eddig a plazmidok 101 sorozatunkban végigdolgoztuk a plazmid térképet: antibiotikum-rezisztencia, replikáció eredete stb. Addig a pontig replikálhatjuk plazmidunkat, és biztosíthatjuk, hogy a sejtek fenntartsák; a következő lépés az, hogy a plazmid kifejezze az érdeklődő génünket. Írja be a promótert-azt az elemet, amely felelős az insert RNS-be történő transzkripciójának megindításáért.
a gyakorlatban a “promoter” kifejezés a promoter (RNS polimeráz kötőhelye) és az operátorok (válaszelemek) kombinációját írja le. A promoterek körülbelül 100-1000 bázispár hosszúak, és a célgénjeik előtt találhatók. A promoter régió szekvenciája szabályozza az RNS polimeráz és transzkripciós faktorok kötődését, ezért a promoterek nagy szerepet játszanak annak meghatározásában, hogy hol és mikor jelenik meg az érdeklődő gén.
az RNS-polimeráz(ok)
az RNS-t RNS-polimeráz (RNAP) alkalmazásával írják át a DNS-ből. A baktériumokban ezt egyetlen enzim végzi; az eukariótáknak azonban vannak muliple polimerázok amelyek mindegyike felelős az RNS-ek egy meghatározott részhalmazáért. Ennek a specificitásnak az elérése érdekében az eukarióta RNAP képes felismerni és kötődni bizonyos promoter elemekhez. Ez azt jelenti, hogy a plazmid gerincében jelen lévő promóternek kompatibilisnek kell lennie az elkészítendő RNS típusával: ha mRNS-t szeretne (génexpresszióhoz), akkor rnap II promótert kell használnia, míg a kis RNS-eket (például shRNS-t) átírják az RNAP III promoterekből. Ez a bejegyzés az Általános RNAP II és az RNAP III transzkripció promótereit tartalmazza; azonban a vírusos LTR-eket RNAP II promoterként általában a lentivirális és retrovirális konstrukciókban alkalmazzák, és ezeket a vírusvektor-részekről szóló jövőbeli bejegyzésben tárgyaljuk.
Promoter specificitás
eltekintve attól, hogy az RNS-átirat típusa alapján válasszon promótert, meg kell győződnie arról is, hogy plazmidjának van-e olyan promótere, amely alkalmas a gazdaszervezetben való működésre. Mivel a transzkripciós gépek sejttípusok vagy organizmusok között különböznek, a promótereknek hasonlóan változónak kell lenniük. A bakteriális promoterek csak a prokarióta sejtekben működnek, és általában csak ugyanabban vagy szorosan rokon fajokban, amelyekből származnak. Hasonlóképpen, a különböző eukarióta sejttípusok (Emlősök, élesztő, növények stb.) Egyedi promotereket igényelnek, és nagyon kevés a keresztezés. Általánosságban elmondható, hogy a baktériumok promóterei kevésbé változatosak és összetettek, kevesebb részük van, mint az eukarióta sejtekben. Egyes promóterek konstitutív módon aktívak és folyamatosan működnek, míg mások alaposabban ellenőrzöttek. A szabályozott promóterek csak bizonyos szövetekben vagy a fejlődés bizonyos időpontjaiban működhetnek, vagy lehetnek módok arra, hogy vegyi anyaggal, hővel vagy fénnyel tetszés szerint be-vagy kikapcsolják őket. A sejtben magukat a promótereket még más szabályozó tényezők vezérlik: erősítők, határelemek, szigetelők és hangtompítók; azonban előfordulhat a transzkripció bizonyos “szivárgása”. Ez általában nem jelent nagy problémát a sejtek számára, de megzavarhatja a kutatási eredményeket, vagy akár meg is ölheti a sejteket, ha az érdeklődő gén mérgező. Ennek leküzdésére a tudósok szintetikus promótereket hoztak létre, amelyek jellemzően más promoter elemek valamilyen kombinációját tartalmazzák, és általában szigorúbban szabályozottak.
közös promoterek az eukarióták és prokarióták számára
az alábbiakban két referenciatáblázatot mutatunk be, amelyek felsorolják a leggyakoribb bakteriális és emlős promotereket. Ezek a listák korántsem kimerítő, de jó kiindulópontnak kell lennie, amikor megpróbálja kiválasztani a tökéletes promóterét!
