogy az Yq mikrodeletion vertikális átvitele lehetséges, ami a hím utódok későbbi meddőségéhez vezethet. Másodszor, nyilvánvaló, hogy ugyanaz a deléció különböző fenotípusokat eredményezhet különböző egyénekben. Bár ebben a családban a négy fiú apja (II-1) azoospermikus volt az elemzés idején, első gyermekét 25 éves korában, az utolsót pedig 38 éves korában szülte. Így bizonyos fokú termékenységgel rendelkezett hosszú évek alatt. Hasonlóképpen, az Y kromoszóma, különösen a DAZ mikrodeléciója nem feltétlenül jelenti az azoospermia egész életen át tartó történetét, és nem zárja ki a nagy család kialakulását sem. Négy fia viszont terméketlen, vagy azoospermikus, vagy súlyosan oligozoospermikus.

a DAZ gént javasolták az azoospermia faktornak az Y kromoszómán. Ez a család egyértelműen megmutatja, hogy bár a DAZ kritikus szerepet játszhat a spermatogenezisben, a termékenység szempontjából nem elengedhetetlen. Ezenkívül a DAZ géncsoport teljes elvesztése összefüggésbe hozható a csak Sertoli sejt szövettani képével, valamint a spermiumok érésének leállításával (Foresta et al., 1997; Pryor et al., 1997). Számos szerző gyenge korrelációt talált az Y mikrodeléciók elhelyezkedése (beleértve a DAZ deléciókat is) és a betegek klinikai és szövettani fenotípusa között (Reijo et al., 1995, 1996; Vogt et al.; 1996; Silber et al., 1998). A család megállapításai egyetértenek abban, hogy egy ilyen összefüggés meglehetősen problematikusnak bizonyulhat. A proband testvérének (III-6) herebiopsziája csak a Sertoli-sejt képét mutatta, míg a proband (III-8 spermaszám 0,5 ^ 106/ml) egyértelműen várhatóan bizonyos fokú spermium érést mutat a biopszián. Ezenkívül a herebiopszia nem biztos, hogy reprezentatív a teljes herére, mert földrajzi heterogenitás lehet a spermatogenezis szempontjából, mint az egyes III-6-ban, amelynek ejakulátumai Érett spermatozoidokat tartalmaztak.

csak az azonos törléssel rendelkező családtagok közötti fenotípusos különbségek alapjáról tudunk spekulálni. Köztudott, hogy az autoszómákon belüli azonos deléciók különböző fenotípusokat eredményezhetnek (Schinzel, 1994). Feltételezhetjük, hogy az ilyen különbségek az egyes egyének környezetének való kitettségének vagy a különféle módosító gének expressziójának következményei. A termékeny apát egy mikrodeletióval írták le, amely kiszélesedett, amikor terméketlen fiának továbbították (Stuppia et al., 1996). Bár a deléció határán változó kiterjesztések létezhetnek különböző családtagjaink között, ezeket a molekuláris kiterjesztéseket nem lehet megkülönböztetni intervallum leképezéssel. PCR analízissel ugyanezek az STSs-ek nem tudtak amplifikálni öt egyedünkben, és a déli hibridizáció a DAZ szondával megerősítette ennek a géncsoportnak a teljes delécióját. Bár lehetséges, hogy a megfigyelt deléciók valójában nem azonosak, és a szomszédos területek fontos géneket tartalmazhatnak, amelyek modulálják a fenotípusos expresszió mértékét, ezek az eredmények még mindig a törölt Y DNS nagy átfedését jelzik (beleértve a DAZ génfürt elvesztését is) ezen Egyedülálló család minden egyes egyedében.

lenyűgözött minket az a tény, hogy a proband nagybátyja (II-8) meddőségben és azoospermiában szenved, de az STS vizsgálat nem mutatott nyilvánvaló mikrodeletiót. Mivel a southern blot analízis mind az RBM, mind a DAZ szondák, valamint a DAZ cosmid alkalmazásával végzett FISH analízisek teljesen normálisak voltak, kénytelenek vagyunk arra a következtetésre jutni, hogy meddőségének más etiológiája van. Igaz, lehetséges, hogy kisebb vagy pontmutációja/perturbációja vagy proximális/disztális átrendeződése lehet, amely a jelenlegi módszerekkel nem kimutatható. Nem adott kórtörténetben gonadotoxinoknak vagy más meghatározható tényezőknek való kitettséget, amelyek valószínűleg befolyásolják a spermatogenezist.

a közelmúltig az Y mikrodeletiónak kevés klinikai jelentősége volt, mivel a delécióval rendelkező ember általában nem fog szaporodni. Azonban az ICSI és a here Sperma aspiráció (TESA) felhasználásával, IVF-vel kombinálva, az oligo/azoospermikus férfiak számára Y mikrodeletió terhesség elérése (Mulhall et al., 1997; Silber et al., 1998, III-6. egyéni). Ez aggodalmat keltett azzal kapcsolatban, hogy az ilyen terhességek hím utódokat hozhatnak létre hasonló mikrodeléciókkal és az azt követő meddőséggel (Reijo et al., 1996; Girardi et al., 1997; Kremer et al., 1997). Valójában az Yq mikrodeletió ICSI-n keresztül továbbítható a hím utódoknak (Kent-First et al., 1996). Az általunk jelentett család azt sugallja, hogy az Yq mikrodelécióval rendelkező férfiak (például II-1 egyén), akik terhességet érnek el, ugyanazt a mikrodeléciót és a meddőség kockázatát továbbítják fiaiknak (III-1, III-4, III-6, III-8 egyének). Ezért a betegeknek az ICSI előtt Y mikrodeletion szűrővizsgálatot kell felajánlani, és tanácsot kell adni nekik az Yq mikrodeletió és esetleg meddőség fiaikra történő átvitelének bizonyosságáról. Mivel több kutatás a férfi meddőség genetikai etiológiájára összpontosít, a spermatogenezisben részt vevő gének azonosításának betekintést kell nyújtania a férfi meddőség patofiziológiájába és ésszerűbb alapot kell nyújtania a terápia megkezdéséhez.

köszönjük a családoknak a tanulmányban való együttműködésüket; Dr. David C. Page a DAZ cDNS szonda biztosításáért és felbecsülhetetlen segítségéért ezzel a kézirattal; Dr Kun Ma az MK5 (RBM1) cDNS szonda biztosításáért; Dr. Peter Vogt az STS PCR módszertanunk validálásához használt YQ mikrodeletelt egyének DNS-éért; és C. C. Yu és Patricia Lanzano felbecsülhetetlen technikai segítségükért.

ezt a tanulmányt részben a Columbia Presbyterian Medical Center klinikai vizsgálatok irodája house Staff Awards finanszírozta.