1.4.1 homogenizáló közeg
a Sejtzavart általában enyhén hipo-ozmotikus vagy izo-ozmotikus közegben hajtják végre a morfológiai integritás megőrzése érdekében. A szacharózt általában ozmotikus anyagként használják, hogy megakadályozzák a szubcelluláris organellákat vagy vezikulákat a káros duzzanattól vagy zsugorodástól. Mannitot és szorbitot is alkalmaztak, amikor a szacharózról kimutatták, hogy zavarja a szubcelluláris komponens biokémiai elemzését. A szacharóz előnyös a sóoldatokkal szemben, mivel az utóbbiak hajlamosak a szubcelluláris organellák aggregálására. A hipo-ozmotikus közegeket gyakran használják a plazmamembrán frakciók izolálására, mert ilyen körülmények között a megszakadt sejtek plazmamembránokat hoznak létre nagy szellemek vagy lapok formájában. Ez jelentősen csökkenti ezeknek a fragmenseknek a nagyfokú variációját a centrifugálás előtt. Bár a homogenizáló közeg általában vizes jellegű, nem vizes közegeket, például étert/kloroformot alkalmaztak a szubcelluláris organellák izolálására. A nem vizes közegek azonban inaktiválhatnak bizonyos enzimeket, és csökkenthetik egyes szövetek morfológiai integritását.
kelátképző szereket (EDTA vagy EGTA) adhatunk a homogenizáló közeghez a kétértékű kationok, például az Mg2+ vagy Ca2+ eltávolítására, amelyekre a membránproteázok szükségesek. Fontos megjegyezni, hogy a táptalajba továbbra is proteázgátlókat kell beépíteni, mivel az EDTA és a tiol reagensek aktiválhatnak néhány proteolitikus enzimet. Azonban sok membrán marker enzimnek szüksége van ezekre a kationokra az aktivitáshoz, és gátolhatók, miután a kationokat eltávolították az extraktumból. Az Mg2 + vagy Ca2+ hozzáadása a homogenizáló közeghez fenntartja a nukleáris integritást. Ezek az ionok azonban membrán aggregációt okozhatnak és csökkenthetik a légzésszabályozást a mitokondriumokban.
a növényi szövetek Sejtzavarai gyakran fenolokat szabadítanak fel, amelyek számos káros hatással lehetnek a növényi enzimekre. A növényi fenolos vegyületek alapvetően két csoportot tartalmaznak: fenilpropanoid vegyületek (például hidrolizálható tanninok) és a flavonoidok (például kondenzált tanninok). A fenolok hidrogénkötést végezhetnek a fehérjék peptidkötéseivel, vagy fenol-oxidázzal oxidálódhatnak kinonokká. A kinonok erős oxidálószerek, amelyek szintén hajlamosak polimerizálni és kondenzálni a reaktív fehérjecsoportokkal, hogy sötét pigmentet képezzenek, amelyet melaninnak neveznek, amely a növényi szövetek barnulásának alapját képezi. A melanin fehérjékhez való kötődése számos enzimet inaktiválhat. A fenolos hidroxilcsoportok Ionos kölcsönhatásokat képezhetnek a fehérjék bázikus aminosavaival, vagy hidrofób módon kölcsönhatásba léphetnek a fehérjék hidrofób régióival. Ezért fontos, hogy a fenolos vegyületeket a lehető leggyorsabban eltávolítsuk, és ezt legjobban a fenolokhoz vagy kinonokhoz kötődő adszorbensek, vagy a fenol-oxidáz aktivitást gátló védőanyagok, például borát, germanát, szulfitok és merkaptobenzotiazol alkalmazásával lehet elérni. A fenol-adszorbens, a polivinil-pirrolidon vízben oldható formában vagy erősen térhálósított oldhatatlan termékként ‘Poliklár’ adható az izoláló közeghez. A polivinil-pirrolidon megköti azokat a fenolos vegyületeket, amelyek erős hidrogénkötéseket képeznek a fehérjékkel. A szarvasmarha szérumalbuminról azt is beszámolták, hogy reagál a növényi fenolokkal, és szintén hatékony kinongyűjtő.