eukarióta promóterek
| Promoter | elsődlegesen | RNS transzkriptum | leírás | kifejezés | További szempontok |
| CMV | általános kifejezés | mRNS | erős emlős expresszió promoter a humán citomegalovírus | konstitutív | tartalmazhat egy fokozó régiót. Bizonyos sejttípusokban el lehet némítani. |
| EF1a | általános kifejezés | mRNS | erős emlős expresszió az emberi nyúlási faktorból 1 alfa | konstitutív | a sejttípustól vagy fiziológiától függetlenül következetes expressziót ad. |
| SV40 | általános kifejezés | mRNS | emlős expresszió promoter a simian vakuoláló vírusból 40 | konstitutív | tartalmazhat egy erősítőt. |
| PGK1 (humán vagy egér) | általános kifejezés | mRNS | Foszfoglicerát-kináz génből származó emlős promoter. | konstitutív | széles körben elterjedt kifejezés, de sejttípusonként változhat. Hajlamos ellenállni promoter le szabályozás miatt metilezés vagy dezacetilezés. |
| Ubc | általános kifejezés | mRNS | emlős promoter az emberi ubiquitin C génből | konstitutív | ahogy a neve is mutatja, ez a promoter mindenütt jelen van. |
| humán béta-aktin | általános kifejezés | mRNS | emlős promoter a béta-aktin génből | konstitutív | mindenütt jelen van. A csirke változatot általában a promóter hibridekben használják. |
| Cag | általános kifejezés | mRNS | erős hibrid emlős promoter | konstitutív | CMV-erősítőt, csirke béta aktin promótert és nyúl béta-globin splice akceptort tartalmaz. |
| TRE | általános kifejezés | mRNS | tetraciklin válaszelem promoter | Tetracilinnel vagy származékaival indukálható. A | jellemzően minimális promoter-t tartalmaz, alacsony bazális aktivitással és több tetraciklin-kezelővel. A transzkripció be-vagy kikapcsolható attól függően, hogy milyen tet transactivator-t használnak. |
| UAS | általános kifejezés | mRNS | Drosophila promoter a Gal4 kötőhelyeket összekötő | specifikus | a promoter aktiválásához Gal4 gén jelenléte szükséges. |
| Ac5 | általános kifejezés | mRNS | a Drosophila aktin 5c génből származó erős rovar promoter | konstitutív | a Drosophila expressziós rendszereiben általánosan használt. |
| Polihedrin | általános kifejezés | mRNS | erős rovar promoter származó baculovirus | konstitutív | általánosan használt expressziós rendszerek rovar sejtek. |
| CaMKIIa | optogenetikai génexpresszió | mRNS | Ca2+/kalmodulin-függő protein-kináz II promoter | specifikus | neuronális/központi idegrendszeri expresszióhoz használatos. Kalcium és kalmodulin modulálja. |
| GAL1, 10 | általános kifejezés | mRNS | élesztő szomszédos, divergensen átírt promoterek | galaktózzal indukálható; glükózzal elnyomható | önállóan vagy együtt használható. A GAL4 és a GAL 80 szabályozza. |
| TEF1 | általános kifejezés | mRNS | élesztő transzkripciós nyúlási faktor promoter | konstitutív | analóg emlős EF1a promoter. |
| GDS | általános kifejezés | mRNS | erős élesztő expressziós promoter glicerinaldehid 3-foszfát-dehidrogenázból | konstitutív | nagyon erős, más néven TDH3 vagy GAPDH. |
| ADH1 | általános kifejezés | mRNS | élesztő promoter alkohol-dehidrogenáz I | etanollal elnyomott | Teljes hosszúságú változat erős, nagy expresszióval. A csonka promóterek konstitutívak, alacsonyabb kifejezéssel. |
| CaMV35S | általános kifejezés | mRNS | erős növényi promoter a karfiol Mozaikvírusból | konstitutív | aktív kétszikűekben, kevésbé aktív egyszikűekben, némi aktivitással az állati sejtekben. |
| Ubi | általános kifejezés | mRNS | növényi promoter a kukorica ubiquitin génből | konstitutív | nagy expressziót ad a növényekben. |
