ebben a videóban megfigyelheti, hogyan kell elvégezni a króm felszabadulási vizsgálatot és meghatározni az effektor sejtek citotoxikus potenciálját.
az immunsejtek felelősek a potenciálisan káros sejtek, például a rák vagy a vírussal fertőzött sejtek azonosításáért és eltávolításáért a szervezetből, ami az immunválasz szerves része. Számos immunsejt, mint például a T-sejtek és az NK sejtek, rendelkeznek citotoxikus potenciálként ismert tulajdonsággal, amely képes azonosítani a célsejteket és olyan fehérjéket szekretálni, amelyek a célsejtek lebomlását, lízisét és halálát indukálják. A citotoxikus potenciál számszerűsítése kritikus fontosságú az immunsejtek aktivációjának és hatékonyságának méréséhez, és erre a célra általában a króm felszabadulási vizsgálatot használják.
ez a módszer lehetővé teszi a felhasználók számára, hogy összehasonlítsák az immunsejtek bizonyos típusai által kiváltott citoxicitást különböző körülmények között, ami értékes a rákos immunterápia és az immunitással kapcsolatos betegségek tanulmányozásához. Először a célsejteket, mint a rákos sejteket, egy radioaktív izotóppal, a króm 51-gyel inkubáljuk, amelyet a sejtek felvesznek. Ezután ezeket a rádióval jelölt sejteket együtt tenyésztjük az érdekes izolált immunsejtekkel, más néven effektor sejtekkel, egy kerek fenekű, 96 lyukú lemezen, hogy megkönnyítsék a két sejttípus közötti kölcsönhatást.
a vizsgálat átfogó beállítása magában foglalja egy meghatározott számú célsejt inkubálását az immunsejtek különböző koncentrációival, a megfelelő kontrollokkal együtt. Az együttkultúra lehetővé teszi az effektor sejtek számára, hogy apoptózist és lízist indukáljanak a célsejtekben, ami az intracelluláris króm 51 felszabadulását eredményezi a felülúszóban. Ezután egy előre optimalizált időpontban a felszabadult krómot tartalmazó felülúszót az összes kútból betakarítják. A króm 51, mivel radioaktív, spontán radioaktív bomláson megy keresztül, hogy gamma-sugárzást bocsásson ki. A vizsgálati lemez összes kútjából származó felülúszók gamma-sugárzási szintje a célsejtek lízisének számszerűsíthető kimenetét képviseli. Ezt gamma-számlálóval mérjük, amelyet azután az immunsejtek citotoxikus potenciáljának meghatározására használunk.
először a célsejteket, ebben a példában a wm793 humán melanoma sejtvonalat egyetlen sejtszuszpenzióvá állítjuk elő. Ehhez először távolítsa el a táptalajt a szövettenyésztő lombikból, majd mossa le a sejteket öt milliliter 1X PBS-vel. Dekantáljuk a PBS-t, majd adjunk hozzá egy milliliter tripszint a lemezhez körülbelül két percig. Óvatosan érintse meg a lombikot, hogy meglazítsa a sejteket a lombik felületéről, majd adjon hozzá öt milliliter RPMI táptalajt a lombikba. Pipettázzuk fel és le a táptalajt, hogy összegyűjtsük a sejteket, és adjuk hozzá ezt a szuszpenziót egy 15 ml-es kúpos csőhöz.
helyezze a csövet a centrifugába öt percre 1200 fordulat / perc sebességgel. Ezután távolítsa el a közeget a csőből, ügyelve arra, hogy ne zavarja meg a sejtpelletet. Óvatosan rázza meg a cső alját, hogy megzavarja a sejtpelletet, majd adjon hozzá 10 ml közeget a csőhöz. Ezután óvatosan pipettázzuk fel-le a táptalajt, hogy a sejtek szuszpenzióba kerüljenek. Ezután meghatározzuk a sejtkoncentrációt egy hemocitométerrel,és az eredeti sejtszuszpenzió két milliliterét egy új, 15 milliliter kúpos csőbe helyezzük. Helyezze a csövet egy centrifugába, és öt percig 12 száz fordulat / perc sebességgel pelletálja a cellákat. Centrifugálás után öntsük a felesleges közeget a csőből egy hulladéktartályba. Röviden vortex a csövet, hogy reszuszpendálja a sejtpelletet a hátrahagyott kis mennyiségű közegben.