a membránproteázok aktivitásának csökkentése érdekében a sejt-vagy szövetfrakcionálást mindig +4CC-n végezzük. A proteázok endopeptidázokra és exopeptidázokra oszthatók. Az endopeptidázok, amelyek a belső peptidkötéseket hasító enzimek, a következők: savas proteázok, amelyek pH–értéke 2,5-3,8 pH, és az átmeneti állapot inhibitor pepsztatin gátolhatja őket; szerin proteázok, amelyeket a diizopropilfluor-foszfát és a fenilmetil-szulfonilfluorid gátolhat; és szulfhidrilproteázok, amelyeket az N-etil-maleimid vagy az E-64 gátol (l-transz-epoxiszukcinil-leucilamid-bután). Az exopeptidázok közé tartoznak a legtöbb növényi szövetben jelen lévő karboxipeptidázok, amelyek a legtöbb C-terminális aminosavat könnyen hidrolizálják. Az összes eddig vizsgált növényi karboxipeptidázt gátolja a diizopropilfluor-foszfát. Aminopeptidázokat, dipeptidázokat és tripeptidázokat is azonosítottak növényekben. A homogenizáló közegben alkalmazott egyéb vegyületek közé tartoznak a diszulfid-redukálószerek, például a 2-merkaptoetanol, a ditiotreitol, a ditioeritritol, a redukált glutation vagy a cisztein. Ennek oka az, hogy sok enzim tartalmaz egy esszenciális aktív hely szulfhidrilcsoportot, amelynek csökkentnek kell maradnia az enzimaktivitás fenntartása érdekében. Az organelle izolálásának számos problémája a törékeny membránok, például a vakuolát körülvevő tonoplaszt szakadásához kapcsolódik. Ezen membránok fizikai megsemmisítésén kívül a növényi szövetek aktív lipolitikus enzimeket tartalmaznak, amelyek közvetlenül megtámadhatják a membránok lipidkomponenseit és megzavarhatják az organellákat. Az acil-hidrolázok hidrolitikus hatására felszabaduló szabad zsírsavak gátolhatják a mitokondriumok, a kloroplaszt és a plazmamembrán ATPáz aktivitását. A zsírsavak egyéb káros hatásai szintén jól megalapozottak. Vannak bizonyos feltételek, amelyek csökkenthetik a lipidek lebontását a lipázok és a lipolitikus Acil-hidrolázok által a növényekben. Ezek közé tartozik az (1) izolációs közeg használata, amelynek pH-ja 7.5-8, amelynél a legtöbb lipolitikus enzim és lipooxigenáz kevés aktivitást mutat, (2) kelátképző szerek, mint például az EDTA, mivel sok foszfolipáz Ca2+-függő; sok lipolitikus enzimet azonban nem befolyásolnak a kelátképző szerek és (3) egyéb adalékanyagok, például antioxidánsok, amelyek megakadályozzák a zsírsav-hidroperoxidok, diszulfid redukáló szerek, specifikus enzimgátlók oxidatív lebontását, valamint a zsírsav-mentes szarvasmarha szérumalbumin alkalmazását, amely megköti a szabad zsírsavakat. Minden egyes homogenizáló közeg különböző, és tartalmazhat specifikus enzim inhibitorokat, például foszfolipázokat vagy foszfatázokat. Például glicerint gyakran adnak az izoláló közeghez a foszfatidsav-foszfatáz gátlása érdekében.
a növényi sejtek frakcionálására szolgáló homogenizáló közeg pufferkapacitásának magasnak kell lennie ahhoz, hogy ellensúlyozza a szerves savak felszabadulását a megzavart vakuolából, amely a sejt jelentős térfogatát képezi. A homogenizáló közeg megfogalmazható empirikus értékeléssel vagy racionális elemzéssel. Például annak biztosítása érdekében, hogy a megfelelő tisztított fehérje sértetlen maradjon, a proteázok összes fő inhibitorát hozzáadhatjuk a homogenizáló közeghez, vagy alternatív módon fiziológiai oldatokat másolhatunk. Mivel a növényi sejt citoplazmatikus pH–ja 7,5-8,0 körül van, a homogenizáló közegnek tükröznie kell a sejt fiziológiai állapotát, ezért gyengén pufferelt a citoplazmatikus pH-hoz.