Pillanatkép: kromoszóma konformáció Capture | Anne Marie

a szervezet a genom a nukleáris térben nem véletlen, és befolyásolja a genom funkciók, beleértve a transzkripció, replikáció, és javítás. Az azonos vagy különböző kromoszómákból származó specifikus genomi régiók gyakran fizikailag társulnak egymással és a nukleáris struktúrákkal, ami bonyolultan kompartmentált magot eredményez. A genom kölcsönhatásokra példa egy fokozó társulása egy promóterrel vagy gének, például rDNS gének csoportosítása a nukleolusban. A genom kölcsönhatásait hagyományosan fluoreszcencia in situ hibridizációval (FISH) vizsgálták, amely lehetővé teszi a különálló gének vagy genomrégiók közötti térbeli kapcsolat vizualizálását. Ennek a módszernek az a korlátai, hogy csak ismert kölcsönhatásokat lehet kihallgatni, csak nagyon kevés lókuszt lehet kipróbálni egy kísérletben, a felbontás pedig a mikroszkóp optikájára korlátozódik.

a kromoszóma konformáció rögzítési technikák családja biokémiai megközelítések halmaza a genom régiók fizikai kölcsönhatásának meghatározására. A C-technológiai megközelítések mindig öt lépést foglalnak magukban: (1) formaldehid rögzítés a kromatin térhálósításához a fizikai kölcsönhatás helyén, (2) a kromatin hasítása restrikciós enzimmel vagy szonikációval, (3) híg körülmények között történő ligálás, amely elősegíti az ugyanazon komplexen rögzített DNS-végek közötti ligálást a véletlenszerű ütközésekből származó ligációk felett, (4) a ligációs csomópontok kimutatása változó molekuláris biológiai lépésekkel a módszerek változatától függően, és (5) számítási elemzés a térhálósított kromatin ligálásában rögzített interakciós frekvenciák meghatározására.

a C-technológiák (3C, 4c, 5c, Hi-C) detektálási módjukban és a vizsgálható kölcsönhatások terjedelmében különböznek egymástól. A 3C módszer a genom két ismert helye közötti kölcsönhatást teszteli, 4C lehetővé teszi egy ismert csali szekvencia ismeretlen kölcsönhatóinak vizsgálatát, 5C azonosítja az adott Genom doménen belüli interakció összes régióját, a Hi-C pedig elfogulatlan módon vizsgálja az összes előforduló interakciót Genom-szerte. További változatok (ChIA-PET, ChIP-Loop) tartalmaznak egy fehérje kicsapódási lépést, lehetővé téve a genom kölcsönhatások azonosítását, amelyek egy adott érdekes fehérjét tartalmaznak. A módszer megválasztása nagymértékben függ a biológiai kérdés sajátos jellegétől és hatókörétől, de az erőforrások rendelkezésre állásától is, beleértve a kiindulási anyag mennyiségét és a szekvenálási kapacitást. A standard C-technikák számos származékát fejlesztették ki, gyakran a megválaszolt konkrét biológiai kérdés ihlette, vagy a specifitás javítása vagy a háttér csökkentése céljából.

a C-technológiák populációalapú módszerek. Relatív érintkezési valószínűségeket hoznak létre, nem pedig abszolút érintkezési frekvenciákat. A populációalapú természet annak a ténynek köszönhető, hogy minden genomi lokusz egy páronként ligációs csomópontot ad egy sejtben. A kontaktprofilok nagy lefedettségének és mennyiségi értékelésének lehetővé tétele érdekében minden kísérletben több ezer-millió Genom ekvivalenst (sejtet) kell bevonni és kombinálni. A C kontaktusok és a DNS halak közötti összefüggések azt mutatták, hogy a populáció sejtjeinek 3-5% – ában előforduló interkromoszomális asszociáció általában pozitívnak bizonyul a legtöbb C módszerben. A gyakoribb asszociációk általában erősebb jeleket eredményeznek; azonban a jel erőssége a fizikai kölcsönhatások affinitását is tükrözheti, nem pedig a frekvenciáját.

az adatelemzés kritikus lépése annak meghatározása, hogy egy ligációs csomópontként detektált interakció specifikus-e. Az érintkezési frekvencia exponenciálisan csökken, és fordítottan kapcsolódik a lineáris genomiális távolsághoz néhány Mb-ig a referenciaponttól. Ezért egy adott érintkezés gyakorisága a lókusz közelében várhatóan magasabb lesz, mint a véletlenszerű ütközések háttere. Az Mb tartományon kívüli specifitás jó mutatója egy adott interakció észlelése a szomszédos restrikciós fragmensek jelcsoportjaiként.

a C módszerek felbontását az alkalmazott restrikciós enzim(ek) jellege, valamint a kimutatáshoz szekvenálást alkalmazó módszerek esetében a szekvenálási leolvasások száma határozza meg. A négy bázispár (bp) endonukleáz felismerési szekvenciáinak gyakorisága elvileg tizenhatszor nagyobb, mint egy hat bp vágó felismerési szekvenciájának gyakorisága. A négy bp vágó használata várhatóan növeli az Mb tartományban lévő érintkezők felbontását, ahol több lekötési eseményt rögzítenek az egyes érintkezők és a háttér ütközések számára. Ezen a tartományon túl azonban, ahol a korlátozási töredékek klaszterei meghatározzák az érintkezési régiókat a tíz-száz kb tartományban, a négy bp vágó használatának előnye várhatóan csökken. Bár sok genomszintű vizsgálat dedikált mikroarray-ket használt, a nagy áteresztőképességű szekvenálás válik a választott módszerré a ligációs csomópontok globális kimutatására. A szekvenálási mélység technikai akadálya a felbontásnak bizonyos megközelítésekben, mint például a Hi-C és a ChIA-PET. A PCR-alapú technológiák leküzdik ezt a korlátozást azáltal, hogy felerősítik a kapcsolatok egy részhalmazát, a csökkentett lefedettség kompromisszumával. A ligációs termékek páros jellege két kapcsolatot teremt a felbontás növekedése és a szükséges szekvenálási mélység növekedése között. A szekvenálási mélységenkénti genomi lefedettség a vizsgált Genom méretétől is függ. Például a hasonló szekvenálási teljesítmény tíz kb érintkezési felbontást biztosít élesztőben, de csak Mb felbontást biztosít az emberi genomban.

Vélemény, hozzászólás?

Az e-mail-címet nem tesszük közzé.