ezután készítse elő a króm 51 használatát egy erre a radioaktivitásra szánt laboratóriumi helyre költözve. A króm 51 biztonságos tárolásához és használatához minden lépés során elegendő ólomárnyékolásnak kell lennie, valamint megfelelő jelzésekkel kell jelezni, hogy hol tárolják a króm 51 mintákat. A palacsintaszondával felszerelt Geiger-számlálóra szintén szükség van a térben való esetleges szennyeződés érdekében.
miután felállították a radioaktivitás megfelelő felhasználására, adjunk hozzá 100 mikrocurium 51 krómot közvetlenül a célcellás szuszpenzióhoz. Ezután adjunk hozzá egy kis darab radioaktív szalagot a csőhöz, jelezve, hogy a minta és a cső most radioaktív. Helyezze a csövet egy ólomvédővel ellátott 37 celsius fokos inkubátorba, majd inkubálja egy órán keresztül, 15-20 percenként pöccintve a csövet.
amíg a célsejtek címkéznek, készítsen elő egy cellás szuszpenziót az effektor sejtekből. Ebben a példában humán perifériás vér mono nukleáris sejteket vagy Pdmc-ket izoláltunk a teljes vérből standard sűrűséggradiens centrifugálással 5-ször 10-től 6-ig terjedő koncentrációra. Vigye át ezt az effektorcellás szuszpenziót egy eldobható reagenstartályba, majd adjon hozzá 200 mikrolitert ebből a szuszpenzióból a B sor minden kútjába egy 96 lyukú, kerek fenéklemezen. Ezután adjunk hozzá 100 mikroliter RPMI-t a lemez c-g sorának minden egyes lyukához.
most kezdje el a Pbmc-k soros hígítását, hogy az effektor sejtszámok tartománya legyen, először eltávolítva 100 mikrolitert a B sorban lévő kutakból, majd hozzáadva ezt a C sorhoz.ezután tovább hígítsa az effektor cellákat 100 mikroliter sejt átvitelével a C sorból a D sorba. folytassa a Soros hígítást. Miután elérte a G Sort, mozgassa a 100 mikrolitert a kutakból, hogy a sor minden kútjában 100 mikroliter végső térfogat maradjon. Ezután adjunk hozzá 100 mikroliter szövettenyésztő táptalajt az a sorban lévő kutakhoz, hogy kontrollként szolgáljunk az 51 króm spontán felszabadulásához a célsejtekből, mivel ehhez a sorhoz nem szabad effektor sejteket adni. Ezután helyezzen egy lemezt egy 37 celsius fokos inkubátorba, amíg a célsejtek készen állnak a hozzáadásra.
az inkubációs periódus után távolítsa el a célsejteket az inkubátorból, és mossa le 5 ml FBS-vel a felesleges króm 51 eltávolításához. Ezután helyezze a csövet egy kijelölt centrifugába, és forgassa 1200 fordulat / perc sebességgel 5 percig. Távolítsa el a radioaktív FBS mosást egy megfelelő hulladéktartályba, és ismételje meg a mosási lépést úgy, hogy a pelletet friss 5 ml FBS-be reszuszpendálja. Helyezze a csövet egy kijelölt centrifugába, és forgassa újra a cellákat 1200 fordulat / perc sebességgel 5 percig. Távolítsa el a második mosást, és ellenőrizze a pelletet a beépített radioaktivitás szempontjából egy Geiger-számláló segítségével. Végül Reszuszpendáljuk a pelletet 10 milliliter teljes közegben, majd öntsük a króm 51 címkével ellátott célcellás szuszpenziót egy eldobható reagenstartályba. Ezután adjunk hozzá 100 mikrolitert ezekből a jelölt célsejtekből a 96 kút effektor sejtlemez minden kútjához. Ezután adjunk hozzá 100 mikrolitert 1% NP-40 vízben a H sorban lévő kutakhoz, hogy az összes célsejtet ebben a sorban lizáljuk. Ezeket a kutakat kontrollként használják a percenkénti teljes szám vagy cpm meghatározására.