| H1 | kis RNS expresszió | shRNS | a humán polimeráz III RNS promoter | konstitutív | lehet valamivel kisebb expresszió, mint U6. Lehet, hogy jobban expresszálódik az idegsejtekben. |
| U6 | kis RNS expresszió | shRNS | az emberi U6 kis nukleáris promoterből | konstitutív | egér U6-ot is használnak, de lehet, hogy kevésbé hatékony. |
prokarióta promóterek
| Promoter | elsődlegesen | leíráshoz | kifejezés | További szempontok |
| T7 | in vitro transzkripció/ általános expresszió | Promoter a T7 bakteriofágból | konstitutív, de T7 RNS polimerázt igényel. | ha in vitro transzkripcióra használják, a promoter vagy az érzékelést, vagy az antiszensz transzkriptumot hajtja, attól függően, hogy a génjéhez orientálódik-e. |
| T7lac | magas szintű génexpresszió | Promoter a T7 bakteriofágból plusz lac operátorok | elhanyagolható bazális expresszió, ha nem indukálják. T7 RNS polimerázt igényel, amelyet a lac operátor is vezérel. IPTG-vel lehet indukálni. | gyakran megtalálható a pET vektorokban. A lac üzemeltetői nagyon szigorúan szabályozzák. Jó a génexpresszió modulálására változatos induktorkoncentrációk révén. |
| Sp6 | in vitro transzkripció/ általános expresszió | Promoter az Sp6 bakteriofágból | konstitutív, de SP6 RNS polimerázt igényel. | az SP6 polimeráz nagy folyamattal rendelkezik. Ha in vitro transzkripcióra használják, a promoter vagy az érzékelést, vagy az antiszensz transzkriptumot hajtja, attól függően, hogy a génjéhez orientálódik-e. |
| araBAD | általános kifejezés | az arabinóz metabolikus operon Promoterje | arabinóz és elnyomott katabolit elnyomás által indukálható glükóz jelenlétében vagy az anti-induktor fukóz kompetitív kötődésével | gyengébb. Általában megtalálható a pBAD vektorokban. Jó a gyors szabályozáshoz és az alacsony bazális expresszióhoz; azonban nem alkalmas a génexpresszió modulálására változatos induktor koncentrációk révén. |
| trp | magas szintű génexpresszió | Promoter az E. coli triptofán operon | elnyomható | magas celluláris triptofánszint mellett kikapcsol. |
| lac | általános kifejezés | Promoter a lac operonból | konstitutív a Lac represszor (lacI vagy lacIq) hiányában. Iptg vagy laktóz indukálhatja. | szivárgó promoter kissé gyenge kifejezéssel. a lacIq mutáció növeli a 10x represszor expresszióját, ezáltal szigorítva a Lac promoter szabályozását. Jó a génexpresszió modulálására változatos induktorkoncentrációk révén. |
| Ptac | általános kifejezés | hibrid promoter lac és trp | szabályozott, mint a lac promoter | tartalmaz -35 régió trpB és -10 régió lac. Nagyon szigorú szabályozás. Jó a génexpresszió modulálására változatos induktorkoncentrációk révén. Általában jobb kifejezés, mint a lac önmagában. |
| pL | magas szintű génexpresszió | Promoter származó bakteriofág lambda | lehet hőmérséklet szabályozható | gyakran párosítva a hőmérséklet-érzékeny cI857 represszor. |
| T3 | in vitro transzkripció / általános expresszió | Promoter a T3 bakteriofágból | konstitutív, de T3 RNS polimerázt igényel | amikor in vitro transzkripcióhoz használják, a promoter vagy az érzékelést, vagy az antiszensz transzkriptumot hajtja végre, attól függően, hogy a génre irányul-e |
bár ez a lista remek kiindulópont, a fenti táblázatok nem mélyülnek el a tudósok rendelkezésére álló szövet-vagy fejlődésspecifikus promóterekben. A plazmidokat gyakran terápiás célokra használják, és ezekben az esetekben fontos a megfelelő szövetspecifikus promoterek azonosítása, amint azt az NIH kutatói itt leírták.
Megjegyzés: A. Max Juchheim hozzájárult a cikk megírásához.