most, hogy a lemez elkészült, rögzítse a fedelet egy kis darab szalag hozzáadásával a lemez mindkét oldalára, és helyezzen egy darab radioaktív szalagot a fedélre, jelezve, hogy króm 51-et tartalmaz. Ezután helyezze a lemezt a radioaktív minták kezelésére megjelölt centrifugába. Ha csak egy kísérleti lemezt használ, adjon hozzá egy mérleglemezt a centrifugához. Állítsa a centrifugát 1200 fordulat / percre, és állítsa a lemezt sebességre. A sebesség elérése után állítsa le a gépet. Távolítsa el a lemezt a centrifugából. Ezután helyezze a lemezt egy 37 celsius fokos inkubátorba, egy kis darab ólomárnyékkal a lemez felett a további biztonság érdekében. Inkubáljuk 16 órán át, hogy a célsejtek lizálódjanak.
az inkubációs időszak végén óvatosan távolítsa el a szalagot a lemez szélén, és távolítsa el a fedelet. Ezután helyezze a betakarító keretet a tányérra, ügyelve arra, hogy a kis szűrőkorongok a helyükön legyenek az egyes pamutdugókhoz. Most lassan és óvatosan nyomja be a pamut dugókat a kutakba. Körülbelül tíz másodperc múlva engedje el a nyomást a pamutdugókra, majd helyezze át a pamutdugókat csőcsíkokra. Helyezze ezeket a csöveket egy másodlagos FACS csőbe. Végül töltsük fel a FACS csöveket egy gamma számlálóra, és futtassuk le a mintákat, hogy az egyes körülmények között felszabaduló króm 51 mennyiségét számszerűsítsük. Óvatosan jegyezze fel a csövek betöltésének sorrendjét a számlálóba.
itt stimulálatlan Pbmc-ket adtak az első 3 sávhoz, a CPG stimulált Pmbc-ket pedig a 4-6 sávokhoz. Ebben a példában a percenkénti számlálást ugyanúgy bevittük egy táblázat celláiba, mint a mintákat az eredeti táblán, és kiszámítottuk a triplikátumok átlagát. Például az első feltétel esetében az A1, A2 és A3 cellákat átlagolták az I3 cellában. Az átlagok meghatározása után az egyes feltételekre vonatkozó specifikus lízis százaléka kiszámítható ezzel a képlettel. Például a stimulálatlan sejtek százalékos specifikus lízisének kiszámításához, amelyek aránya 50: 1 effektorsejt volt a célsejtekhez, a spontán CPM-et, amely ebben a példában 1164,67, kivontuk a kísérleti CPM-ből, 1129. 67. Ezt a számot ezután el lehet osztani a maximális CPM és a spontán CPM közötti különbséggel, majd megszorozni 100-mal, hogy megkapjuk a százalékos specifikus lízist. Ezt minden feltételre kiszámítják. Ezeket az adatokat ezután ábrázolhatjuk, hogy bemutassuk az E-T Arány összehasonlítását a százalékos specifikus lízissel mind a stimulálatlan Pbmc-k, mind a CPG-stimulált Pbmc-k esetében. Ebben a példában a CPG-vel stimulált effektor sejtek hatékonyabban ölték meg a célsejteket, mivel az effektor sejtek aránya a célsejtekhez nőtt. Ez a növekedés nem volt megfigyelhető a nem stimulált Pbmc-kben, ami azt jelzi, hogy a CPG stimuláció szükséges a célsejt lízis megfigyelt növekedéséhez.